胡光輝 徐亮 賴鵬 郭錐鋒 劉歡 劉敏 王云 姚旭東 許云飛

上海市第十人民醫(yī)院泌尿外科，同濟大學附屬第十人民醫(yī)院，上海 200072

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中發(fā)病率最高的腫瘤，居于第1位。在男性所患腫瘤中居于第4位，致死性腫瘤中居于第9位，男女發(fā)病率比例為3∶1［1］。每年有超過330 000例新確診膀胱腫瘤，超過130 000人死于膀胱癌。70%～80%的患者確診時為非肌層浸潤性膀胱癌，50%～70%會復發(fā)，10%～30%會進展為肌層浸潤性膀胱 癌［2］。YAP是Hippo信號通路下游轉(zhuǎn)錄因 子［3］，目前研究認為YAP基因可能是致癌基因，在許多腫瘤中高表達［4-5］。YAP基因在膀胱癌中高表達并且與腫瘤分期、分級及預后顯著相關［6］。本實驗通過siRNA特異性下調(diào)YAP基因，觀察YAP基因表達下調(diào)后對膀胱癌T24細胞增殖、遷移功能的影響。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

人類膀胱癌T24細胞株購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心。用含 100 IU/mL青霉素、100 IU/mL鏈霉素(購自美國Hyclone公司)、10%胎牛血清(購自美國Hyclone公司)的RPMI-1640培養(yǎng)基(購自美國Hyclone公司)于CO2體積分數(shù)為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。YAP抗體購自Cell Signaling Technology公司。YAP基因RNA干擾基因序列：靶向沉默YAP基因的RNA(siRNA)順義鏈為：5’-GCAUCUUCFACAGUCUUCUTT’-3’；反義鏈為：5’-AGAAGACUGUCGAAGAUGCTT-3’。以siRNA NC的序列作為與人類基因組序列無任何匹配的陰性對照，siRNA NC順義鏈為：5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；反義鏈為：5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及T24細胞轉(zhuǎn)染

人膀胱癌T24細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-l640培養(yǎng)液中，以1×105個T24細胞每孔的密度將細胞分種于6孔培養(yǎng)板中，并置于 37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%及飽和濕度的溫箱中培養(yǎng)，應用陽離子脂質(zhì)載體LipofectamineTM2000將小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)轉(zhuǎn)染入T24細胞，轉(zhuǎn)染前細胞密度為70%～85%，siRNA轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmol/L，溫育72 h。轉(zhuǎn)染siRNA NC組作為陰性對照組，未做任何處理組細胞為空白對照組。

1.2.2 實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(quantitative real time-polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測

總RNA提取試劑(TRIzol reagent)提取各實驗組T24細胞的總RNA，紫外分光光度計準確定量?？俁NA進行反轉(zhuǎn)錄獲取cDNA后進行PCR反應。PCR反應條件為94 ℃變性；按下列參數(shù)循環(huán)32次：94 ℃變性20 s，57 ℃退火40 s， 72 ℃延伸40 s；最后72 ℃溫育10 min。qRT-PCR引物YAP基因順義鏈為：5’-ACCCACAGCTCAGCATCTTCG-3’；反義鏈為：5’-TGGCTTGTTCCCATCCATCAG-3’；β-actin基因順義鏈為：5’-CGTCTTCCCCTCCATCGT-3’；反義鏈為：5’-GAAGGTGTGGTGCCAGATTT-3’。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)分析

細胞轉(zhuǎn)染48～72 h后，收集細胞，利用RIPA細胞裂解液(購自北京康為世紀生物科技有限公司)提取總蛋白，二辛可酸(bicinchonininc acid，BCA)試劑盒(購自江蘇碧云天生物技術有限公司)測定蛋白濃度，并調(diào)整待測樣本的蛋白質(zhì)含量。每孔加50 μg的蛋白樣品，電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，按1∶1 000稀釋一抗溫育，置4 ℃冰箱過夜。TBST中洗膜3次，每次10 min，分別按 1∶2 000稀釋二抗溫育l h，TBST中洗膜3次，每次10 min。曝光、顯影及定影，用底片掃描儀掃描X線膠片，通過Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)(購自美國LICOR公司)讀取目的電泳條帶的密度值。

1.2.4 細胞增殖活性實驗

取對數(shù)生長期T24細胞，按5 000個/孔接種于96孔板，每孔100 μL，每個樣品設置5個復孔，邊緣加100 μL PBS，在37 ℃、CO2體積分數(shù)為5%培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。18 h后按LipofectamineTM2000說明書轉(zhuǎn)染siRNA，siRNA轉(zhuǎn)染終濃度為50 nmoL/L。轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)12、24、36、48和72 h。每個檢測時間點每孔加入10 μL細胞增殖活性檢測試劑盒(cell counting kit-8，CCK-8，購自上海和元生物公司)。3～4 h后酶標儀檢測450 nm的吸光度(A)值。

1.2.5 劃痕試驗

取對數(shù)生長期T24細胞，按1×105個/孔接種于6孔板，溫育24 h后分別加入濃度為50 nmol含有空白對照或siControl或siRNA YAP的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后細胞已鋪滿6孔板，利用槍頭尖在細胞培養(yǎng)液表面劃一條痕跡(長約2 cm)，繼續(xù)培養(yǎng)12和24 h后鏡下觀察各組T24細胞遷移變化情況。

1.2.6 Transwell遷移試驗

采用Becton Dickinson公司的Transwell小室，消化6孔板中已轉(zhuǎn)染的狀態(tài)良好的T24細胞以1×105個/孔接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi)，溫育16 h后分別加入濃度為50 nmol含有空白對照或NC control或siRNA的培養(yǎng)基24 h后消化離心，調(diào)整細胞密度為4×105/mL，取0.2 mL接種到Transwell小室，并將Transwell小室置于24孔板內(nèi)，上室內(nèi)為含1%滅活血清的培養(yǎng)基，下室為含10%滅活血清的培養(yǎng)基。培養(yǎng)20 h后用棉簽頭擦掉小室內(nèi)細胞，予95%乙醇固定，0.1%結晶紫染色，洗凈風干后于Leica熒光倒置顯微鏡200倍視野下拍照。33%冰醋酸洗脫結晶紫，檢測A450nm值。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 qRT-PCR及Western blot檢測siRNA干擾后YAP基因及蛋白的表達

qRT-PCR和Western blot蛋白印跡雜交分析分別檢測siRNA干擾YAP基因后在基因水平和蛋白水平的表達變化。結果顯示：與空白對照組、NC組相比，siRNA處理組T24細胞的YAP基因的RNA(F=93.91，P＜0.000 1)、蛋白水平(F=4.62，P＜0.05)的表達量均被顯著抑制 (圖1、2)。

圖1 qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染siRNA后T24膀胱癌中YAP mRNA表達量Fig. 1 Relative expression of YAP mRNA was detected by qRTPCR in T24 bladder cancer cells after transfected with siRNA YAP

圖2 Western blot檢測轉(zhuǎn)染siRNA后T24膀胱癌中YAP蛋白表達量Fig. 2 The expression of YAP protein was detected by Western blot in T24 bladder cancer cells after transfected with siRNA YAP

2.2 siRNA降低YAP基因表達抑制T24細胞增殖活性

CCK-8法測定空白轉(zhuǎn)染組、NC control組、siRNA組細胞不同時間的A值，隨著細胞生長時間的延長，空白組與NC control組細胞生長能力無明顯變化。而YAP-siRNA轉(zhuǎn)染組T24細胞隨著時間延長(12、24、36、48和72 h)和前2組比較細胞增殖減緩，差異有統(tǒng)計學意義 (12 h：F=6.00，P=0.037；24 h：F=41.72，P=0.000 3；36 h：F=462.8，P＜0.000 1； 48 h：F=236.6，P＜0.000 1；72 h：F=140.5，P＜0.000 1，圖3)。因此，YAP基因調(diào)控膀胱癌細胞增殖。

2.3 siRNA降低YAP基因表達抑制T24細胞的遷移能力

Transwell遷移試驗顯示，在每高倍鏡視野下，NC Control組和空白對照組的細胞數(shù)目顯著高于siRNA YAP組(F=20.7，P<0.05，圖4、5)。劃痕試驗顯示，隨時間的推移，空白對照組和NC control組細胞的愈合速度最快，而siRNA+YAP組的愈合速度最慢(F=43.55， P＜0.05)。因此，YAP可以顯著增強膀胱癌T24細胞的遷移能力，而siRNA沉默YAP基因表達后可以有效地抑制YAP引起的T24細胞遷移能力的變化(圖6、7)。

圖3 CCK-8檢測轉(zhuǎn)染siRNA后T24膀胱癌細胞增殖活性Fig. 3 Cell proliferation was detected by CCK-8 assay in T24 bladder cancer cells after transfected with siRNA YAP

圖4 Transwell遷移實驗檢測轉(zhuǎn)染siRNA后T24膀胱癌細胞遷移能力Fig. 4 Cell migration was detected in T24 bladder cancer cells after transfected with siRNA YAP(×200)

圖5 Tranwell 遷移實驗A值檢測分析Fig. 5 Analysis of cell migration

圖6 劃痕試驗檢測轉(zhuǎn)染siRNA后T24膀胱癌的遷移能力Fig. 6 Wound healing was detected in T24 bladder cancer cells after transfected with siRNA YAP(×100)

圖7 劃痕試驗統(tǒng)計分析(0 h vs 24 h)Fig. 7 Analysis of wound healing (o h vs 24 h)

3 討 論

膀胱尿路上皮癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，并且術后極易復發(fā)，30%的患者確診時已發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移。膀胱尿路上皮癌復發(fā)的主要危險因素為腫瘤大小、多灶性、病理分期等［2］。而充分認識膀胱癌的生物學行為的分子機制具有重要作用。Hippo信號通路是近年來發(fā)現(xiàn)的重要的信號通路，主要通過細胞增殖和凋亡進行調(diào)控器官發(fā)育［4］，Hippo信號通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關［7-8］。YAP蛋白是Hippo信號通路下游重要的轉(zhuǎn)錄因子，通過磷酸化修飾發(fā)揮作用。YAP基因在許多腫瘤中過表達，如肝癌、結腸癌、肺癌等［9-11］。YAP基因在膀胱尿路上皮癌中表達上調(diào)，并且與膀胱癌患者T分期、淋巴轉(zhuǎn)移以及預后密切相關。YAP蛋白免疫組化評分高的膀胱尿路上皮癌患者往往預后差、生存期短［6］。

YAP基因在泌尿系統(tǒng)腫瘤如膀胱癌、前列腺癌中均表達上調(diào)［12-13］，本實驗首次通過siRNA在人膀胱癌T24細胞中下調(diào)YAP基因表達，RT-PCR以及Western blot分析結果顯示，YAP基因在基因以及蛋白水平的表達均被抑制。通過RNA干擾技術，成功下調(diào)YAP基因表達后，發(fā)現(xiàn)膀胱癌T24細胞的增殖活性以及遷移能力被顯著抑制。因此，YAP蛋白與膀胱癌的增殖、遷移、侵襲以及轉(zhuǎn)移相關。在裸鼠體內(nèi)移植瘤模型中，過表達YAP能顯著促進腫瘤的生長［9］。過表達YAP基因能促進宮頸癌細胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial–mesenchymal transition，EMT)［14］，EMT與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移密切相關，而在膀胱尿路上皮癌中，EMT信號通路處于活化狀態(tài)［15］，并且活化程度在高級別和低級別膀胱癌中差異有統(tǒng)計學意義［16］。在肝癌細胞中，YAP上調(diào)Notch信號通路配體Jagged-1(Jag-1)激活Notch信號通路，調(diào)控肝癌細胞增殖、遷移以及侵襲［9］。YAP在膀胱癌中可能通過活化EMT以及激活Nocth信號通路或者其他通路促進膀胱癌復發(fā)、侵襲及轉(zhuǎn)移。

易復發(fā)、轉(zhuǎn)移是膀胱腫瘤的特點。腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移是一系列多因素、多信號通路相互作用的結果。與siRNA干擾YAP在其他腫瘤細胞中觀察到能明顯抑制腫瘤的增殖、遷移和侵襲。YAP與Akt/PIK-TOR、Wnt、Notch通路等通路串話［9,14］，調(diào)控腫瘤細胞增殖、侵襲。YAP基因與膀胱尿路上皮癌分期、分級以及預后顯著相關，并且調(diào)控膀胱尿路上皮癌細胞增殖、遷移。因此，關于YAP基因以及靶向YAP基因治療膀胱腫瘤值得進一步研究。

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