朱緒輝 薛文瑞 張 強 王 偉 張際青 張小東 胡小鵬

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽醫(yī)院泌尿外科，首都醫(yī)科大學(xué)泌尿外科研究所，北京100020)

器官保存的最主要目的是使移植器官在延長的缺血時間的情況下具有良好的生存力和質(zhì)量。大多數(shù)移植器官采用靜止的冷藏保存，而隨著心臟死亡捐獻的器官和邊緣性器官應(yīng)用的增加，機器灌注的保存方法也引起了臨床醫(yī)生的關(guān)注。目前認(rèn)為，心臟死亡后捐獻的器官以及擴大標(biāo)準(zhǔn)的捐獻器官對缺血損傷更敏感而機器灌注可能使之更加受益［1-2］。本研究采用荷蘭INDES公司生產(chǎn)的AirdriveTM持續(xù)機器灌注儀，探討其對犬腎低溫缺血損傷的保護作用?，F(xiàn)報告如下:

1 對象與方法

1.1 實驗動物

健康草犬1只，由首都醫(yī)科大學(xué)實驗動物部提供，實驗動物許可證號:27801，犬齡3歲，體質(zhì)量13 kg，雄性。術(shù)前24 h禁食，自由飲水。

1.2 器材和藥品

AirdriveTM持續(xù)機器灌注儀由荷蘭INDES公司提供。灌注液使用UW液。

1.3 手術(shù)方法和供腎保存方法

經(jīng)草犬小腿前靜脈建立靜脈通路，靜脈誘導(dǎo)麻醉后，氣管插管吸入全身麻醉。建立中心靜脈輸液通路。取腹部正中切口，逐層切開，采用腹主動脈插管原位灌注法，灌注液溫度維持在0～4℃，灌注壓9.8 kPa。待灌至腎臟呈均勻灰白色后切取雙側(cè)腎臟。將獲取的2只腎臟分別用普通低溫保存和持續(xù)機器灌注低溫保存。普通低溫保存的腎臟浸泡在冰水混合的HCA器官保存液中，并置于4℃的低溫房間內(nèi)存放。持續(xù)機器灌注保存的腎臟則置于AirdriveTM持續(xù)機器灌注儀中，該儀器置于室溫下存放。

1.4 觀察項目

1.4.1 組織病理學(xué)檢查

2組腎臟均于保存0、12、24以及48 h后取檢，每個時間點分別取不同部位的組織6塊，分成不同的2組進行配對比較，即普通低溫保存組和持續(xù)機器灌注組，部分腎組織用10%甲醛固定，梯度乙醇脫水，修剪后石蠟包埋切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，采用光學(xué)顯微鏡觀察其病理學(xué)改變。

1.4.2 電鏡檢查

觀察腎組織在不同保存方法的情況下，保存不同時間后(0、12、24、48 h)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化，每個時間點分別取不同部位的組織6塊，分成不同的兩組進行配對比較，即普通低溫保存組和持續(xù)機器灌注組)。將標(biāo)本切成70～80 nm大小，按常規(guī)方法制成電鏡觀察標(biāo)本，用日立H-7000透射電鏡觀察。

1.4.3 腎皮質(zhì)線粒體活性測定

在不同時間段取腎臟皮質(zhì)標(biāo)本，每個時間點(0、12、24、48 h)分別取不同部位的組織6塊，分成不同的2組進行配對比較，即普通低溫保存組和持續(xù)機器灌注組)，稱質(zhì)量，制備勻漿。差速離心法分離線粒體，制成線粒體懸液，雙縮脲法測定其蛋白質(zhì)量濃度。Clark氧電極法測定線粒體活性。反應(yīng)室加線粒體懸液后，依次加入呼吸鏈反應(yīng)底物0.5 mol/L、琥珀酸20 μL及50 mmol/L二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)10 μL，分別出現(xiàn)Ⅱ態(tài)及Ⅲ態(tài)呼吸，待 ADP完全磷酸化后，出現(xiàn)Ⅳ態(tài)呼吸，連續(xù)描記四態(tài)呼吸曲線。根據(jù)反應(yīng)室體積和氧飽和度計算記錄紙每小格代表的氧含量 ，Ⅲ態(tài)或Ⅳ態(tài)耗氧速率(R3或R4)=每小格氧含量×Ⅲ態(tài)或Ⅳ態(tài)每分鐘耗氧格數(shù)(nmol/min)。計算線粒體呼吸控制率(respiratory control ratio，RCR=R3/R4)和磷氧比 (phosphorus oxygen ratio，P/O=ADP量/Ⅲ態(tài)耗氧量 )。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，同一時間點2組間差異用配對t檢驗方法分析比較。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2組保存不同時間供腎腎組織病理學(xué)改變

0～24 h腎組織的結(jié)構(gòu)基本相似。但48 h后，普通低溫保存的腎臟出現(xiàn)較明顯的改變，其中腎小管上皮細(xì)胞的改變比腎小球更為明顯。

實驗前，腎小球未見顯著變化，腎小管上皮部分空泡變性，部分上皮刷狀緣脫落，細(xì)胞扁平，間質(zhì)未見顯著改變。

對照組48 h，腎小球毛細(xì)血管輪廓模糊，小管上皮廣泛的中、重度變性，可見數(shù)個小灶狀小管壞死。

實驗組48 h，腎組織結(jié)構(gòu)改變輕微，可見輪廓清晰的腎小球、腎小管，除少量腎曲管輕度濁腫外，大部 分腎曲管結(jié)構(gòu)正常，詳見圖1。

圖1 腎組織切片HE染色Fig.1 HE staining of histologic sections(200×)

2.2 電鏡檢查結(jié)果

0～24 h腎組織電鏡圖像基本一致。但48 h后，普通低溫保存的腎臟出現(xiàn)較明顯的形態(tài)學(xué)改變，腎小管及腎小球的基膜厚度不均一。細(xì)胞內(nèi)褶明顯減少且紊亂。腎小管個別上皮細(xì)胞核出現(xiàn)核固縮，核緣呈鋸齒狀。線粒體基質(zhì)的電子密度明顯減低，嵴數(shù)量減少且排列紊亂，尤以近曲小管上皮更為顯著。上皮細(xì)胞的改變比腎小球更為明顯。

對照組48 h，核嚴(yán)重變形、核質(zhì)固縮，核膜不規(guī)整，線粒體顯著腫脹，嵴斷裂、溶解明顯，微絨毛分布散亂，大片脫落。

實驗組48 h，核形大致正常，核質(zhì)分布均勻，線粒體輕微腫脹，但嵴排列尚良好，個別嵴膜間隙略增寬。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)亦有輕度腫脹。近曲小管上皮細(xì)胞微絨毛水腫、增粗，個別脫落。毛細(xì)血管內(nèi)皮與濾過膜內(nèi)皮細(xì)胞輕微水腫，結(jié)構(gòu)尚清，詳見圖2。

2.3 線粒體活性改變

隨著低溫保存時間延長，持續(xù)機器灌注組和普通低溫保存組腎皮質(zhì)線粒體功能均明顯降低。保存12～48 h，普通低溫保存組Ⅲ態(tài)呼吸呼吸耗氧速率下降明顯且顯著低于持續(xù)機器灌注組(P＜0.05)。48 h普通低溫保存組較持續(xù)機器灌注組Ⅳ態(tài)呼吸耗氧顯著增加(P＜0.05)，余時間點2組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，圖3);48 h持續(xù)機器灌注組較普通低溫保存組皮質(zhì)RCR、P/O顯著增高，余時間點2組間比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖4)。

3 討論

器官保存是器官移植學(xué)的三大技術(shù)支柱之一。理想的保存方法能為離體器官提供適宜的微環(huán)境，最大限度地延長器官保存時間，一直是器官移植領(lǐng)域研究的熱點［3］。迄今為止，大多數(shù)移植中心仍舊優(yōu)先采用靜止的冷藏保存方法。冷藏保存的原理是應(yīng)用低體溫來降低代謝，通過沖洗器官的血液代之以保存液［4］。機器灌注在冷藏保存常規(guī)應(yīng)用之前就已經(jīng)得到了發(fā)展。機器灌注的原則是應(yīng)用可控的連續(xù)性或者脈沖式的保存液循環(huán)來消除毒性代謝產(chǎn)物，提供營養(yǎng)和氧分。理論上講，機器灌注能夠保護，至少是部分保護器官不受缺血再灌注損傷，因此可以改善移植器官的質(zhì)量［5］。機器灌注的原理是模擬器官在體內(nèi)的環(huán)境，使通過器官的流體不中斷，進而來保護器官。其機制目前仍舊不十分清楚。低體溫機器灌注能夠降低基礎(chǔ)代謝，因此減少氧和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)的消耗。灌注液的循環(huán)是通過管道器械裝置來達到連續(xù)性或者脈沖式的循環(huán)流動。機器灌注至少在理論上能夠提供連續(xù)性的營養(yǎng)和氧分，并且使得毒性代謝產(chǎn)物和自由基能夠被清除掉。機器灌注還能夠通過應(yīng)用實時的藥物和基因治療來改善器官的質(zhì)量［6］。此外，機器灌注還能夠減少血管痙攣并且提供流體和阻力等參數(shù)來評估器官的性能，這對生理條件下脈管的功能保護是非常重要的［7］。

圖2 電子顯微鏡圖像Fig.2 Electron microscope images(1 000 ×)

圖3 腎皮質(zhì)線粒體呼吸Ⅲ、Ⅳ態(tài)耗氧速率改變Fig.3 Changes in oxygen consumption rates of state Ⅲ and Ⅳ respirations in renal cortex mitochondria

圖4 腎皮質(zhì)線粒體功能變化Fig.4 Changes in mitochondrial function of renal cortex

研究［8］表明，在低溫保存中加強對線粒體功能的保護，能明顯減輕低溫缺血/再灌注損傷，提高器官保存效果。而線粒體通透性轉(zhuǎn)變(mitochondrial permeability transition，MPT)是低溫保存期間和再灌注后細(xì)胞凋亡和壞死信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵事件。因此本實驗把低溫保存期間線粒體形態(tài)功能改變作為反映保存效果的重要指標(biāo)。線粒體Ⅲ態(tài)呼吸反映ADP對呼吸鏈活性的控制，Ⅳ態(tài)呼吸反映無ADP存在的情況下呼吸鏈耗氧速率，RCR反映線粒體結(jié)構(gòu)完整性及整體功能，P/O則反映其氧化釋放能量轉(zhuǎn)化為ATP的效率。上述指標(biāo)常用于器官低溫保存中監(jiān)測細(xì)胞損傷［9-10］。隨低溫缺血損傷加重，普通低溫保存組皮質(zhì)線粒體Ⅲ態(tài)呼吸耗氧速率下降，導(dǎo)致RCR、P/O明顯低于持續(xù)機器灌注組。這說明持續(xù)機器灌注對線粒體低溫缺血損傷的保護作用比普通低溫保存強。2組多個時間點Ⅳ態(tài)呼吸耗氧增加可能與呼吸鏈解偶聯(lián)后，線粒體為維持自身膜電位病理性耗氧增加有關(guān)。研究［11］發(fā)現(xiàn)，脈沖式灌注與血流依賴的脈管內(nèi)皮基因的表達相關(guān)。在這些基因中KLF2(Kruppellike factor 2)可能通過抑制前炎性反應(yīng)、減少固有免疫系統(tǒng)的活化而在保護內(nèi)皮方面發(fā)揮重要的作用［12］。盡管如此，目前機器灌注的機制仍舊不十分明了。

總之，隨著使用邊緣器官的增多，持續(xù)機器灌注的應(yīng)用必將得到進一步的推廣和廣泛應(yīng)用。而對于機器灌注保存，隨著其機制的不斷被發(fā)現(xiàn)，必將會更好的達到保護供體器官的目的。

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