徐雙波，虞麗華，秦天牧，魏 昕

0 引 言

齲病是在以細(xì)菌為主的多種因素影響下，牙體硬組織發(fā)生的慢性進(jìn)行性破壞性疾病。齲病主要致病機(jī)制是菌斑內(nèi)的致齲菌代謝碳水化合物產(chǎn)酸，造成局部微環(huán)境的PH值下降。酸進(jìn)入牙齒硬組織，導(dǎo)致局部硬組織脫礦，羥磷灰石溶解破壞，無(wú)機(jī)鈣、磷移出［1］。變異鏈球菌是公認(rèn)的齲病致病菌，致齲性主要取決于產(chǎn)酸性和耐酸性［2］。變異鏈球菌通過(guò)細(xì)菌表面黏結(jié)素，識(shí)別唾液膜內(nèi)的蛋白質(zhì)受體-唾液凝集素、酸性富脯蛋白并發(fā)生特異性結(jié)合而介導(dǎo)變異鏈球菌黏附定居于牙面，形成牙菌斑，利用碳水化合物產(chǎn)酸，致牙齒局部環(huán)境PH值下降，釉質(zhì)脫礦，進(jìn)而產(chǎn)生齲?。?］。

變異鏈球菌的致病性受多種因素影響，如營(yíng)養(yǎng)、溫度、局部理化特點(diǎn)等，也受來(lái)自外環(huán)境的化學(xué)分子的影響［4］。Farnesol是一種具有生物活性的化學(xué)分子，分子式是C15H26O，它能抑制多種微生物的生長(zhǎng)，如金黃色葡萄球菌［5］、表皮葡萄球菌［6］，也可抑制白色念珠菌酵母相向菌絲相的轉(zhuǎn)變，并抑制白色念珠菌生物膜的形成［7］。本研究通過(guò)不同濃度Farnesol處理變異鏈球菌生物膜，掃描電鏡觀察牙釉質(zhì)上附著的生物膜，采用顯微硬度計(jì)檢測(cè)表面顯微硬度(surface microhardness，SMH)以及粗糙度儀檢測(cè)表面粗糙度(Ra)，研究Farnesol作用變異鏈球菌后其脫礦能力的改變。

1 材料與方法

1.1 研究試劑和儀器 心腦浸液培養(yǎng)基(BHI培養(yǎng)基)，BHI溶液(含1%蔗糖)，E和E-Farnesol(Sigma公司，美國(guó))。變異鏈球菌UA159由中國(guó)微生物研究所惠贈(zèng)。

低速金剛砂切片機(jī)(Isomet ILL，Evanston，Buehler Ltd，美國(guó))，顯微硬度計(jì)(DHV-1000，上海尚材試驗(yàn)機(jī)有限公司)，掃描電子顯微鏡(LEO 1530 VP，德國(guó))，表面粗糙度儀(TR240型，北京時(shí)代集團(tuán)公司)，低溫高速離心機(jī)(EPENDORF，德國(guó))，紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)(BIOMETRA，德國(guó))，YCP系列二氧化碳培養(yǎng)箱(易亮醫(yī)療器械有限公司，上海)。

1.2 實(shí)驗(yàn)牙的選擇和牙釉質(zhì)片的預(yù)備 選擇因正畸減數(shù)而拔除的下頜前磨牙，要求無(wú)齲壞、無(wú)發(fā)育不良等疾患。體視顯微鏡下觀察釉質(zhì)無(wú)白斑、無(wú)裂痕，牙齒拔下后，等滲鹽水沖洗干凈，放入4℃冰箱保存，于拔牙后1周內(nèi)使用。

將30顆牙使用低速金剛砂切片機(jī)分離冠根，取牙冠的長(zhǎng)軸方向切割出厚度約2mm的釉質(zhì)片，在釉質(zhì)片表面形成實(shí)驗(yàn)開窗區(qū)(4 mm×4 mm)，非實(shí)驗(yàn)區(qū)域用防酸指甲油雙層封閉，牙釉質(zhì)片用70%乙醇消毒，然后用無(wú)菌去離子水沖洗，并用紫外燈照射60 s(正反面各30 s)。

1.3 細(xì)菌生物膜形成和Farnesol處理［8］將-80℃保存的變異鏈球菌復(fù)蘇，傳代至BHI液體培養(yǎng)基中，在37℃厭氧(80%N2、20%C02)條件下培養(yǎng)48h，取6支培養(yǎng)試管，在其中加入等量的菌懸液(30 μL)，懸液經(jīng)離心機(jī)3100×g，離心5min，棄上清后調(diào)整菌懸液濃度為5×108CFU/mL。實(shí)驗(yàn)分為 5組，即變鏈 +0 μmol/L Farnesol組、變鏈 +50 μmol/L Farnesol組、變鏈 +100 μmol/L Farnesol組、變鏈+200μmol/L Farnesol組和對(duì)照組。Farnesol處理組含有1.5 mL標(biāo)準(zhǔn)菌懸液，分別加入濃度為 0、50、100、200 μmol/L 的 Farnesol，對(duì)照組中加入1.5mL、無(wú)菌去離子水。將預(yù)備好的牙釉質(zhì)片置于24孔板中，加入菌懸液培養(yǎng)，37℃靜置培養(yǎng)。變異鏈球菌黏附在牙釉質(zhì)片表面形成生物膜。

24、48、72 h 3個(gè)時(shí)間點(diǎn)換液，分別取出24孔板中菌懸液，加入新鮮的BHI培養(yǎng)液(含1%蔗糖)，同時(shí)加入相應(yīng)劑量Farnesol，維持實(shí)驗(yàn)組50、100、200 μmol/L的Farnesol濃度。

1.4 掃描電鏡觀察 將上述5組牙釉質(zhì)片從24孔板中取出，干燥后固定于樣品臺(tái)，鍍膜，掃描電鏡觀察。

1.5 顯微硬度值測(cè)定 將上述5組牙釉質(zhì)片用無(wú)菌去離子水沖洗吹干，分別在實(shí)驗(yàn)前后測(cè)定釉質(zhì)的SMH值。牙釉質(zhì)片用特制的夾具固定，找平，用維氏金剛錐壓頭，加載0.980 7 N的負(fù)荷，持續(xù)打壓牙片開窗區(qū)15 s，使其形成壓痕，通過(guò)分析系統(tǒng)測(cè)量壓痕的兩對(duì)角線長(zhǎng)度，計(jì)算出硬度值，標(biāo)本內(nèi)每個(gè)釉面測(cè)量5次，取平均值作為該樣本的硬度值，單位為HV(N/mm2)。實(shí)驗(yàn)后采用同樣方法進(jìn)行釉質(zhì)標(biāo)本開窗處的顯微硬度測(cè)試。

1.6 表面粗糙度檢測(cè) 用表面粗糙度儀測(cè)定試樣釉面粗糙度，測(cè)定參數(shù)為取樣長(zhǎng)度內(nèi)輪廓偏距的算術(shù)平均值(Ra)，每個(gè)試樣表面測(cè)3個(gè)區(qū)域，每個(gè)區(qū)域取5個(gè)測(cè)試段，每段取樣長(zhǎng)度為0.25mm，結(jié)果取平均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)前后的SMH的比較選用配對(duì)t檢驗(yàn)，各組SMH及粗糙度值之間比較選用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK法。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Farnesol對(duì)釉質(zhì)表面變異鏈球菌生物膜的影響 掃描電鏡結(jié)果顯示，釉質(zhì)表面覆蓋一層較厚的變異鏈球菌生物膜，其厚度及面積隨著Farnesol濃度的增加而減少。其中變鏈 +0 μmol/L Farnesol組、變鏈 +50 μmol/L Farnesol組、變鏈 +100 μmol/L Farnesol組、變鏈 +200 μmol/L Farnesol組的生物膜厚度均值依次為 45、32、20、6 μm。

2.2 脫礦后釉質(zhì)SMH測(cè)定結(jié)果 各組的實(shí)驗(yàn)前后顯微硬度值、均值及標(biāo)準(zhǔn)差見(jiàn)表1。

結(jié)果表明:實(shí)驗(yàn)前，5組釉質(zhì)片表面SMH值經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，即在實(shí)驗(yàn)前各釉質(zhì)的表面SMH值是相同的。實(shí)驗(yàn)后，4組實(shí)驗(yàn)組釉質(zhì)表面硬度都有減低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。實(shí)驗(yàn)組SMH值的降低較對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。變鏈 +0 μmol/L Farnesol組即未加入Farnesol組SMH值的較其余3實(shí)驗(yàn)組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)，200μmol/L Farnesol組SMH 值明顯高于變鏈 +50 μmol/L Farnesol、變鏈 +100 μmol/L Farnesol組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01)。

圖1 變異鏈球菌生物膜掃描電鏡結(jié)果Figure 1 The results of SEM on biofilm of Streptococcus mutans

表1 經(jīng)不同處理牙釉質(zhì)脫礦后釉質(zhì)SMH測(cè)定結(jié)果(±s，N/mm2)Table 1 Enamel SMH before and after experiment with different solution(±s，N/mm2)

表1 經(jīng)不同處理牙釉質(zhì)脫礦后釉質(zhì)SMH測(cè)定結(jié)果(±s，N/mm2)Table 1 Enamel SMH before and after experiment with different solution(±s，N/mm2)

經(jīng)方差分析可見(jiàn)處理前方差分析F=1.2536，P＞0.05，處理后方差分析 F=7.644 5，P＜0.01，處理前后差值方差分析 F=10.563 4，P ＜0.01

組 別 n 實(shí)驗(yàn)前 實(shí)驗(yàn)后 差值d t值 P值對(duì)照組 30 372.83 ±8.18 368.60 ±7.33 3.98 ±8.20 0.51 0.73變鏈 +50 μmol/L 組 30 367.48 ±8.63 224.63 ±18.98 150.59 ±4.85 9.86 ＜0.01變鏈 +100 μmol/L 組 30 369.42 ±10.23 228.06 ±10.40 148.63 ±8.56 18.23 ＜0.01變鏈 +200 μmol/L 組 30 381.53 ±8.35 270.87 ±12.19 115.54 ±6.84 16.83 ＜0.01變鏈 +0 μmol/L 組 30 373.70 ±8.69 198.57 ±8.19 170.46 ±12.03 28.90 ＜0.01

2.3 Farnesol對(duì)釉質(zhì)表面粗糙度的影響 實(shí)驗(yàn)后4組的粗糙度值從大到小依次為變鏈+0 μmol/L Farnesol、變 鏈 +50 μmol/L Farnesol、變 鏈 +100 μmol/L Farnesol、變鏈 +200 μmol/L Farnesol，即隨著Farnesol濃度的增加，釉質(zhì)粗糙度下降，4組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見(jiàn)圖2。

圖2 各組粗糙度值Ra(±s，nm)Figure 2 The roughness of five groups(±s，nm)

3 討 論

齲病的發(fā)生與變異鏈球菌生物膜脫礦密切相關(guān)［9］，目前國(guó)內(nèi)外研究證明Farnesol可抑制變異鏈球菌生物膜內(nèi)酸的產(chǎn)生以及葡萄糖的分解代謝［10］，但Farnesol作用變異鏈球菌后其脫礦能力的影響未得到充分的研究。本研究發(fā)現(xiàn)，加入不同濃度的Farnesol，經(jīng)過(guò)變異鏈球菌生物膜作用72 h后，釉質(zhì)SMH及粗糙度均有顯著變化。對(duì)照組釉質(zhì)粗糙度均值為46.6 nm，經(jīng)過(guò)生物膜作用后，粗糙度均有不同程度的增加，200 μmol/L Farnesol組粗糙度100.35 nm，增加的幅度最小。顯微硬度經(jīng)Farnesol作用后均有不同程度的降低，200 μmol/L Farnesol組顯微硬度值明顯高于其余實(shí)驗(yàn)組。掃描電鏡觀察顯示在同樣的觀察范圍內(nèi)，附著于釉質(zhì)表面的變異鏈球菌生物膜的生長(zhǎng)有差異，200 μmol/L Farnesol組密度及厚度明顯少于其余實(shí)驗(yàn)組。

顯微硬度即顯微壓痕硬度的簡(jiǎn)稱，顯微壓痕硬度測(cè)定是目前測(cè)量釉質(zhì)硬度的主要方法。1983年Featherstone等［11］利用定量顯微放射照相術(shù)測(cè)得牙釉質(zhì)礦物質(zhì)的含量，發(fā)現(xiàn)與顯微硬度計(jì)測(cè)得的硬度值有很好的直線相關(guān)關(guān)系，顯微硬度大，礦化程度就高。ZERO也證明顯微硬度對(duì)于非常早期的釉質(zhì)脫礦具有很強(qiáng)的靈敏性［12］。正?；蛎摰V的釉質(zhì)中，顯微硬度能反映釉質(zhì)的礦化程度及礦物質(zhì)含量的多少。本研究所用標(biāo)本皆為本院因正畸需要拔除的下頜前磨牙，為年輕恒牙，將年齡因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響降到了最低。研究采用隨機(jī)數(shù)字表法分組，減少了牙齒特異性對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，可比性好。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定顯微硬度的變化，來(lái)定量評(píng)價(jià)不同濃度外源性Farnesol對(duì)變異鏈球菌釉質(zhì)脫礦的影響。實(shí)驗(yàn)前各組顯微硬度平均值高于有關(guān)文獻(xiàn)中牙釉質(zhì)表面硬度值［13］，這是由于本實(shí)驗(yàn)中所選的標(biāo)本均為年輕恒牙，均為下頜前磨牙，礦化程度較高。用掃描電鏡對(duì)釉質(zhì)表面的變異鏈球菌生物膜進(jìn)行檢查，發(fā)現(xiàn)生物膜在釉質(zhì)表面的覆蓋面積和厚度并不均勻，一般由幾層細(xì)菌細(xì)胞組成，含有300個(gè)左右的細(xì)菌，厚度為3～45 μm。掃描電鏡觀察生物膜的檢測(cè)方法已被廣為認(rèn)可［14］。

本研究Farnesol濃度梯度的選擇是參照了已有的實(shí)驗(yàn)報(bào)告，研究發(fā)現(xiàn)50～200 μmol/L Farnesol可以不同程度抑制金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)［15］，另有研究證實(shí)Farnesol與微生物的耐藥性存在一定的相關(guān)性，一定濃度的Farnesol可抑制都柏林菌菌株的耐藥性［16］，且隨著 Farnesol(0 ～300 μmol/L)濃度的增高抑制作用逐漸增強(qiáng)。Farnesol對(duì)白念珠菌生物膜的形成也有影響，在300 μmol/L時(shí)則完全抑制白念珠菌導(dǎo)致無(wú)法形成生物膜。當(dāng)Farnesol濃度超過(guò)400 μmol/L，可以誘導(dǎo)變異鏈球菌細(xì)胞的凋亡［15］。

通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，隨著Farnesol濃度的增加，抑制釉質(zhì)表面硬度的降低，表面粗糙度增加，說(shuō)明不同濃度Farnesol對(duì)變異鏈球菌釉質(zhì)脫礦的影響有一定的差異。在Farnesol濃度為200 μmol/L時(shí)作用最強(qiáng)。關(guān)于Farnesol對(duì)變異鏈球菌生物膜脫礦的分子作用機(jī)制，尚須進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

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