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        精氨酸酶-1在肝細胞癌中的低表達及其臨床意義

        2014-12-06 06:25:12顧春燕肖鋒錢錚邵建國秦剛陳莉
        中國癌癥雜志 2014年6期
        關(guān)鍵詞:精氨酸南通分化

        顧春燕 肖鋒 錢錚 邵建國 秦剛 陳莉

        1.南通大學附屬南通第三醫(yī)院病理科,江蘇 南通 226006;

        2.南通大學附屬南通第三醫(yī)院消化內(nèi)科,江蘇 南通 226006;

        3.南通大學附屬南通第三醫(yī)院傳染科,江蘇 南通 226006;

        4.南通大學醫(yī)學院病理學教研室,江蘇 南通 226001

        肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,而我國HCC的發(fā)病率明顯高于世界平均水平。深入研究HCC患者蛋白質(zhì)譜的變化對揭示其發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和致病機制具有重要意義。精氨酸酶(arginase,Arg)是肝臟鳥氨酸循環(huán)中的一個催化酶,Arg有兩個同工酶,分別為Arg-1和Arg-2。Arg-1在肝臟中有較高的活性,也稱為“肝型Arg”[1-2]。本研究應用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(reverse transcriptase-polymerase chain reaction,RT-PCR)、蛋白印跡法(Western blot)和免疫組織化學技術(shù)檢測Arg-1在HCC及癌旁肝組織中的表達情況,探討其與HCC臨床病理學特征間的關(guān)系,以進一步認識其臨床意義。

        1 資料和方法

        1.1 臨床資料

        選取南通大學附屬南通第三醫(yī)院2005年1月—2011年12月經(jīng)手術(shù)切除的HCC患者158例;均經(jīng)患者知情同意,并通過醫(yī)院倫理委員會批準。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或生物等治療,手術(shù)標本診斷均經(jīng)病理檢查證實。同時切取距腫瘤2~3 cm的癌旁肝組織。正常對照組為肝移植供體標本19例,肝血管瘤10例、肝外傷2例,共31例正常肝標本。組織常規(guī)4%甲醛溶液固定、石蠟包埋以及4 μm切片、HE染色用于組織學觀察,確定HCC分級。取上述158例HCC患者中31例的癌組織及相應癌旁肝組織新鮮標本,和10例肝血管瘤及2例肝外傷患者手術(shù)切除的正常肝組織,液氮凍存?zhèn)溆?。本組HCC病例年齡19~81歲,平均年齡52.9歲;其中男性133例,女性25例。有詳細的臨床資料,包括血清AFP水平、HBsAg檢測結(jié)果和病理檢查相關(guān)結(jié)果。術(shù)后隨訪本組HCC患者至2012年10月,158例患者中共132例成功隨訪,隨訪時間為10個月~6年,隨訪頻率1次/2~3個月,其中67例術(shù)后復發(fā),65例無復發(fā);隨訪方法采用門診復診和電話隨訪;隨訪內(nèi)容包括一般情況、AFP、肝臟B超或CT等。HCC復發(fā)的診斷標準為:B超或CT發(fā)現(xiàn)肝臟實性占位,并參考同期AFP檢測 水平。

        1.2 主要試劑

        TRIzol試劑盒購自美國Invitrogen公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RT-PCR試劑盒購自日本TaKaRa公司,Arg-1、3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)引物由美國Invitrogen公司合成,兔抗人Arg-1多克隆抗體購自Santa Cruz公司,小鼠β-actin單克隆抗體購自美國Sigma公司,辣根過氧化物酶標記二抗及免疫組化試劑盒購自丹麥Dako公司。

        1.3 方法

        1.3.1 總RNA制備及逆轉(zhuǎn)錄

        按TRIzol說明書抽提肝組織總RNA。按每50 mg組織加入1 mL TRIzol進行抽提。紫外分光光度儀測定RNA濃度并將所有樣本濃度調(diào)整為 1 μg/μL,立即進行逆轉(zhuǎn)錄反應。每個樣本取 1 μL作逆轉(zhuǎn)錄模板合成cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應條件:37 ℃ 15 min,85 ℃ 5 s。合成好的cDNA置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

        1.3.2 RT-PCR

        Arg-1上、下游引物5’-AGGGTCCACCC T G AT C T T G G A G T-3’和5’-G G A G A ATCCTGGCACATCGGGA-3’,產(chǎn)物長度 1 5 3 b p;G A P D H 上下游引物5’-C C A TTTGCAGTGGCAAAG-3’,5’-CACCC CATTTGATGTTAGTG-3’,產(chǎn)物長度202 bp,按TaKaRa試劑盒說明進行,反應條件:94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s,58 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,共30個循環(huán);72 ℃ 10 min。每個樣本設3復孔。對反應產(chǎn)物進行2%瓊脂糖凝膠電泳。取5 μL PCR 擴增產(chǎn)物加入2.5%核酸染料瓊脂糖凝膠中,以80 V/cm電壓電泳50 min,在紫外線下可見相應長度的目的基因和內(nèi)參的擴增條帶,將電泳結(jié)果直接置于凝膠分析系統(tǒng)中對條帶進行分析。

        1.3.3 Western blot分析檢測

        在新鮮HCC組織及相應癌旁肝組織和正常肝組織中加入蛋白裂解液,冰浴勻漿,4 ℃離心,12 000×g離心20 min,取上清液,測定蛋白含量。分別取蛋白樣品各40 μg,加入4×十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)上樣緩沖液,于沸水中加熱5 min,行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,電泳結(jié)束后,進行濕式電轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)移后的聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜,用含10%脫脂奶粉的三羥甲基胺基甲烷-鹽酸鹽緩沖液(trisaminomethanehydrochloric acid buffer saline and Tween,TBST)室溫包被2 h,第一抗體室溫溫育1 h后,4 ℃過夜。TBST漂洗5 min×5次,第二抗體室溫溫育2 h,TBST漂洗5 min×5次,化學發(fā)光試劑(electrochemiluminescence,ECL)發(fā)光,顯影,定影。吸光度(A)值測定用密度掃描儀(ZEISS全自動圖像分析儀)測定目的條帶及β-actin的A值,以(A×S)/(a×s) (S和s分別表示條帶的面積)定義為Arg-1的A相對值。本實驗重復3次。

        1.3.4 組織芯片的制備

        組織芯片由南通大學醫(yī)學院病理學系制作,主要步驟為:復閱所有HCC病例的HE切片,并在HE切片及原蠟塊上標記所需組織的正確部位。將萊卡石蠟與蜂蠟按照2∶1比例混合,制成3.5 cm×2.2 cm×1.0 cm大小的空白蠟塊。在該蠟塊1.8 cm×1.2 cm范圍內(nèi)設計10×8點組織列陣,用組織芯片儀打孔制成模塊。用組織芯片儀直徑1.6 mm的吸針從供體蠟塊取組織,按照預先設計的排列順序定位裝載在受體蠟塊中,并設置復點。

        1.3.5 免疫組織化學檢測及結(jié)果判定

        所有標本經(jīng)10%中性甲醛溶液固定后常規(guī)組織處理,4 μm厚連續(xù)切片,分別行HE和免疫組化染色。其中免疫組化染色參照試劑盒說明書進行。PBS 液代替一抗作陰性對照,已知陽性的組織作陽性對照。免疫組化染色結(jié)果由兩位病理科醫(yī)師在不參考臨床病理資料的情況下進行評定,實驗均設陽性和陰性對照。每例隨機觀察5個高倍視野(×400),每個高倍視野計數(shù)200個瘤細胞。綜合陽性細胞染色強度和陽性細胞所占百分比進行評分。將染色強度分為4級:無色0分,淡黃色1分,棕黃色2分,棕褐色3分;陽性細胞所占的百分比:<5% 0分,5%~25% 1分,25%~50% 2分,50%~75% 3分,>75% 4分;同時,兩者相乘再相加后取平均值,分為4個等級:陰性(-):0~1;弱陽性(+):2~4;中度陽性(++):5~8;強陽性(+++):9~12。

        1.4 統(tǒng)計學處理

        應用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù),計量資料用±s 表示,組間比較采用t檢驗。采用χ2檢驗分析免疫組織化學結(jié)果,各組之間比較采用Spearman秩相關(guān)分析,率的比較采用Fisher確切概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

        2 結(jié) 果

        2.1 Arg-1 mRNA在正常肝組織、癌旁組織及HCC組織中的表達水平

        Arg-1 mRNA在正常肝組織、癌旁組織、HCC中均有一定的表達。在正常肝組織、癌旁組織中Arg-1 mRNA表達水平較高,在HCC組織中表達較弱,且隨HCC的分化程度的降低,其表達量隨之降低(圖1)。統(tǒng)計學分析顯示,正常肝組織中Arg-1的相對表達量為1.52±0.35;癌旁肝組織中相對表達量為1.03±0.34,HCC組織中相對表達量(高、中、低分化3組的平均 值)為0.41±0.31,HCC組織中Arg-1 mRNA表達水平明顯低于正常肝組織和癌旁組織,差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。HCC組織中Arg-1 mRNA的表達水平分別為:高分化HCC組織中的相對表達量0.70±0.25,中分化HCC中的相對表達量為0.41±0.30,低分化HCC中的相對表達量為0.18±0.15,不同分化程度的HCC中Arg-1 mRNA表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

        圖1 RT-PCR分析Arg-1 mRNA在正常肝組織、癌旁組織及HCC中的表達Fig. 1 RT-PCR analysis of Arg-1 mRNA expression in normal liver tissues, paracancerous liver tissues and HCC tissues

        2.2 Arg-1蛋白在正常肝組織、癌旁組織及HCC組織中的表達水平

        Arg-1蛋白在正常肝組織、癌旁組織及HCC組織中均有表達(圖2)。Arg-1蛋白在正常肝組織中表達量為2.11±0.26;HCC組織(高、中、低分化3組的平均值)為0.61±0.31,癌旁組織為1.61±0.26。HCC組織中Arg-1蛋白表達水平明顯低于正常肝組織和癌旁組織,差異有統(tǒng)計學意義(P均<0.01)。HCC組織中Arg-1蛋白的表達水平分別為:高分化HCC為0.97±0.21;中分化HCC為0.64±0.21;低分化HCC為0.33±0.11,不同分化程度的HCC中Arg-1蛋白表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。

        圖2 Westen blot分析Arg-1蛋白在正常肝組織、癌旁組織及HCC中的表達Fig. 2 Western blot analysis of Arg-1 protein expression in normal liver tissues, paracancerous liver tissues and HCC tissues

        2.3 免疫組織化學檢測Arg-1蛋白在正常肝組織、癌旁組織及HCC組織中的表達

        運用免疫組化法進一步檢測了Arg-1蛋白在158對HCC及其癌旁組織、31例正常肝組織中的表達情況,顯示Arg-1蛋白在各組中均有表達,定位于細胞質(zhì)及部分細胞核。Arg-1在正常肝組織和癌旁肝組織中普遍表達(圖3),在HCC組織中表達低下或缺失(圖4)。Arg-1蛋白在158例HCC中弱陽性表達63例,中度陽性表達55例,強陽性表達21例,陽性表達率為88%;158例癌旁組織中弱陽性表達28例,中度陽性表達68例,強陽性表達60例,陽性表達率為98.7%;31例正常肝組織中中度陽性表達7例,強陽性表達24例,陽性表達率為100%。Arg-1蛋白在HCC組織中的表達顯著低于癌旁組織(χ2=14.7416,P<0.01)和正常肝組織(χ2=4.1415,P<0.05),癌旁組織和正常組織表達差異無統(tǒng)計學意義(χ2=0.3966,P>0.05,表1)。

        2.4 Arg-1蛋白表達與臨床病理特征的關(guān)系

        Arg-1蛋白表達水平隨HCC分化程度降低、脈管侵犯和術(shù)后復發(fā)而下降(P均<0.05)。Arg-1表達與HCC患者年齡、性別、HBsAg感染、血清AFP水平、有無肝硬化、腫瘤結(jié)節(jié)直徑、瘤結(jié)節(jié)數(shù)均無顯著相關(guān)性(表2)。

        圖3 免疫組化檢測Arg-1蛋白在正常肝、癌旁肝組織及肝癌組織中的表達Fig. 3 Expression of Arg-1 protein in normal liver tissues, paracancerous liver tissues and HCC tissues by immunochemistry(EnVision, ×100)

        圖4 HCC組織芯片中Arg-1的表達Fig. 4 Expression of Arg-1 protein in HCC tissue microarray

        表1 Arg-1蛋白在HCC組織、癌旁組織及正常肝組織中的表達Tab. 1 Expression of Arg-1 protein in HCC tissues, paracancerous liver tissues and normal liver tissues

        表2 Arg-1表達與HCC患者臨床病理因素的關(guān)系Tab. 2 Correlation of Arg-1 expression with clinicopathological features of patients with hepatocellular carcinoma(n)

        3 討 論

        Arg是一種雙核錳金屬蛋白酶,含有332個氨基酸,它是三聚體結(jié)構(gòu)。內(nèi)源性的Arg從肝中生成并釋放。研究表明人和哺乳動物體內(nèi)存在兩種形式的Arg同工酶,分別為Arg-1和Arg-2,兩者的氨基酸序列大約有60%的同源相似性,主要的區(qū)別在于各自的組織分布、亞細胞定位以及免疫反應性不同[1]。Arg-1其基因定位于6q23染色體,在肝臟中有較高的活性,也稱為“肝型Arg”,主要存在于門管區(qū)周圍的肝細胞中。它能水解L-精氨酸,生成尿素和L-鳥氨酸,除參與尿素循環(huán)外,還參與催化合成精胺和精脒等多種細胞生長必需的代謝分子,因此,Arg-1的表達改變可能會導致肝組織代謝紊亂從而引發(fā)腫瘤,對細胞代謝水平和生長狀態(tài)產(chǎn)生顯著影響。Arg-2也稱為“肝外Arg”,其基因定位于染色體14q24.1-24.3,主要在肝外組織中表達,如腦、腎、骨骼肌、小腸的線粒體,在肝臟內(nèi)也有微量的表達,它不參與尿素循環(huán),主要調(diào)控細胞內(nèi)精氨酸的濃度,從而控制生物體內(nèi)一氧化氮(nitric oxide,NO)、脯氨酸、多胺等物質(zhì)的生物合成[2-4]。

        本研究應用RT-PCR和Western blot方法,對Arg-1在HCC組織、癌旁肝組織及正常肝組織中的表達情況進行了檢測,結(jié)果顯示Arg-1在HCC組織中的表達水平均明顯低于相應癌旁肝組織及正常肝組織,這與先前的報道是一致 的[5]。提示Arg-1可能參與HCC的發(fā)生、發(fā)展,在HCC的發(fā)生、發(fā)展過程中可能起到負性調(diào)控作用。進一步研究發(fā)現(xiàn),Arg-1在HCC中的表達較正常肝組織有明顯的降低和缺失,其陽性表達率為88%,且與HCC的分化程度密切相關(guān),隨著HCC的分化程度的降低,Arg-1表達率有下降的趨勢。并且,Arg-1的表達水平與血管侵犯和術(shù)后復發(fā)有關(guān),而與HCC患者年齡、性別、HBsAg感染、血清AFP水平、有無肝硬化、腫瘤直徑、腫瘤個數(shù)均無關(guān)。這些結(jié)果提示,Arg-1可能在HCC的惡性轉(zhuǎn)化過程中有著重要作用,Arg-1表達下降或缺失可能促進HCC轉(zhuǎn)移。

        先前的研究顯示,精氨酸對于肝癌、黑色素瘤和骨肉瘤等精氨酸營養(yǎng)缺陷型惡性腫瘤細胞而言是必需氨基酸,在缺乏精氨酸的環(huán)境下,腫瘤細胞生長受到抑制[6-7],一旦體外的精氨酸缺乏,或存在精氨酸降解酶以及消耗精氨酸的培養(yǎng)基的情況下,會導致多種癌細胞迅速出現(xiàn)摧毀結(jié)構(gòu)[8-9]。在精氨酸代謝過程中,Arg-1和誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)是兩個極其關(guān)鍵的酶,精氨酸可被Arg-1催化轉(zhuǎn)變?yōu)轼B氨酸而自身耗竭掉,另外Arg-1也可代謝精氨酸,參與尿酸、多氨的合成,后者是細胞增殖的必需物質(zhì)之一。Arg-1的最終結(jié)果是抑制精氨酸向NO的衍生,Arg-1表達下降可使精氨酸蓄積,從而間接導致iNOS底物相對增多,生成NO增加,其對腫瘤生長有直接作用[10]。其機制可能包括:①NO可引起DNA鏈的斷裂,抑制DNA修復酶的修復作用[11-12];②NO可使部分抑癌基因,如p53基因產(chǎn)生不可逆的損傷,使抑癌基因失活[11-12];③NO促進Bcl-2的表達,抑制細胞凋亡而有利于生長停止的腫瘤細胞的存活[13];④NO具有促進腫瘤血管形成的作用,還介導腫瘤血管的舒張作用,維持腫瘤的血流量,使腫瘤的微血管通透性增加[14],作為內(nèi)源性血管舒張因子的NO,對血管及腫瘤微循環(huán)的確立起直接作用,同時,NO通過上調(diào)其介導的血管生成因子—血管內(nèi)皮細胞生長因子、纖維細胞生長因子的活性來促進新血管的生成[15];⑤促進腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。NO可以通過影響基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9,MMP-9)的表達而增強腫瘤的侵襲力[16]。結(jié)合本研究結(jié)果,我們考慮Arg-1在HCC的發(fā)生、發(fā)展過程中起到負性調(diào)控作用,Arg-1表達下降可能導致精氨酸在HCC中的聚集,從而促進腫瘤細胞的增殖;或者導致iNOS底物相對增多,生成NO增加,進而促進HCC復發(fā)或轉(zhuǎn)移。

        另外,還有研究表明,精氨酸是調(diào)節(jié)T細胞活化和增殖的必需氨基酸之一,細胞外的精氨酸被Arg-1水解后,T細胞CD3ζ鏈表達受到影響,進而抑制T細胞增殖,最終影響對腫瘤細胞的免疫抑制功能[17-18]。Arg-1還能夠激活腫瘤誘導的骨髓源性抑制細胞(myeloid-derive suppressor cells,MDSCs),MDSCs存在于幾乎所有癌癥患者的外周血中,主要發(fā)揮免疫抑制作用,介導癌癥患者系統(tǒng)性免疫功能障礙和局部的腫瘤免疫逃避[19]。Arg-1在HCC中的異常表達是否通過介導機體免疫抑制而影響HCC的發(fā)生、發(fā)展,這需要進一步的實驗研究證實??傊?,Arg-1能通過多種途徑影響腫瘤的進展,但具體通過何種機制參與HCC還有待進一步 研究。

        本研究應用RT-PCR和Western blot以及免疫組織化學技術(shù)等,從mRNA和蛋白水平初步探討了Arg-1在HCC中的表達和意義以及可能的作用機制。明確Arg-1在HCC中的作用及具體機制,將有助于更深入認識HCC,也為臨床尋找有效的治療靶點提供新的依據(jù)。

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