胡芳，楊英來，劉小花，朱瑞娟，李燦，封士蘭（蘭州大學(xué)藥學(xué)院，蘭州730000）

補中益氣丸是臨床常用中成藥，由君藥黃芪，臣藥黨參、甘草（蜜炙）、白術(shù)（炒），佐藥當(dāng)歸、升麻，使藥柴胡、陳皮組成，具有補中益氣、升陽舉陷之功能[1]，在臨床上尚有健脾化濕、升清降濁等作用[2]。該方組方嚴(yán)謹(jǐn)，用藥精良，其中“益氣升陽”配伍是該方的一大特色[3]。

中藥復(fù)方制劑化學(xué)成分復(fù)雜[4]，其藥理作用是各味藥材中多種有效成分的綜合作用[5]。目前有關(guān)補中益氣丸的研究多數(shù)集中于含量測定[6-7]以及指紋圖譜[8-9]的研究上，但指紋圖譜與補氣作用的譜-效相關(guān)性研究未見文獻(xiàn)報道。筆者同時建立了補中益氣丸的高效液相色譜（HPLC）-二極管陣列檢測器（DAD）和HPLC-蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）指紋圖譜，將兩者分別與其補氣作用進(jìn)行了譜-效關(guān)聯(lián)度分析，全面評價了補中益氣丸的質(zhì)量。

1 材料

1.1 儀器

2695型HPLC儀，包括2996型DAD、Millenium32型色譜管理站、Oasis HLB 3cc型固相萃?。⊿PE）小柱（美國Waters公司）；ALTCH 2000型蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD，美國奧泰公司）；KQ-400DE型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；UV1700型紫外-可見分光光度計（日本島津公司）；BP211D型十萬分之一天平、BS224S型萬分之一天平（德國賽多利斯公司）；MIKRO 22型離心機(jī)（德國Hettich公司）；1.0版中藥色譜指紋圖譜計算機(jī)輔助相似性評價系統(tǒng)軟件（中南大學(xué)）。

1.2 藥品與試劑

補中益氣丸[蘭州太寶制藥有限公司，批號：83111110（A）、83111213（B）、83121124（C）、83121003（D）、83120875（E）；蘭州佛慈制藥股份有限公司，批號：12J52（F）、12F39（G）、12J50（H）、12F40（I）、12J49（J）]；毛蕊異黃酮（批號：111530）、黃芪甲苷（批號：110781）、橙皮苷（批號：721）、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ（批號：12062722）對照品均購自上海一林生物科技有限公司（純度均＞98%）；藁本內(nèi)酯（批號：110612-20013700）、芒柄花素（批號：110714-200501）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為分析純，乙腈為色譜純，水為超純水。

1.3 動物

KM種小鼠120只，♀♂兼用，體質(zhì)量18～22 g，由蘭州大學(xué)動物實驗中心提供[實驗動物使用合格證號：SCXK（甘）2009-0004]。

2 方法

2.1 補中益氣丸補氣作用研究

對小鼠控制飲食（喂食量為平時的1/2），并進(jìn)行力竭游泳，游泳水溫控制在25℃，不能以尾撐桶邊休息，每天1次，連續(xù)14 d[10]，以復(fù)制小鼠力竭模型。力竭標(biāo)準(zhǔn)為游泳最后下沉，經(jīng)10 s后仍不能返回水面[11]。120只小鼠隨機(jī)均分為12組，即正常對照（等容生理鹽水）組、模型（等容生理鹽水）組與補中益氣丸①、②、③、④、⑤、⑥、⑦、⑧、⑨、⑩（A、B、C、D、E、F、G、H、I、J，1.06 g/kg）組。復(fù)制模型成功后ig給藥，每天1次，連續(xù)10 d。末次給藥后0.5 h，尾iv20%印度墨汁0.01 ml/g，于iv后2 min（t1）、10 min（t2），分別從眼靜脈叢取血 20 μl，溶于 2 ml 0.1%NaHCO3溶液中，搖勻，用分光光度計在600 nm波長處測定吸光度（A）。將小鼠脫臼處死，分別稱肝、脾和胸腺質(zhì)量，按下式計算胸腺或脾臟指數(shù)：

胸腺或脾臟指數(shù)＝胸腺或脾臟濕質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）

再按下式計算廓清指數(shù)（K）或校正廓清指數(shù)（α，表示吞噬活性）：

K＝（lgA1－lg A2）（/t2－t1），α＝體質(zhì)量（/肝質(zhì)量+脾質(zhì)量）[12]

2.2 補中益氣丸指紋圖譜研究

2.2.1 溶液的制備 （1）供試品溶液的制備：稱取補中益氣丸粉末2.5 g，置100 ml錐形瓶中，加60 ml甲醇浸泡，超聲30 min，濾過，殘渣加40 ml甲醇，超聲30 min，濾過。合并濾液，蒸干，加3 ml水溶解，以離心半徑為8.69 cm、10000 r/min離心6 min，取上清液用SPE小柱純化[13-14]（SPE小柱預(yù)先用7.5 ml甲醇和7.5 ml水活化），分別用1.0 ml水、1.0 ml 10%甲醇、1.0 ml 90%甲醇洗脫，收集10%甲醇和90%甲醇的洗脫液，混合，氮吹，加甲醇定容至2 ml，0.45μm微孔濾膜濾過，續(xù)濾液即為供試品溶液。（2）對照品溶液的制備：精密稱取橙皮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、藁本內(nèi)酯、黃芪甲苷對照品各適量，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容，得橙皮苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、藁本內(nèi)酯、黃芪甲苷質(zhì)量濃度分別為0.135、0.210、0.144、0.180、0.164、0.186 mg/ml的對照品溶液。

2.2.2 色譜條件色譜柱：思博爾ODS-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（程序見表1）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：290 nm；柱溫：30℃；漂移管溫度：110.5 ℃；載氣流速：3.1 ml/min；進(jìn)樣量：30 μl。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab 1 Gradient program procedure of mobile phase

2.2.3 供試品測定 按“2.2.1”項下方法平行制備10批樣品的供試品溶液，分別精密吸取各供試品溶液30 μl，注入HPLC儀，按“2.2.2”項下色譜條件測定，記錄80 min色譜圖。

2.3 補中益氣丸指紋圖譜與藥效作用灰關(guān)聯(lián)度分析

灰關(guān)聯(lián)度分析來自灰色系統(tǒng)理論，具有整體性的特點。如果兩個因素同步變化程度較高，則兩者關(guān)聯(lián)度大；反之，兩者關(guān)聯(lián)度小。選取α作為藥效參數(shù)，對補中益氣丸HPLC-DAD和HPLC-ELSD指紋圖譜與補氣療效進(jìn)行灰關(guān)聯(lián)度分析。

3 結(jié)果

3.1 補中益氣丸的補氣作用

與正常對照組比較，模型組小鼠體質(zhì)量增加，胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、K、α減小，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；與模型組比較，補中益氣丸①、③、④、⑥、⑧、⑨、⑩組小鼠體質(zhì)量增加，胸腺指數(shù)、脾指數(shù)、K、α增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）；補中益氣丸⑤、⑦組小鼠體質(zhì)量增加，脾指數(shù)、K、α增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）；補中益氣丸②組小鼠體質(zhì)量增加，胸腺指數(shù)、K、α增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01或P＜0.05）。補中益氣丸對模型小鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)的影響見表2；對K、α的影響見表3。

表2 補中益氣丸對模型小鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)的影響（±s，n＝10）Tab 2 Influence of Buzhong yiqi pills on body weight and viscera index of model mic（e±s，n＝10）

表2 補中益氣丸對模型小鼠體質(zhì)量、臟器指數(shù)的影響（±s，n＝10）Tab 2 Influence of Buzhong yiqi pills on body weight and viscera index of model mic（e±s，n＝10）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組模型組補中益氣丸①組補中益氣丸②組補中益氣丸③組補中益氣丸④組補中益氣丸⑤組補中益氣丸⑥組補中益氣丸⑦組補中益氣丸⑧組補中益氣丸⑨組補中益氣丸⑩組脾指數(shù)3.58±0.312.60±0.41＊3.36±0.43##3.14±0.513.41±0.37##3.46±0.30##3.30±0.56#3.53±0.65##3.45±0.36##3.50±0.43##3.51±0.54##3.44±0.85#體質(zhì)量增加值/g 0.96±0.218.68±1.53＊11.00±1.90#10.71±1.45#12.11±0.96##11.34±2.13#12.59±1.86##11.59±1.92##11.64±1.71##12.64±1.88##12.15±1.97##12.48±1.48##胸腺指數(shù)3.18±1.871.28±0.28＊2.85±0.52##2.32±0.52##2.27±0.97#2.56±0.80##2.13±0.912.65±0.91##2.16±1.032.42±0.63##2.31±0.58##2.18±0.71##

表3 補中益氣丸對模型小鼠K、α的影響（±s，n＝10）Tab 3 Influence of Buzhong yiqi pills on clearance index and correct clearance index of model mic（e±s，n＝10）

表3 補中益氣丸對模型小鼠K、α的影響（±s，n＝10）Tab 3 Influence of Buzhong yiqi pills on clearance index and correct clearance index of model mic（e±s，n＝10）

與正常對照組比較：＊P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05，##P＜0.01vs.normal control group：＊P＜0.01；vs.model group：#P＜0.05，##P＜0.01

組別正常對照組模型組補中益氣丸①組補中益氣丸②組補中益氣丸③組補中益氣丸④組補中益氣丸⑤組補中益氣丸⑥組補中益氣丸⑦組補中益氣丸⑧組補中益氣丸⑨組補中益氣丸⑩組K α 6.3195±0.78044.0610±0.3826＊6.1147±1.3120##5.3451±1.0688#5.2476±0.7544##5.4170±1.1679##5.9625±1.0063##5.2836±1.0011#5.4412±1.1041#6.0132±1.1108##5.0455±0.7059##5.0843±0.7176##0.0427±0.01770.0160±0.0039＊0.0428±0.0224##0.0282±0.0109#0.0286±0.0113#0.0319±0.0192#0.0386±0.0187#0.0358±0.0145##0.0390±0.0212##0.0401±0.0216##0.0241±0.0084#0.0227±0.0064#

3.2 補中益氣丸指紋圖譜的建立

HPLC-DAD指紋圖譜中有21個峰是各供試品所共有的，因此確定這21個峰為共有峰。與對照品的保留時間和紫外數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，確定11、12、18、19、21號峰分別為橙皮苷、洋川芎內(nèi)酯Ⅰ、毛蕊異黃酮、芒柄花素、藁本內(nèi)酯。HPLC-ELSD指紋圖譜中有10個峰是各供試品所共有的，其中4、8號峰與對照品橙皮苷、黃芪甲苷的保留時間一致，確定其分別為橙皮苷、黃芪甲苷。10批補中益氣丸的HPLC-DAD、HPLC-ELSD指紋圖譜分別見圖1、圖2（圖中R為共有模式）。

圖1 10批補中益氣丸的HPLC-DAD指紋圖譜Fig 1 HPLC-DAD fingerprint for 10 batches of Buzhong yiqi pills

圖2 10批補中益氣丸的HPLC-ELSD指紋圖譜Fig 2 HPLC-ELSD fingerprint for 10 batches of Buzhong yiqi pills

3.3 灰關(guān)聯(lián)度分析

對補中益氣丸HPLC-DAD指紋圖譜與補氣療效進(jìn)行灰關(guān)聯(lián)度分析，依據(jù)關(guān)聯(lián)度的大?。ㄒ姳?），確定了各成分（以特征峰編號作為該特征峰所代表的化學(xué)成分名稱）對補氣作用貢獻(xiàn)的大小順序為：7＞8＞6＞11＞4＞9＞19＞14＞1＞16＞3＞13＞15＞18＞12＞5＞17＞2＞21＞10＞20。對補中益氣丸HPLC-ELSD指紋圖譜與補氣療效進(jìn)行灰關(guān)聯(lián)度分析，依據(jù)關(guān)聯(lián)度的大小（見表5），確定了各成分（以特征峰編號作為該特征峰所代表的化學(xué)成分名稱）對補氣作用貢獻(xiàn)的大小順序為：1＞6＞4＞2＞9＞5＞10＞3＞8＞7。研究結(jié)果表明，HPLCDAD與HPLC-ELSD指紋圖譜中各峰所代表的化學(xué)成分與補氣作用均有一定的關(guān)聯(lián)（關(guān)聯(lián)度＞0.62），表明補中益氣丸的補氣作用均是其所有化學(xué)成分共同作用的結(jié)果。本研究確認(rèn)的已知成分中橙皮苷和芒柄花素與補氣作用具有較高關(guān)聯(lián)（關(guān)聯(lián)度＞0.78）。

4 討論

由于單一復(fù)制模型方法不能達(dá)到滿意的效果，筆者采用限制食量和游泳使其疲勞的聯(lián)合方法復(fù)制小鼠氣虛模型。復(fù)制模型結(jié)束后小鼠精神萎靡、毛發(fā)稀疏蓬松、尾爪顏色蒼白、弓背趴地、活動明顯減少且反應(yīng)遲鈍，證明復(fù)制模型成功。給藥后各給藥組小鼠精神狀態(tài)得到不同程度改善，活動量增大，皮毛光澤，而模型組無明顯變化，證明10批補中益氣丸對氣虛癥狀均有改善作用。

補中益氣丸成分復(fù)雜，制劑過程中加入了潤濕劑、黏合劑等輔料，干擾雜質(zhì)較多，色譜圖峰形不好。有些化合物不可逆地吸附于色譜柱，導(dǎo)致色譜柱柱效降低、實驗重復(fù)性差。SPE小柱應(yīng)用于補中益氣丸HPLC供試品溶液的前處理，減少了雜質(zhì)，獲得了理想的色譜，提高了實驗可重復(fù)性，保證了各樣品分析壞境的一致。

表4 10批補中益氣丸HPLC-DAD指紋圖譜的共有峰與補氣療效之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)和關(guān)聯(lián)度Tab 4 The correlation coefficient and correlation degree between tonifying qi efficacy and the common peak of HPLCDAD fingerprint for 10 batches of Buzhong yiqi pills

表5 10批補中益氣丸HPLC-ELSD指紋圖譜的共有峰與補氣療效之間的關(guān)聯(lián)系數(shù)和關(guān)聯(lián)度Tab 5 The correlation coefficient and correlation degree between tonifying qi efficacy and the common peak area of HPLC-ELSD fingerprint for 10 batches of Buzhong yiqi pills

筆者選取K和α作為藥效學(xué)指標(biāo)，K反映了機(jī)體單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)吞噬細(xì)胞的能力，α考慮了個體體質(zhì)量和臟器質(zhì)量對吞噬能力的影響，消除了一定的個體誤差。結(jié)果顯示，補中益氣丸各組較模型組均能不同程度地提高K和α。指紋圖譜與藥效數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析顯示，HPLC-DAD指紋圖譜和HPLC-ELSD指紋圖譜均與補中益氣丸的補氣作用有一定對應(yīng)關(guān)系。根據(jù)關(guān)聯(lián)度大小，可得出結(jié)論：補中益氣丸中對補氣作用貢獻(xiàn)較大的成分有橙皮苷、芒柄花素，更多成分有待進(jìn)一步研究。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：780.

[2]趙旭斌.補中益氣丸臨床應(yīng)用心得[J].光明中醫(yī)，2011，26（10）：2057.

[3]鄧淙友.補中益氣丸及其配伍的藥效學(xué)研究[D].廣州：廣州中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

[4]杜冠華.中藥復(fù)方有效成分組學(xué)研究[J].中成藥，2002，24（11）：878.

[5]牛楠，郝海濤.中藥復(fù)方化學(xué)成分的研究進(jìn)展[J].中國藥業(yè)，2011，20（7）：77.

[6]劉雁嗚，彭飛城，龍海燕，等.高效液相法-示差折光檢測法測定補中益氣丸中蜂蜜的含量[J].中南藥學(xué)，2011，9（11）：804.

[7]徐端瓊.高效液相色譜法測定補中益氣丸中橙皮苷的含量[J].海峽藥學(xué)，2007，19（3）：48.

[8]孫國祥，蔡新鳳.補中益氣丸的毛細(xì)管電泳指紋圖譜研究[J].中南藥學(xué)，2012，10（4）：307.

[9]鄒華彬，董鳳娟，張新玲，等.ΔSr等級序列模式識別法分析補中益氣丸和十全大補丸HPLC指紋圖譜[J].山東大學(xué)學(xué)報：工學(xué)版，2011，41（6）：97.

[10]成細(xì)華，田道法，劉杏紅，等.益氣解毒方對小鼠力竭游泳所致氣虛體質(zhì)狀態(tài)下自由基代謝的干預(yù)作用[J].湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，27（2）：15.

[11]龐輝，何惠.螺旋藻對力竭運動小鼠胃組織的影響[J].中國臨床康復(fù)，2006，10（31）：75.

[12]Wang M，Meng XY，Yang RL，et al.Cordyceps militaris polysaccharides can enhance the immunity and antioxidation activity in immunosuppressed mice[J].Carbohyd Polym，2012，89（2）：461.

[13]林華，吳釘紅.高麗參注射液SPE-HPLC指紋圖譜初步研究[J].中藥材，2006，29（8）：846.

[14]周軍輝.復(fù)方蛤青注射液指紋圖譜和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究[D].西安：西北大學(xué)，2004.