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(1.貴州大學(xué)貴州省農(nóng)業(yè)生物工程研究院，貴州 貴陽 550025;2.貴州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550025)

蘇麻(Perilla frutescens Britt.var.frutescens)，唇形科紫蘇屬一年生草本植物［1］。蘇麻籽富含油脂和蛋白質(zhì)，其中，含α-亞麻酸高達53.63%［2］，而α-亞麻酸對降低膽固醇、降低血脂、防止動脈粥樣硬化、降低腦血栓、護肝養(yǎng)顏、改善記憶、保護視力、緩解過敏反應(yīng)、延緩衰老等具有重要作用［3］。形態(tài)學(xué)鑒定出蘇麻(Perilla frutescens Britt.var.frutescens)與紫蘇(P.frutescens Britt.var.acuta Kudo)為紫蘇屬紫蘇的不同的不同變種。根據(jù)植物分類學(xué)理論，種是具有一定的自然分布區(qū)和一定的生理、形態(tài)特征的生物類群，而變種是某些遺傳特征已有別于原來的種［3］。所以，單用形態(tài)學(xué)分析方法較難以鑒定其親緣關(guān)系。本文通過ISSR標(biāo)記技術(shù)結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定方法結(jié)果對蘇麻和紫蘇進行親緣關(guān)系鑒定，更能準(zhǔn)確的、直觀的鑒定紫蘇屬植物蘇麻與紫蘇的親緣關(guān)系，也為蘇麻的綜合利用及其產(chǎn)品的研究開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 試驗材料與方法

1.1 材料

本次研究采集了貴州省蘇麻樣品1份和紫蘇樣品3份作為實驗材料(表1)。

表1 供試材料的名稱及主要性狀Tab.1 Accession names and chief characters of the tested germplasms used for identification

1.2 方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定 據(jù)《中國植物志》唇形科編者介紹，花萼在結(jié)果時增大與增大不明顯為紫蘇變種鑒定的主要指標(biāo)。對4份供試材料的莖、葉、花、萼片、唇瓣等形態(tài)學(xué)性狀進行記載［4-5］。

1.2.2 DNA提取及檢測 取-80℃下保存的鮮嫩莖尖，利用 Plant GenomicDNA Kit(DP305-03，天根生化科技有限公司)提取基因組DNA。利用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測其質(zhì)量和濃度，并用TE緩沖液將其稀釋至約20mg/L。置于-20℃冰箱儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 PCR擴增及檢測 本文所用已發(fā)表文獻的20個引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。從中共篩選出10個擴增效果和重復(fù)性較好的引物，其中引物M05、M06和856等擴增出的標(biāo)記能將4份種質(zhì)區(qū)分開來，M05:(GCT)4Y，退火溫度為 50.4℃，M06:(AGC)4Y，退火溫度 為 56.0℃，856:(AC)8YA，退 火 溫 度 為55.0℃。其優(yōu)化后的PCR擴增反應(yīng)體為:10 μL反應(yīng) 體 系 含 3.0 μL ddH2O，0.5 μL 引 物 (10 μmol/L)，1.5 μL 模板 DNA，5.0 μL 2 × Taq PCR Master Mix。2×Taq PCR Master Mix(購于天根生化科技有限公司)含0.1 U/μL Taq polymerase，500 μmol/L dNTP each，20 mmol/L Tris-HCl(pH 8.3)，100 mmol/L KCl，3 mmol/L MgCl2，以及其他穩(wěn)定劑和增強劑。PCR擴增程序為:首先94℃下進行5 min的預(yù)變性;然后進行94℃變性35 s，Tm 退火45 s，72 ℃ 延伸(90 s)，35 個循環(huán);最后72℃ 延伸10 min，于4℃ 保存。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 相同遷移位上有清晰的擴增帶記為1、無帶記為0，并分別用NTSYS 2.01軟件與UPGMA法進行其相似性系數(shù)的計算和親緣關(guān)系圖的構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)

形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示蘇麻與3份紫蘇的差別主要為蘇麻莖綠色，葉邊緣不具尖鋸齒，花萼結(jié)果時明顯增大(10月中旬始)，長1.1 cm，為紫蘇(原變種);而紫蘇莖紫色，花萼結(jié)果時增大不明顯，長4～6 mm，為野生紫蘇(變種)。

2.2 DNA提取及PCR擴增檢測

利用1%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計檢測DNA質(zhì)量和濃度，結(jié)果表明所提取的基因組DNA質(zhì)量較好(圖1)，可用于后續(xù)研究。圖2為引物M05對蘇麻及3份紫蘇基因組DNA的擴增結(jié)果。

圖1 供試材料基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測Fig.1 Agarose gel electrophoresis of genomic DNA of the tested germplasms

2.2 ISSR標(biāo)記分析

從20個ISSR引物中篩選出能擴增出清晰、穩(wěn)定性和重復(fù)性好且相對條數(shù)較多帶紋的10個引物，對4份供試材料進行PCR分析。結(jié)果表明10個引物共獲得69個標(biāo)記，平均每個引物擴增6.9個，其中多態(tài)性標(biāo)記51個，多態(tài)性比率為73.9%。即4份供試材料的特異性指紋圖譜均有區(qū)別，其產(chǎn)生的標(biāo)記信息可將4份供試材料完全區(qū)別開。

圖2 引物M05對供試材料的擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 PCR profiles of the tested germplasms accessions amplified from primer M05

圖3與表2分別為供試材料的擴增產(chǎn)物電泳圖和特異性指紋(引物856)，此引物共獲得6個標(biāo)記，其中多態(tài)性標(biāo)記4個，多態(tài)性比率為66.7%。其標(biāo)記信息可將供試材料1、2與材料3、4區(qū)別開。

圖3 引物856對供試材料的擴增產(chǎn)物電泳圖Fig.3 PCR profiles of the tested germplasms accessions amplified from primer 856

表2 供試材料的特征ISSR譜帶(引物856)Tab.2 Specific fingerprints for the tested germplasms

2.3 親緣關(guān)系分析

根據(jù)擴增結(jié)果建立ISSR表型數(shù)據(jù)矩陣后，采用NTSYS 2.1軟件分析，計算出4份供試材料間的遺傳相似性系數(shù)為1.01～8.20，平均為2.71(表3)。對4份供試材料進行基于UPGMA法的樹狀聚類圖的繪制。如圖4所示:4份供試材料之間的遺傳距離范圍為0.35～0.53，在遺傳距離為0.53處，4份供試材料可分為兩個類群份供試材料可聚為兩組，其中蘇麻為一組，其余3份紫蘇聚為一組。在遺傳距離為0.35～0.44之間，3份紫蘇構(gòu)成一個聚類群，這個類群的品種(系)親緣關(guān)系很近，遺傳距離在0.09以內(nèi)。而蘇麻與3份紫蘇間的親緣關(guān)系較遠，3份紫蘇之間的遺傳相異系數(shù)最小，為0.01。形態(tài)學(xué)鑒定出紫蘇為野生紫蘇，而蘇麻為紫蘇(原變種)，蘇麻與3份紫蘇屬于紫蘇屬紫蘇，但屬于紫蘇的不同變種。即ISSR聚類結(jié)果與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果相吻合。

表3 4份供試材料間的遺傳相似性系數(shù)Tab.3 The gennetic similarity of the tested germplasms

圖4 供試材料的親緣關(guān)系聚類圖Fig.4 The UPGMA dendrogram of the tested germplasms

3 討論

目前，關(guān)于利用形態(tài)學(xué)鑒定、分子標(biāo)記技術(shù)或兩者技術(shù)相結(jié)合用在植物分類、遺傳多樣性分析、親緣關(guān)系鑒定等方面的研究報道較多。高山等采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對源自中國7個省份的38份瓠瓜種質(zhì)進行遺傳多樣性分析，12個ISSR引物共擴增出96條多態(tài)性帶，多態(tài)性比例為83.5%，聚類分析將供試的38份種質(zhì)分為4個類群8組［6］;在進行遺傳多樣性分析和親緣關(guān)系鑒定研究中，形態(tài)學(xué)方法傳統(tǒng)而又直觀，DNA標(biāo)記則相反，穩(wěn)定性較好，已發(fā)展成為植物種質(zhì)資源研究的重要手段。楊懋勛等通過形態(tài)學(xué)方法對野百合及其變種百合進行了分析［7］。Wolfe等研究表明，采用ISSR分子標(biāo)記能靈敏地揭示遺傳關(guān)系十分相近個體間的差異［8］。

本文應(yīng)用形態(tài)學(xué)分析結(jié)合ISSR標(biāo)記技術(shù)鑒定了蘇麻的親緣關(guān)系，形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果表明了供試蘇麻為紫蘇屬紫蘇(原變種)，3份供試紫蘇為紫蘇屬野生紫蘇，即蘇麻與3份紫蘇屬于同種的不同變種。分析其遺傳相似性系數(shù)得出4份供試材料的遺傳相似性系數(shù)1.01～8.20，平均為2.71，且紫蘇3與紫蘇4的遺傳相似性系數(shù)最高，為8.20。親緣關(guān)系聚類圖顯示了4份供試材料之間的遺傳距離范圍為0.35～0.53，在遺傳距離為0.53處，4份供試材料可分為兩個類群份供試材料可聚為兩組，其中蘇麻為一組，其余3份紫蘇聚為一組，這個類群的種質(zhì)親緣關(guān)系很近，遺傳距離在0.09以內(nèi)。此外，3份紫蘇莖均為紫色、花萼結(jié)果時均增大不明顯，主要區(qū)別在于紫蘇1葉緣具尖鋸齒，而紫蘇2和紫蘇3葉緣均無齒。在遺傳距離0.44處，這3份紫蘇可分為兩個類群，紫蘇1聚為一類，紫蘇2和紫蘇3聚為一類，遺傳距離在0.09以內(nèi)，且紫蘇2和紫蘇3親緣關(guān)系最近，遺傳距離為0.01。ISSR聚類分析結(jié)果不僅與形態(tài)學(xué)鑒定的結(jié)果一致，且能更準(zhǔn)確、更有效的對4份供試材料進行親緣關(guān)系鑒定。近來，季祥彪等應(yīng)用形態(tài)學(xué)結(jié)合分子標(biāo)記技術(shù)研究貴州12種蘭屬植物資源的結(jié)果也證明了這一點［8］。本研究利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定方法，能很好地把紫蘇(原變種)和野生紫蘇明顯區(qū)分開來。實際上，現(xiàn)行的任何一種檢測技術(shù)都不是萬能的，但都能提供許多有價值的信息，應(yīng)該注重它們的協(xié)同性。

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