鐘姣姣，李萬林，劉軍海

（陜西理工學(xué)院化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，陜西漢中723001）

向日葵是菊科屬植物，又名葵花、向陽花等[1]。它喜陽，耐旱。 其葉子形狀為心狀卵形或卵圓形。向日葵葉可分為子葉和真葉，其中真葉在莖下部1～3 節(jié)，常為對(duì)生，以上則為互生[2]。 向日葵葉子中含有新綠原酸、異綠原酸、綠原酸等化學(xué)成分，在中草藥中具有重要的藥用價(jià)值，對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌作用，也可作為抗瘧藥，同時(shí)還是治療高血壓、頭痛、頭暈、胃脘脹滿、腹痛等癥狀的有效原料。

綠原酸又名咖啡鞣酸，化學(xué)名為3-O-咖啡酰奎尼酸，分子式為C16H18O9，分子量為345.30。研究表明，綠原酸藥理活性很強(qiáng)，具有利膽、抗菌、降壓、增加白血球、興奮中樞神經(jīng)系統(tǒng)、抗腫瘤、降脂、清除自由基等多種藥理作用，對(duì)消化系統(tǒng)、血液系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)疾病均有顯著療效[3]。 它在醫(yī)藥、食品、化妝品、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。目前綠原酸的提取方法已有水提法、醇提法等，但對(duì)混合溶劑提取方法的研究還較少。 采用微波輔助提取法，操作簡單，可縮短生產(chǎn)周期，利用微波具有穿透能力強(qiáng)、選擇性高、加熱效率高等特點(diǎn)[4-5]，可使向日葵葉細(xì)胞內(nèi)的有效成分快速溶出。 本實(shí)驗(yàn)可為建立一種有效提取向日葵葉中綠原酸的方法及抗氧化性的研究，并為向日葵葉總綠原酸的提取提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

向日葵葉：采摘于漢中市鎮(zhèn)巴縣某山區(qū)，需洗凈、55 ℃烘干、粉碎。

綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品：西安小草植物科技有限公司；乙醇、丙酮、PBS 緩沖液（pH ＝7.4）、硫酸亞鐵、鄰二氮菲、Vc（抗壞血酸）、過氧化氫等，均為市售分析純。

1.2 儀器

Cary-50 紫外分光光度計(jì) （美國瓦里安公司）； DGG-9140B 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海森信公司）；FW-177 型中草藥粉碎機(jī) （天津市泰斯特公司）；GR-200 型電子天平 （日本AND 公司）；HH-2 型電熱恒溫水浴鍋 （北京科偉興漢有限公司）；YC7134 油泵（溫嶺市速力電機(jī)廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品最大吸收波長及標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

1.3.1.1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的最大吸收波長

準(zhǔn)確稱取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，用無水乙醇定容至50 mL 容量瓶中。 以無水乙醇作參比液，在250 ～500 nm 范圍內(nèi)掃描，測定吸光度，篩選最大波長。以綠原酸吸收波長為橫坐標(biāo)，以不同波長下的吸光度為縱坐標(biāo)，制作綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的吸收波長光譜（圖1）。 由圖1 可知，綠原酸在329.9 nm處有最大吸收峰。 因此，應(yīng)該選用329.9 nm 為綠原酸的最大吸收波長。

圖1 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品的吸收波長光譜

1.3.1.2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制方法[6]

準(zhǔn)確稱取經(jīng)55 ℃干燥至恒重的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品1 mg，置于50 mL 的容量瓶中，加適量的無水乙醇，使其充分溶解，再用無水乙醇定容至刻度線處，搖勻，即可得濃度為20 μg／mL 的綠原酸標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照品。精確移取綠原酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0 mL 分別置于10 mL的容量瓶中，分別用乙醇定容至刻度線處，搖勻，以無水乙醇為參比液，按分光光度法，在最大吸收波長329.9 nm 處測定其吸光度。

1.3.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以吸光度A 為縱坐標(biāo)，以綠原酸濃度C 為橫坐標(biāo)繪制綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到吸光度A 與綠原酸 濃 度C 之 間 滿 足A ＝0.0394C+0.1125 （R2＝0.9995）的標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。

圖2 綠原酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2 向日葵葉中綠原酸的提取工藝流程

向日葵葉恒溫干燥→粉碎處理→過60 目篩→設(shè)定參數(shù)浸泡→微波輔助處理→過濾→抽濾→收集濾液。

1.3.3 綠原酸提取率的計(jì)算公式

取錐形瓶中濾液，將其稀釋后測量吸光度并帶入下式計(jì)算向日葵葉中綠原酸的提取率。

上式中：

W：向日葵葉中綠原酸提取率；

A：所測的吸光度；

N：綠原酸溶液稀釋倍數(shù)；

V：綠原酸濾液體積／mL；

M：向日葵葉粉末的質(zhì)量／g。

1.3.4 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素的試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以提取率為指標(biāo)，選擇L16（45）設(shè)計(jì)表進(jìn)行正交試驗(yàn)。 正交試驗(yàn)因素水平見表1。

表1 L16（45）正交試驗(yàn)因素水平表

1.3.5 向日葵葉提取物抗氧化性的測定[7]

采用鄰二氮菲-Fe2+氧化法，在10 mL 具塞試管中依次加入0.2 mL 濃度為7.5 mmol·L-1的鄰二氮菲溶液，2.0 mL pH ＝7.4 的PBS 緩沖液，0.2 mL 濃度為7.5 mmol·L-1的FeSO4和2 mL 綠原酸提取物不同濃度的樣品溶液，最后再加入1.0 mL 0.1%H2O2，每次加入試劑均需搖勻，使溶液充分混合，于40 ℃水浴中靜置反應(yīng)60 min 后，在329.9 nm 處測定吸光度值。 根據(jù)測定的吸光度值按下式計(jì)算羥自由基的清除率：

式中：

A0：不含樣品，只含H2O2時(shí)的吸光度值；

A1：不含樣品，只含蒸餾水代替H2O2時(shí)的吸光度值；

A2：含樣品的吸光度值。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的比較

選取水、乙醇、丙酮、乙醇-丙酮四種溶劑作為提取劑，濃度都為99%，配制乙醇：丙酮體積比為1∶1，在料液比1∶15（向日葵粉末與體積分?jǐn)?shù)為65%的乙醇配比）、 微波功率300 W、 微波溫度60 ℃、 浸泡時(shí)間120 s 的微波處理?xiàng)l件下分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。按照1.3.3 測其吸光度，并計(jì)算提取率。研究了提取溶劑對(duì)向日葵葉中綠原酸提取率的影響，如圖3。

圖3 不同溶劑提取向日葵葉中綠原酸的比較

如圖3 可知，水提法提取向日葵葉中綠原酸提取率最低，乙醇提取法提取率次之，丙酮、乙醇-丙酮混合溶劑提取法提取率相近，都相對(duì)較高。水提法提取率低，可能是由于水的溫度較高使其他物質(zhì)溶出較多，且給分離帶來了困難；醇提法提取率相對(duì)高，可能是由于在醇溶液中，酶催化分解綠原酸作用受到抑制，使向日葵葉中綠原酸提取率降低。綠原酸更易溶于丙酮，考慮到試劑的價(jià)格較高，故采用乙醇溶劑為宜。

2.2 單因素結(jié)果與分析

2.2.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)向日葵葉中綠原酸提取率的影響

準(zhǔn)確稱取3 g 向日葵葉粉末，在微波處理時(shí)間為5 min、pH 值為7 的恒定條件下，控制微波功率為300 W、微波溫度為60 ℃、料液比為1∶15、浸泡時(shí)間為120 s，分別研究在乙醇體積分?jǐn)?shù)為55%、60% 、65%、70%、75%時(shí)對(duì)向日葵葉中綠原酸提取率的影響。

表2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)向日葵葉中綠原酸提取率的影響

由表2 可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)小于65%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，向日葵葉的綠原酸提取率有顯著的提高，因?yàn)橄蛉湛~中綠原酸的極性更接近體積比為65%乙醇溶劑的極性； 超過乙醇體積分?jǐn)?shù)65%時(shí)，提取率反而降低，可能是由于此時(shí)的乙醇中溶解了其他的物質(zhì)導(dǎo)致綠原酸提取率下降，故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)65%為宜。

2.2.2 微波功率對(duì)向日葵葉中綠原酸提取率的影響

準(zhǔn)確稱取3 g 向日葵葉粉末，在微波處理時(shí)間為5 min、pH 值為7 的恒定條件下，控制乙醇體積分?jǐn)?shù)為65% 、微波溫度為60 ℃、料液比為1∶15 g／mL、浸泡時(shí)間為120 s，分別研究在微波功率為100 W、200 W、300 W、400 W、500 W 時(shí)對(duì)向日葵葉中綠原酸提取率的影響。

表3 不同微波功率對(duì)向日葵葉中綠原酸提取率的影響

由表3 可知，微波功率小于300 W 時(shí)，向日葵葉中綠原酸的提取率隨微波功率的升高而增加，這可能是由于強(qiáng)大的內(nèi)壓及分子間的摩擦力使向日葵葉細(xì)胞膜破裂綠原酸溶解速度加快，提取率增大；當(dāng)微波功率超過300 W 時(shí)，提取率隨功率的升高反而下降，這可能是由于微波功率過大產(chǎn)生的局部過熱現(xiàn)象使綠原酸變性，從而使提取率下降。 故選擇微波功率300 W 為最佳。

2.2.3 微波溫度對(duì)向日葵葉中綠原酸提取率的影響

準(zhǔn)確稱取3 g 向日葵葉粉末，在微波時(shí)間為5 min、pH 值為7 的恒定條件下，控制乙醇體積分?jǐn)?shù)為65% 、微波功率為300 W、料液比為1∶15 g／mL、浸泡時(shí)間為120 s，分別研究在微波溫度為50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃時(shí)對(duì)向日葵葉中綠原酸提取率的影響。

表4 不同微波溫度對(duì)向日葵葉中綠原酸提取率的影響

由表4 可知，微波溫度小于60 ℃時(shí)，向日葵葉中綠原酸的提取率隨微波溫度的升高而加速上升，因?yàn)闇囟壬?，分子運(yùn)動(dòng)加快，使得細(xì)胞破裂，進(jìn)一步導(dǎo)致向日葵葉中綠原酸的溶解及擴(kuò)散速度加快，提取率顯著提高。微波溫度繼續(xù)增加時(shí)提取率反而下降，可能是因?yàn)橄蛉湛~中綠原酸隨著溫度的升高一部分有效成分被分解。 故選擇微波溫度60 ℃為宜。

2.2.4 料液比對(duì)向日葵葉中綠原酸提取率的影響

準(zhǔn)確稱取3 g 向日葵葉粉末，在微波處理時(shí)間為5 min、pH 值為7 的恒定條件下，控制乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%、 微波功率為300 W、 微波溫度為60 ℃、浸泡時(shí)間為120 s，分別研究在料液比為1∶5 g／mL、1∶10 g／mL、1∶15 g／mL、1∶20 g／mL、1∶25 g／mL 時(shí)對(duì)向日葵葉中綠原酸提取率的影響。

表5 不同料液比對(duì)向日葵葉中綠原酸提取率的影響

由表5 可知，隨著料液比的增加，向日葵葉中綠原酸提取率不斷增加，當(dāng)溶劑用量達(dá)到1∶20 g／mL 時(shí)，向日葵葉中綠原酸已基本溶出，再增加溶劑用量，提取率的增加幅度不大，考慮到成本問題，選擇料液比1∶20 g／mL 為宜。

2.2.5 浸泡時(shí)間對(duì)向日葵葉中綠原酸提取率的影響

準(zhǔn)確稱取3 g 向日葵葉粉末，在微波處理時(shí)間為5 min、pH 值為7 的恒定條件下，控制乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%、微波功率為300 W、微波溫度為60℃、料液比為1∶20 g／mL，分別研究在浸泡時(shí)間為60 s、90 s、120 s、150 s、180 s 的條件下對(duì)向日葵葉中綠原酸提取率的影響。

表6 不同浸泡時(shí)間對(duì)向日葵葉中綠原酸提取率的影響

由表6 可知，浸泡時(shí)間對(duì)向日葵葉中綠原酸提取率有一定的影響，浸泡時(shí)間過短時(shí)，則綠原酸還未完全溶解，提取率低；浸泡時(shí)間過長，提取溶劑揮發(fā)，使提取率變低；當(dāng)浸泡時(shí)間為150 s 時(shí)，綠原酸的溶解基本達(dá)到平衡，提取率最高。故選擇浸泡時(shí)間以150 s 為宜。

2.3 正交試驗(yàn)對(duì)向日葵葉中綠原酸提取工藝的優(yōu)化

在單因素的基礎(chǔ)上，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、微波功率（B）、微波溫度（C）、料液比（D）、浸泡時(shí)間（E）為影響因素，以提取率為指標(biāo)，選擇L16（45）進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交結(jié)果見表7。

表7 正交試驗(yàn)結(jié)果

由直觀分析圖可知，各因素對(duì)向日葵葉中綠原酸微波提取工藝的影響順序?yàn)榻輹r(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)＞微波溫度＞微波功率＞料液比，最佳提取工藝條件為A3B3C3D2E3，即浸泡時(shí)間為150s，微波溫度為60 ℃，微波功率為300 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，料液比為1∶15 g／mL 時(shí)，在最佳因素組合的條件下進(jìn)行三次平行實(shí)驗(yàn)，提取率分別為3.802%、3.801%、3.804%，取其平均值，得最優(yōu)組合的提取率為3.802%。

2.4 向日葵葉提取物抗氧化性測定

稱取向日葵葉粉末5 g 置于圓底燒瓶中，配制乙醇體積分?jǐn)?shù)為65%，在料液比為1∶15 g／mL 時(shí)，浸泡150 s，設(shè)溫度60 ℃條件下微波處理5 min（最佳工藝條件），趁熱過濾，抽濾得綠原酸提取液，配制成不同濃度的樣品溶液，以相同濃度的Vc 作陽性對(duì)照品。 用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定向日葵葉提取液清除·OH 的能力。 重復(fù)上述步驟，結(jié)果如圖4。

圖4 Vc、向日葵葉中綠原酸提取液對(duì)·OH 的清除率

測定得向日葵中綠原酸提取液和Vc 對(duì)·OH的最大清除率分別為74.30%、 80.49%，且隨著濃度的增加，清除率也不斷增加。 結(jié)果表明，綠原酸提取液對(duì)向日葵葉有較強(qiáng)的抗氧化性，且比Vc的抗氧化能力強(qiáng)。

3 結(jié)語

（1）向日葵葉中富含綠原酸，是一種可利用的綠原酸資源。通過單因素實(shí)驗(yàn)、正交實(shí)驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝得出最優(yōu)組合為浸泡時(shí)間150 s，微波溫度60 ℃，微波功率300 W，乙醇體積分?jǐn)?shù)65%，料液比1∶15 g／mL 時(shí)，可達(dá)到最佳提取效果。在此最佳工藝組合下，向日葵葉中綠原酸的提取率可達(dá)3.802%。

（2）用鄰二氮菲-Fe2+氧化法測定了最佳工藝條件下向日葵葉中綠原酸提取液對(duì)·OH 的清除率為80.49%，結(jié)果表明，向日葵葉中綠原酸提取液具有較好的抗氧化性，為綠原酸及其功能性成分的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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