楊 銳，徐阿晶，劉 艷，陸曉彤，張 健，卜書(shū)紅（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院藥學(xué)部，上海200082）

［本文編輯］陽(yáng)凌燕

肝癌是最常見(jiàn)、惡性程度很高的腫瘤之一。目前，以手術(shù)為中心的綜合治療是肝癌病人的首選治療方式，但是肝癌的5年術(shù)后總體生存率仍不足50%，其中轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致該病預(yù)后不佳的主要原因之一。尋找新的、有效的術(shù)后治療藥物是肝癌治療亟待解決的重要問(wèn)題。

N－花生四烯基乙醇酰胺（arachidonyl ethanolamide，AEA）是一種內(nèi)源性大麻素（cannabinoid，CB），可通過(guò)結(jié)合CB1和CB2等受體發(fā)揮鎮(zhèn)痛、舒張血管、抑制細(xì)胞增長(zhǎng)和促進(jìn)凋亡等生理作用［1］。研究發(fā)現(xiàn)，外源性給予AEA可顯著抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡［2］。但由于AEA在體內(nèi)代謝迅速，作用效果微弱，不能滿(mǎn)足臨床治療需要［3］。脂肪酸酰胺水解酶（fatty acid amide hydrolase，F(xiàn)AAH）是體內(nèi)AEA的主要代謝酶，F(xiàn)AAH抑制劑URB597可間接上調(diào)體內(nèi)AEA水平，并通過(guò)誘導(dǎo)凋亡、抑制腫瘤細(xì)胞遷徙及血管生成等發(fā)揮抗腫瘤作用［4］。目前有關(guān)URB597抗肝癌作用的報(bào)道尚少。作者采用人肝癌細(xì)胞系MHCC97H為靶細(xì)胞，通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)探索URB597對(duì)肝癌的作用及機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及試劑 肝癌細(xì)胞系MHCC97H購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)GibcoBRL公司），絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶（Akt）、磷酸化Akt（p－Akt）、甘油醛－3－磷酸脫氫酶（GAPDH）一抗、羊抗兔二抗、URB597（美國(guó)Cell Signaling Technology公司），MTT細(xì)胞增殖試劑盒（碧云天生物科技研究所，編號(hào)C0009）。

1.2 儀器 3111恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）；超凈工作臺(tái)（美國(guó)Nuaire公司）；DFC420倒置顯微鏡（德國(guó)Leica公司）；FACSCalibur流式細(xì)胞儀（美國(guó)BectonDickinson公司）；5804R高速離心機(jī)（美國(guó)Effendorf公司）；酶標(biāo)儀（美國(guó)SunRISE TECAN公司）；Las3000曝光機(jī)（美國(guó)GE公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng) MHCC97H細(xì)胞采用DMEM高糖培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，青霉素和鏈霉素各200IU／ml）于37℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。0.25%胰蛋白酶＋0.02%EDTA消化細(xì)胞，1∶3傳代。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 藥物處理結(jié)束后，每孔加入5mg／ml MTT溶液20μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h。棄上清液，每孔加二甲亞砜（DMSO）100μl，振蕩10min，選擇490nm波長(zhǎng)測(cè)定各孔吸光度（A）。

1.5 Transwell細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 4℃下，用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋 Matrigel膠（1∶5），Transwell培養(yǎng)板上室每孔加入100μl，覆蓋整個(gè)膜，37℃下放置30min，使Matrigel聚合成膠。Transwell培養(yǎng)板下室加入10%DMEM高糖培養(yǎng)基，將MHCC97H細(xì)胞饑餓12h后，制成單細(xì)胞懸液，分別加入24孔板內(nèi)，每孔接種1×104個(gè)細(xì)胞，設(shè)6個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48h后，用4%甲醛固定30min，Giemsa染液染色15min，擦凈上室細(xì)胞后，晾干封片。在高倍鏡（×400）下隨機(jī)取6個(gè)視野計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.6 蛋白質(zhì)印跡（Western－blot）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)p－Akt和Akt表達(dá)量變化 藥物處理結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，加入適量蛋白質(zhì)裂解液，收集至預(yù)冷的1.5ml離心管中；4℃下1.34×104×g離心20min。取上清液，用BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，100℃下蛋白質(zhì)變性5min。制備聚丙烯凝膠，60V電泳至分離膠，電壓轉(zhuǎn)至80V繼續(xù)電泳2h。冰浴轉(zhuǎn)膜：100V／1～2h。用5%脫脂奶粉室溫下封閉1h。加一抗雜交，磷酸鹽緩沖液洗膜3次；加二抗雜交，磷酸鹽緩沖液洗膜3次。采用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑顯影，Las3000曝光機(jī)曝光。

2 結(jié) 果

2.1 URB597對(duì) MHCC97H細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用 MTT實(shí)驗(yàn)測(cè)得不同時(shí)間點(diǎn)的吸光度見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，隨著干預(yù)時(shí)間增加，不同濃度URB597對(duì)MHCC97H細(xì)胞生長(zhǎng)具有顯著抑制作用，且呈時(shí)間、劑量依賴(lài)性。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，1、5μmol／L URB597沒(méi)有誘導(dǎo)MHCC97H細(xì)胞凋亡的作用；10μmol／L URB597作用3d后顯示出明顯的凋亡規(guī)律，但壞死率均＜2%，與對(duì)照組（壞死率 1.46%）相比，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。10μmol／L URB597作用3、4、5、6、7d后，細(xì)胞凋亡率分別為（18.14±3.23）%、（25.46±4.68）%、（37.56±3.69）%、（45.75±6.58）%、（53.26±5.48）%，與對(duì)照組細(xì)胞凋亡率（5.20±3.88）%相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

2.2 URB597對(duì) MHCC97H細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果（見(jiàn)圖1）顯示，URB597可顯著抑制MHCC97H細(xì)胞的侵襲能力，平均鏡下視野計(jì)數(shù)，與對(duì)照組（1 7±4.5 0）個(gè)相比，1μmol／L URB597組為（15±3.45）個(gè)（P＞0.05），5μmol／LURB597組為（10±2.64）個(gè)（P＜0.01）、10μmol／L URB597組為（8±1.32）個(gè)（P＜0.001，n＝6），呈顯著劑量依賴(lài)作用。

表1 不同濃度URB597作用于MHCC97H細(xì)胞后不同時(shí)間測(cè)得的吸光度Table 1 The absorbance of MHCC97Hcells after treatment with different concentrations of URB597at different time（n＝6，）

表1 不同濃度URB597作用于MHCC97H細(xì)胞后不同時(shí)間測(cè)得的吸光度Table 1 The absorbance of MHCC97Hcells after treatment with different concentrations of URB597at different time（n＝6，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01，＊＊＊P＜0.001，與對(duì)照組比較

9±0.17 2.75±0.12 2.69±0.22 1μmol／L URB597組 0.31±0.11 0.56±0.15 1.19±0.12 1.65±0.16 1.95±0.14＊2.11±0.17＊2.01±0.20＊5μmol／L URB597組 0.28±0.12 0.41±0.09 0.93±0.16＊1.09±0.13＊＊1.23±0.17＊＊＊1.58±0.14＊＊＊1.39±0.17＊＊＊10μmol／L URB597組 0.32±0.06 0.51±0.14 0.79±0.15＊＊0.96±0.09＊＊＊1.08±0.21＊＊＊0.96±0.12＊＊＊0.68±0.09 0d 1d 2d 3d 4d 5d 6d對(duì)照組 0.34±0.08 0.62±0.13 1.28±0.21 1.75±0.18 2.3組別＊＊＊

圖1 不同濃度URB597對(duì)MHCC97H細(xì)胞侵襲能力的影響（×400）Figure 1 Effects of different concentrations of URB597on invasion of MHCC97Hcells（×400）

2.3 URB597對(duì)MHCC97H細(xì)胞生長(zhǎng)相關(guān)分子的影響 磷脂酰肌醇－3激酶（phosphatidylinositol－3 kinase，PI3K）／Akt通路的過(guò)度活化與人肝癌細(xì)胞增殖和侵襲密切相關(guān)［5］。不同濃度URB597處理后，以GAPDH 為內(nèi)參照，對(duì)照組及1、5、10μmol／L URB597處理組p－Akt表達(dá)量分別為（81±11.25）%、（74±10.08）%、（55±5.23）%和（39±8.19）%，Akt表達(dá)量分別為（105±3.45）%、（97±7.32）%、（96±6.94）%和（102±1.69）%，如圖2所示?？梢?jiàn)，與對(duì)照組相比，URB597干預(yù)MHCC97H細(xì)胞24h后，5、10μmol／L URB597組MHCC97H細(xì)胞中p－Akt水平顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），而Akt水平無(wú)顯著變化，提示URB597可顯著抑制Akt活化水平。

圖2 不同濃度URB597處理24h后MHCC97H細(xì)胞中Akt和p－Akt的表達(dá)水平Figure 2 Expression levels of Akt and p－Akt in MHCC97Hcells after treatment with different concentrations of URB597at 24h

3 討 論

FAAH為AEA的主要代謝酶，已成為抗癌藥物研究的重要靶點(diǎn)，抑制其活性可顯著增加內(nèi)源性AEA水平，發(fā)揮抗腫瘤作用。URB597屬于不可逆性FAAH抑制劑，可以顯著抑制黑素瘤、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤的生長(zhǎng)，并抑制前列腺癌細(xì)胞侵襲［6－8］，但其對(duì)肝癌作用的報(bào)道尚少。

本研究將不同濃度URB597與MHCC97H細(xì)胞共同孵育1～7d，結(jié)果發(fā)現(xiàn)各濃度URB597均對(duì)腫瘤細(xì)胞具有明顯的生長(zhǎng)抑制作用，且10μmol／L URB597還可誘導(dǎo) MHCC97H細(xì)胞凋亡。5、10μmol／L URB597作用2d即表現(xiàn)出生長(zhǎng)抑制作用，在第4～6天可明顯抑制細(xì)胞生長(zhǎng)，1μmol／L URB597在第4天表現(xiàn)出生長(zhǎng)抑制作用。1、5μmol／L URB597沒(méi)有誘導(dǎo)MHCC97H細(xì)胞凋亡的作用，而10μmol／L URB597作用3d后顯示出明顯的凋亡規(guī)律，提示URB597抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用呈時(shí)間及劑量依賴(lài)性。

諸多報(bào)道顯示，AEA對(duì)多種腫瘤具有抑制轉(zhuǎn)移及侵襲的作用，可通過(guò)調(diào)節(jié)局部黏著斑激酶磷酸化、基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子及RhoA／Rho激酶信號(hào)通路抑制黑素瘤、乳腺癌及前列腺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。最近研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AAH的表達(dá)和活性與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)［8］。本研究采用Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，5、10μmol／L URB597可顯著減少透過(guò)人工重組基底膜的侵襲細(xì)胞數(shù)，提示URB597具有抑制肝癌細(xì)胞侵襲的作用。

PI3K是脂質(zhì)激酶家族的成員，Akt是其重要的下游靶蛋白。Akt為絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，PI3K可將Akt磷酸化為活性形式p－Akt［5］。PI3K／Akt通路的活化與腫瘤細(xì)胞的增殖、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。為了進(jìn)一步研究URB597對(duì)肝癌細(xì)胞系生長(zhǎng)和侵襲能力抑制作用的機(jī)制，作者對(duì)細(xì)胞p－Akt進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，URB597可劑量依賴(lài)性地抑制p－Akt水平（P＜0.05）。p－Akt可通過(guò)調(diào)節(jié)Bcl－2家族蛋白質(zhì)及基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP－9）促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和侵襲，相反，p－Akt水平降低，可以導(dǎo)致細(xì)胞侵襲能力的下降［9］。因此，URB597可能通過(guò)抑制PI3K／Akt通路，抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及侵襲。

本研究結(jié)果初步表明，URB597對(duì)人肝癌細(xì)胞株MHCC97H細(xì)胞有抑制生長(zhǎng)、誘導(dǎo)凋亡和減少侵襲的作用，可能與其抑制Akt過(guò)度磷酸化有關(guān)，提示URB597可能會(huì)成為一種新的治療或輔助治療肝癌的藥物。

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