蘇文媚 武奮萍 羅亮 許貝 楊志雄 賴振南

廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤中心，廣東 湛江 524000

小細(xì)胞肺癌(small cell lung cancer，SCLC)是一種以生長迅速、早期轉(zhuǎn)移、高度侵襲性為特點(diǎn)的肺癌類型，其發(fā)病率約占原發(fā)性肺癌的15%～20%［1-2］。SCLC的腫瘤細(xì)胞對(duì)化療和放療都非常敏感，但幾十年來多方案的臨床試驗(yàn)并沒能找到徹底治愈SCLC的有效方法，多數(shù)患者在一線治療以后仍會(huì)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，臨床預(yù)后 差［3-4］。X染色體耦聯(lián)鋅指蛋白(zinc finger protein X-linked，ZFX)是鋅指蛋白家族中的一員，其含有13個(gè)C2H2的鋅指結(jié)構(gòu)。ZFX基因位于哺乳動(dòng)物的X染色體上，其表達(dá)在哺乳動(dòng)物中呈高度保守性，其結(jié)構(gòu)包含一個(gè)酸性轉(zhuǎn)錄激活區(qū)、一個(gè)核定位序列及一個(gè)DNA結(jié)合位點(diǎn)［5］。早期研究認(rèn)為ZFX基因與哺乳動(dòng)物的性別決定有關(guān)，目前研究發(fā)現(xiàn)ZFX基因在多種類型的干細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)增高［6］，其與腫瘤的關(guān)系已經(jīng)成為國內(nèi)外普遍關(guān)注的熱點(diǎn)。在腫瘤學(xué)研究中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ZFX在前列腺癌、乳腺癌、白血病等人常見惡性腫瘤中出現(xiàn)異常表達(dá)［7-9］。然而關(guān)于ZFX在SCLC中的作用目前國內(nèi)外尚未見相關(guān) 報(bào)道。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集2008年1月—2013年8月在廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院腫瘤中心行手術(shù)切除或支氣管鏡活檢的SCLC組織標(biāo)本98例，選擇資料完整的SCLC患者78例進(jìn)行研究，其中男性36例，女性42例；患者年齡30～82歲，中位年齡53歲，53歲以下患者43例，53歲以上患者35例；廣泛期43例，局限期35例；化療敏感者(化療5～6個(gè)周期后腫瘤完全緩解或部分緩解)35例，化療耐藥者(化療5～6個(gè)周期后疾病穩(wěn)定或進(jìn)展者)43例，組織標(biāo)本放入液氮冷凍后，用錫紙包裹，在研缽中充分研磨，研磨后用TRIzol反復(fù)洗滌研磨的碎末，用經(jīng)DEPC水處理后的凍存管收集，放入液氮，用時(shí)提取RNA進(jìn)行檢測。所有患者術(shù)前均未行放化療，臨床資料完整，患者未并發(fā)其他系統(tǒng)疾病。所有患者均經(jīng)過病理學(xué)檢查確診為SCLC，78例患者均接受EP方案化療。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。全部78例患者出院后均隨訪，隨訪方式為電話和門診隨訪，隨訪內(nèi)容包括一般情況、臨床癥狀和影像學(xué)檢查。隨訪起點(diǎn)為病理確診日期，末次隨訪時(shí)間為2013年8月31日，截止隨訪終止時(shí)，存活患者22例(21.74%)，死亡患者56例(78.26%)，無失訪患者。

1.2 總RNA的提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR

按照試劑說明書，通過TRIzol提取試劑盒從SCLC組織標(biāo)本中提取總RNA；測量總RNA濃度，取1 μg RNA按逆轉(zhuǎn)錄合成試劑盒說明合成cDNA，然后以該cDNA為模板，PCR儀中擴(kuò)增從SCLC組織標(biāo)本中提取的總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。ZFX及內(nèi)參照GAPDH的引物序列見表1。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及PCR擴(kuò)增參照試劑盒說明進(jìn)行，以ZFX基因的上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)在實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)儀上進(jìn)行；3次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ=2-??Ct的方法進(jìn)行分析。ΔΔCt=(待測樣品的目的基因的Ct的平均值-待測樣本的管家基因的Ct的平均值)－(對(duì)照樣品的目的基因的Ct的平均值-對(duì)照樣本的管家基因的Ct的平均值)。

表1 ZFX及內(nèi)參照GAPDH的引物序列Tab. 1 The primer sequence of ZFX and GAPDH

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。ZFX在小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)差異采取t檢驗(yàn)進(jìn)行分析，ZFX的表達(dá)與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系使用Chi-Square檢驗(yàn)；采用Kaplan-Meier法分析ZFX的表達(dá)與生存期的關(guān)系，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 ZFX基因在SCLC組織中的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測ZFX基因在SCLC組織(SCLC局限期患者組織標(biāo)本和廣泛期組織標(biāo)本)中的表達(dá)，結(jié)果提示ZFX基因在SCLC局限期組織標(biāo)本中的表達(dá)水平較廣泛期患者明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，圖1)。

圖1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測ZFX基因在SCLC局限期和廣泛期組織標(biāo)本中的差異表達(dá)Fig. 1 The differential expression of ZFX gene was presented in the limited stage tissues and extensive stage SCLC tissues by QRT-PCR

2.2 ZFX蛋白在SCLC組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系

ZFX的表達(dá)與患者的性別無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.179，P=0.672)。ZFX的表達(dá)與患者的年齡無關(guān)，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=2.474，P=1.116)。ZFX在局限期患者中的表達(dá)較廣泛期患者低，兩者的ZFX表達(dá)率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=20.539，P<0.001)。ZFX在化療敏感患者中的表達(dá)較耐藥患者低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.84，P<0.001)。ZFX在存活患者中的表達(dá)較死亡患者低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=18.022，P<0.001，表2)。

2.3 SCLC患者生存分析

采用Kaplan-Meier法估計(jì)患者生存時(shí)間，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者的生存時(shí)間與性別和年齡無相關(guān)性，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；疾病的分期、患者對(duì)化療的敏感性及ZFX的表達(dá)與患者的生存時(shí)間相關(guān)。對(duì)化療敏感者的生存時(shí)間長于耐藥患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.585，P=0.032，圖2A)；局限期患者的生存時(shí)間長于廣泛期患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=9.921，P=0.002，圖2B)；ZFX低表達(dá)患者的生存時(shí)間長于高表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (χ2=19.841，P=0.000，圖2C)。

表2 ZFX的陽性表達(dá)與患者臨床病理特征的關(guān)系Tab. 2 Association of ZFX with clinicopathological parameters

圖2 Kaplan-Meier法估計(jì)患者生存時(shí)間Fig. 2 Survival times was evaluated by Kaplan-Meier assay

3 討 論

肺癌是當(dāng)今世界對(duì)人類健康危害最大的惡性腫瘤之一，我國肺癌發(fā)病率增長迅速，多數(shù)學(xué)者把更多的研究目光集中在非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)治療上，而SCLC的發(fā)病率卻悄然增長，由于研究的關(guān)注度和力度明顯不及前者，多年來治療無明顯突 破［10-11］。SCLC的治療以全身化療為主，聯(lián)合放療和手術(shù)為主要治療手段。目前臨床上化療一般采取順鉑為基礎(chǔ)的兩藥聯(lián)合治療方案，盡管SCLC患者對(duì)化療敏感，但很快出現(xiàn)的多藥耐藥現(xiàn)象導(dǎo)致化療失敗，極易復(fù)發(fā)［12］。復(fù)發(fā)后對(duì)任何細(xì)胞毒藥物均無作用。因此，如何克服SCLC的耐藥性，成為臨床上治療SCLC及提高生活質(zhì)量、延長生存時(shí)間的急需解決的重要 問題。

鋅指蛋白是指含有短的穩(wěn)定的能與Zn2+結(jié)合并自我折疊形成“手指”結(jié)構(gòu)的一類蛋白質(zhì)。由于其自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，鋅指蛋白可以選擇性地結(jié)合特異的靶結(jié)構(gòu)，在基因的表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞分化、胚胎發(fā)育等生命過程中發(fā)揮重要作 用［13-14］。近年來Galan-Caridad等［15］報(bào)道ZFX是胚胎干細(xì)胞和成體干細(xì)胞自我更新的共同分子基礎(chǔ)。Arenzana等［16］報(bào)道在B淋巴細(xì)胞中ZFX調(diào)控BCR介導(dǎo)的細(xì)胞增殖。研究者發(fā)現(xiàn)ZFX在胚胎干細(xì)胞和成體造血干細(xì)胞中高表達(dá)；ZFX基因敲除的胚胎干細(xì)胞和成體造血干細(xì)胞出現(xiàn)大量AnnexinⅤ陽性的凋亡細(xì)胞，而ZFX基因過表達(dá)的干細(xì)胞自我更新良好、生長迅速，且維持未分化狀態(tài)。這表明ZFX蛋白在多種干細(xì)胞的自我更新和抗凋亡機(jī)制中起著重要作用。還有研究發(fā)現(xiàn)ZFX沉默并不影響Oct4、Sox2、Nanog等經(jīng)典的干細(xì)胞自我更新通路［17］。然而關(guān)于ZFX蛋白在SCLC中的研究目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究通過發(fā)現(xiàn)ZFX基因在SCLC局限期組織標(biāo)本中的表達(dá)較廣泛期患者明顯降低，且與患者的疾病分期、對(duì)化療藥物的敏感性及生存時(shí)間相關(guān)。然而影響SCLC臨床預(yù)后的因素很多，本研究結(jié)果可能為基于ZFX研究SCLC治療及預(yù)后的研究提供一定的理論基礎(chǔ)和治療靶點(diǎn)。

［1］CALIFANO R, ABIDIN A Z, ZPECK R, et al. Management of small cell lung cancer: recent developments for optimal care ［J］. Drugs, 2012, 72(4): 471-490.

［2］KALEMKERIAN G P, AKERLEY W, BOQNER P, et al. Small cell lung cancer［J］. J Natl Compr Canc Netw, 2013, 11(1): 78-98.

［3］LOPEZ-CHAVEZ A, SANDLER A. Systemic issues in small cell lung cancer［J］. Curr Probl Cancer, 2012, 36(3): 131-155.

［4］METRO G, DURANTI S, FISCHER M J, et al. Emerging drugs for small cell lung cancer--an update［J］. Expert Opin Emerg Drugs, 2012, 17(1): 31-36.

［5］LAI W S, PERERA L, HICKS S N, et al. Mutational and structural analysis of the tandem zinc finger domain of tristetraprolin［J］. J Biol Chem, 2014, 289(1): 565-580.

［6］JIANG R, GAO Z L, SUN M, et al. Zinc finger X-chromosomal protein promotes growth and tumorigenesis in human osteosarcoma cells［J］. Pak J Med Sci, 2013, 29(4): 997-1002.

［7］DONG S, ZHANG P, LIANG S, et al. The role of the retinoblastoma protein-interacting zinc finger gene 1 tumor suppressor gene in human esophageal squamous cell carcinoma cells［J］. Oncol Lett, 2013, 6(6): 1656-1662.

［8］AHMED S, WANG A, CELIUS T, et al. Zinc finger nucleasemediated knockout of AHR or ARNT in human breast cancer cells abolishes basal and ligand-dependent regulation of CYP1B1 and differentially affects estrogen receptor alpha transactivation［J］. Toxicol Sci, 2014, 138(1): 89-103.

［9］HU R, WANG E, PENG G, et al. Zinc finger protein 668 interacts with Tip60 to promote H2AX acetylation after DNA damage［J］. Cell Cycle, 2013, 12(13): 2033-2041.

［10］LI D, ZHANG Y, XIE Y, et al. Enhanced tumor suppression by adenoviral PTEN gene therapy combined with cisplatin chemotherapy in small-cell lung cancer［J］. Cancer Gene Ther, 2013, 20(4): 251-259.

［11］OLSZEWSKI U, DEALLY A, TACKE M, et al. Alterations of phosphoproteins in NCI-H526 small cell lung cancer cells involved in cytotoxicity of cisplatin and titanocene Y［J］. Neoplasia, 2012, 14(9): 813-822.

［12］MICHAELSEN S R, CHRISTENSEN C L, SEHESTED M, et al. Single agent- and combination treatment with two targeted suicide gene therapy systems is effective in chemoresistant small cell lung cancer cells［J］. J Gene Med, 2012, 14(7): 445-458.

［13］CHANDRASEKHARAN S, KUMAR S, VALLEY C M, et al. Proprietary science, open science and the role of patent disclosure: the case of zinc-finger proteins［J］. Nat Biotechnol, 2009, 27(2): 140-144.

［14］SCHNIDAR H, EBERL M, KLINGLER S, et al. Epidermal growth factor receptor signaling synergizes with Hedgehog/GLI in oncogenic transformation via activation of the MEK/ERK/JUN pathway［J］. Cancer Res, 2009, 69(4): 1284-1292.

［15］GALAN-CARIDAD J M, HAREL S, ARENZANA T L, et al. Zfx controls the self-renewal of embryonic and hematopoietic stem cells［J］. Cell, 2007, 129(2): 345-357.

［16］ARENZANA T L, SMITH-RASKA M R, REIZIS B. Transcription factor Zfx controls BCR-induced proliferation and survival of B lymphocytes［J］. Blood, 2009, 113(23): 5857-5867.

［17］HU G, KIM J, XU Q, et al. A genome-wide RNAi screen identifies a new transcriptional module required for selfrenewal［J］. Genes Dev, 2009, 23(7): 837-848.