馬方奎，包子嫻，陳西廣

（中國海洋大學海洋生命學院，山東 青島 266003）

近年來，阿霉素作為廣譜抗腫瘤藥物，常用于多種癌癥的治療，其對乳腺癌也具有很好的治療效果［1］，但是由于腫瘤多藥耐藥性的存在，影響了阿霉素的抗腫瘤效果。目前針對耐藥腫瘤細胞系來研究解決多藥耐藥性的報道已經(jīng)很多，而納米靶向載體成為克服腫瘤多藥耐藥性和提高藥物靶向的一個重要途徑。Bae等［2］的研究表明，通過納米載體包載阿霉素進行藥物釋放，可以顯著降低阿霉素的毒性和副作用。

聚乳酸羥基乙酸（PLGA）作為FDA認可的生物醫(yī)用材料已經(jīng)被用于大量的臨床試驗，已經(jīng)成功用于多種抗腫瘤化療藥物（尤其是疏水藥物）的載體進行給藥。De等［3］研究利用PLGA包載抗癌藥物紫杉醇，可以顯著增加藥物在4T1腫瘤細胞中的攝取和抑制作用。然而PLGA包載的納米載藥粒子被細胞吞噬系統(tǒng)的快速吞噬，很大程度上影響了PLGA載藥納米粒子的靶向效果。因此PLGA納米載藥運輸?shù)淖畲蟮膯栴}是如何有效規(guī)避網(wǎng)狀內皮系統(tǒng)的吞噬（Reticuloendothelial system，RES）。而這可以通過親水聚合物的表面修飾來改變納米粒子表面的親水性，從而降低納米粒子表面對調理素的吸收，而且減少巨噬細胞的吞噬，提高載藥的靶向性［4］。利用殼聚糖修飾PLGA納米粒子后，進一步用親水性的PEG包被修飾來改變納米粒子表面的親水性，以降低細胞表面對調理素的吸收從而提高靶向性。Hu等［5］報道，無毒且生物相容性好的陽離子聚合物殼聚糖可以促進納米粒子穿過細胞膜進入細胞內，親水性的PEG也被引入額外包被在納米粒子表面提高親水性。

因此，利用殼聚糖與PLGA的共價連接，通過PLGA納米粒子表面殼聚糖的引入來減輕異物排斥反應，降低巨噬細胞對疏水納米粒子的吞噬成為提高載藥納米靶向性的新途徑。本文以人乳腺癌細胞MCF-7作為培養(yǎng)細胞，阿霉素作為抗癌藥物，來研究載藥殼聚糖PLGA納米載體對腫瘤細胞生長的抑制作用，同時對比傳統(tǒng)方法合成的PLGA納米載體和殼聚糖表面修飾PLGA得到的納米載體（C-NPs），對自組裝的殼聚糖PLGA納米載體（G-NPs）作為新型納米抗癌藥物載體用于腫瘤細胞抑制的定性和定量研究，通過熒光觀察腫瘤細胞對納米粒的攝取情況，進而評價G-NPs作為新型納米載體在腫瘤治療方面的應用。

1 材料

1.1 藥品與試劑

殼聚糖（chitosan，CHS，26kDa，DD＝90%），購自山東恒臺縣金湖甲殼制品有限公司；端羧基聚乳酸羥基乙酸（poly（lactic-co-glycolic acid，PLGA，50/50，Mv＝5 000，購自山東省醫(yī)療器械研究所；異硫氰酸熒光素（Fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC）購自Sigma公司；冰醋酸、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉等其他試劑均為分析純；人乳腺癌細胞MCF-7由青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院中心實驗室提供。

1.2 主要儀器設備

VCX 105型超聲儀（美國Uibra公司）；HealForce 90二氧化碳培養(yǎng)箱（河南兄弟儀器設備有限公司）；UV-1601紫外分光光度計（日本Shimadzu公司）；Biotek Synergy2多功能熒光酶標儀（美國Bioteck公司）；XDS-1倒置顯微鏡（南京米厘特精密儀器有限公司）；BX51熒光顯微鏡（日本Olympus公司）。

2 方法

2.1 空白及載藥納米載體的制備

空白PLGA納米粒子的制備參照 Wang等［6］的方法，具體步驟如下：首先，稱取100mg PLGA溶解于5mL二氯甲烷中，然后逐滴加入到含0.5%（w/v）PVA的去離子水中，磁力攪拌器持續(xù)攪拌形成初乳，然后用超聲均質機以800r/min超聲10min，利用旋轉蒸發(fā)儀旋蒸掉有機溶劑得到PLGA納米分散體系，以15 000r/min離心10min，去離子水洗滌3次，重復離心得到的產(chǎn)物凍干備用。

表面修飾的殼聚糖-PLGA納米載體（C-NPs）的制備：稱取100mg制得的PLGA納米粒子分散于5mL MES緩沖液中（pH＝5.0），加入一定量的1－乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC）和N－羥基琥珀酰亞胺（NHS）活化反應一定時間，然后將50mL配置好的0.2%（w/v）殼聚糖溶液加入以上反應體系，室溫下攪拌反應48h，15 000r/min離心10 min后冷凍干燥得到產(chǎn)物C-NPs。在乳化前，將一定量阿霉素預溶于油相二氯甲烷中，即得載阿霉素的PLGA納米粒子和C-NPs。

自組裝的殼聚糖-PLGA納米載體（G-NPs）的制備：稱取100mg PLGA溶解于5mL的二氯甲烷中，將以上溶液滴加入含一定量EDC和NHS的5mL MES緩沖液中（pH＝5.0）冰浴下活化1.5h，然后將50mL配置好的0.2% （w/v）殼聚糖溶液加入到以上反應體系，室溫下攪拌反應48h，旋蒸掉有機溶劑，過濾后以去離子水透析48h去除過量反應底物，冷凍干燥制得聚合物。稱取一定量制備得到的聚合物分散于去離子水中，在冰浴條件下以超聲儀超聲3min（超聲間隔，超3s停2s，功率30%），得到的樣品溶液以0.8μm濾膜過濾后冷凍干燥，即得G-NPs。

載藥G-NPs的制備參照Hyung等［7］的方法，將一定量阿霉素分散于PBS中（pH＝7.4），加入制備得到的聚合物，超聲制備得到包載DOX的G-NPs，實驗過程避光，制得樣品凍干保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 FITC標記的空白納米粒子FITC-C-NPs和FITCG-NPs的制備

分別稱取40mg精制的C-NPs和G-NPs超聲分散于20mL去離子水中，用1mol/L的NaOH調節(jié)pH至7.5。稱取FITC 4mg溶于4mL無水甲醇中，逐滴加入到含CP和GP的去離子水中，室溫避光反應6h后，向反應體系中加入48mL的甲醇/氨水（v/v，7∶3）的混合液，8 000×g離心10min，棄上清液，所得沉淀用甲醇洗滌至濾液在495nm下無熒光吸收為止。冷凍干燥后得黃色目標產(chǎn)物。

2.3 MCF-7細胞對納米粒攝取的定量測定

MCF-7細胞對熒光納米粒攝取的定量測定參照Khin等［8］的方法：取指數(shù)生長期 MCF-7細胞，用胰酶消化后接種于96孔細胞培養(yǎng)板上（100μL/孔，接種密度為3×104個/mL），在37℃、5%CO2、95%濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h至細胞貼壁生長成單層，吸出原培養(yǎng)液，用5mL D-Hank’s緩沖液于培養(yǎng)箱中平衡培養(yǎng)30min，吸除D-Hank’s后，加入不同濃度的以D-Hank’s配置的熒光納米懸液（FITC-C-NPs 和FITC-G-NPs），納米懸液濃度分別為：25，50，100，200，400和800μg/mL，于二氧化碳培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)1，2和4h后，將熒光納米粒懸液吸出，以PBS緩沖液（pH＝7.4）輕輕漂洗3次除去游離納米粒，每孔加入100μL 0.5%的Triton X－100細胞裂解液裂解細胞30min，最后于熒光酶標儀檢測分離得到的細胞裂解液的熒光強度（λex＝485nm，λem＝528nm）。其中未處理的空白細胞作為對照，參照FITC標準曲線計算細胞中的FITC含量，最后根據(jù)公式（1）計算 MCF-7細胞對2種不同濃度的熒光納米粒子的攝取效率（Cellular Uptake Efficiency）：

其中：WF為不同濃度熒光納米粒子處理得到的細胞裂解液中FITC的含量；WS為不同濃度熒光納米粒子中FITC的總含量。

2.4 細胞吞噬熒光納米粒的顯微鏡觀察

MCF-7細胞對FITC-C-NPs和 FITC-G-NPs兩種納米粒的攝取參照Zhang等［9］的方法，取傳代至指數(shù)生長期的MCF-7細胞用0.25%胰酶細胞消化后，分別取1mL/孔接種到6孔培養(yǎng)板中（接種密度為3×104個/mL），在37℃、5%CO2、95%濕度的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h至細胞貼壁生長成單層，每孔加入一定濃度的 FITC-C-NPs和 FITC-G-NPs納米粒溶液，分別于CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)1和4h，培養(yǎng)完成后，用pH＝7.4的PBS緩沖液小心漂洗細胞3次，于熒光顯微鏡下進行觀察并拍照。

2.5 載藥納米粒對腫瘤細胞生長抑制的定量測定

DOX，DOX-PLGA NPs，DOX-C-NPs和 DOX-GNPs對腫瘤細胞生長抑制的定量測定，作者采取MTT法［10］：取指數(shù)生長期 MCF-7細胞，用1mL 0.25%胰酶消化后，加入10mL新鮮培養(yǎng)液（DMEM高糖培養(yǎng)基，10%胎牛血清），取100μL/孔接種于96孔細胞培養(yǎng)板上（接種密度3×104個/mL），在37℃、5%CO2、95%濕度的二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中孵育過夜，至MCF-7細胞貼壁生長成單層后，吸出原培養(yǎng)液，每孔加入不同藥物濃度的3種載藥納米粒溶液（DOX-PLGA NPs、DOX-C-NPs和DOX-G-NPs）和游離阿霉素（200μL/孔，每個濃度設5個平行），用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)液作為陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)一定時間。每孔加入20μL 5mg/mL的MTT溶液反應，繼續(xù)孵育4 h后棄去上清液，每孔加入150μL DMSO，使結晶物充分融解，終止反應，恒溫振蕩反應10min后，在酶標儀490nm處測定培養(yǎng)板各組樣品的吸光度值，按公式（2）計算載藥納米粒對MCF-7細胞生長的相對抑制率（Inhibitory rate of control，IR%）：

其中：ODC為陰性對照組的吸光度值；ODS為樣品處理組的吸光度值。

3 結果與討論

3.1 3種納米載體的合成

經(jīng)乳化方法制備的空白PLGA NPs為圓球形（見圖1）；C-NPs形成的是以PLGA納米球為核心的表面包被殼聚糖的結構；G-NPs則是通過鏈與鏈間共價接枝聚合，在超聲作用下自組裝而成的結構均一的納米粒子。顯然對比C-NPs與G-NPs，兩者雖然都是殼聚糖和PLGA通過酰胺鍵共價連接而成，但由于合成路線和成球方法的差別，兩者具有不同的納米結構，而作為納米載體的納米結構的影響，則可通過結構的穩(wěn)定性，藥物包載和釋放，細胞吞噬效率等研究來分析。

3.2 MCF-7細胞對熒光納米粒攝取的定量測定

圖1 3種納米載體的合成Fig.1 Schematic representation of three differently structured nanoparticles

制備得到的不同濃度C-NPs和G-NPs 2種熒光標記納米粒子在MCF-7細胞中孵育1h后，細胞對納米粒的攝取情況見圖2，隨著納米粒子濃度從25μg/mL升高到400μg/mL，MCF-7細胞對2種熒光納米粒的攝取效率逐漸增加，呈一定的濃度依賴性，C-NPs和GNPs 2種納米粒在細胞孵育1h后的熒光攝取效率沒有明顯差異；而當納米粒子的濃度增加到800μg/mL時，細胞對熒光納米粒的攝取效率開始出現(xiàn)下降，CNPs和G-NPs分別從400μg/mL濃度時的6.74%和6.92%，下降到800μg/mL濃度時的5.36%和5.24%。

圖2 孵育1h后MCF-7細胞對2種不同濃度納米粒子的細胞攝取效率Fig.2 Cellular uptake efficiency of different concentration nanoparticles by MCF-7cells after 1hincubation

研究表明，細胞對納米粒子的攝取主要受納米粒子的濃度、表面電荷、粒徑、形狀及表面修飾基團理化性質的 影 響［11－12］，MTT實驗已經(jīng)表明，C-NPs和 GNPs由于殼聚糖的修飾作用，其相對細胞毒性高于PLGA納米粒子，表明殼聚糖的修飾增加了納米粒子對細胞的黏附作用。殼聚糖主鏈上活性氨基基團質子化后，通過與細胞膜表面負電蛋白的非特異性靜電吸附而促進粒子與細胞的黏附，當納米粒子到達細胞膜后，再通過細胞膜上親水基團或疏水基團與納米粒子之間的相互作用，細胞膜內陷包裹納米粒子進入細胞內。Guan等［13］和 Pamujula等［14］報道殼聚糖親水性和氨基陽離子有助于細胞對納米粒子的黏附，這種黏附作用隨著納米粒子濃度的增加而提高。納米粒子的表面親水性降低了巨噬細胞吞噬系統(tǒng)對納米粒子的吞噬，進一步增加細胞對納米粒子的有效黏附和攝取效率［15］。

因此低濃度條件下（25～400μg/mL），納米粒子表面的親水性和表面電荷促進了MCF-7細胞對2種納米粒子的黏附作用，細胞對2種納米粒子的攝取都呈現(xiàn)出濃度依賴性，隨濃度的升高而增大，而當納米粒濃度增大至800μg/mL時，細胞對納米粒的攝取量逐漸趨近飽和，導致了細胞相對攝取效率下降。

圖3 孵育不同時間后MCF-7細胞對濃度為200μg/mL的2種納米粒的細胞攝取效率Fig.3 Cellular uptake efficiency of different nanoparticles by MCF-7cells incubated for different times with a particle concentration of 200μg/mL

為了進一步研究MCF-7細胞對熒光納米粒子攝取隨時間變化的關系，以濃度為200μg/mL的C-NPs和G-NPs分別孵育細胞1、2、4h后，測定 MCF-7細胞對納米粒子的攝取效率（見圖3）。MCF-7細胞對CNPs和G-NPs的攝取也呈現(xiàn)出時間依賴性，隨著孵育時間的延長，細胞攝取效率逐漸增加，C-NPs從1h的3.59%升高到了4h后的7.33%；G-NPs從1h時的3.71%升高到了4h后的7.51%。

通過測定MCF-7細胞對C-NPs和G-NPs攝取效率隨濃度和時間變化的關系，說明自組裝合成的GNPs與傳統(tǒng)方法制備得到C-NPs相比，由于2種納米粒子的表面結構和性質存在差異，在表面親水性殼聚糖和活性氨基的作用下，其細胞吞噬效率在4h內未表現(xiàn)出明顯差別，MCF-7細胞對2種納米粒子的攝取，在濃度為25～400μg/mL，孵育1～4h的條件下，攝取效率具有濃度和時間依賴性。

3.3 細胞攝取熒光納米粒的顯微鏡觀察

MCF-7細胞對2種空白熒光標記納米粒子攝取情況的熒光顯微鏡照片見圖4，A/B為FITC-C-NPs組；C/D為FITC-G-NPs組；A/C為顯微鏡光源下熒光未激發(fā)的細胞形態(tài)照片、B/D為熒光藍色通道激發(fā)FITC后的顯色照片；細胞孵育熒光納米粒1h后，即可看到2種FITC標記的納米粒子已經(jīng)進入細胞內（呈綠色熒光標記），細胞對2種納米粒子的攝取情況無明顯差異，與定量測定的結果相一致。

圖4 熒光倒置顯微鏡觀察細胞對納米粒子攝取Fig.4 Fluorescence microscopic images of different nanoparticles with MCF-7cells

為了觀察C-NPs和G-NPs 2種納米粒子細胞攝取孵育時間的變化，同時觀察包載藥物阿霉素后，MCF-7細胞對納米藥物載體的攝取分布情況，作者制備了FITC標記的包載阿霉素的2種納米粒子：FITC-DOXC-NPs和FITC-DOX-G-NPs，在 MCF-7細胞孵育4h后，通過熒光顯微鏡觀察納米粒子和藥物在細胞內的分布情況，見圖5，A/B為 FITC-DOX-C-NPs組；C/D為FITC-DOX-GNPs組；A/C 為熒光綠色通道激發(fā)DOX后的顯色照片（紅色）、B/D為熒光藍色通道激發(fā)FITC后的顯色照片（綠色）；可以明顯看出包載藥物的納米粒子已經(jīng)通過細胞內吞作用進入到了細胞膜內，DOX和FITC呈現(xiàn)相同的標記位置，證明熒光標記的載藥納米粒子成功進入到了細胞內。FITC-DOX-CNPs和 FITC-DOX-G-NPs 2種納米粒子在孵育4h后，在細胞內的數(shù)量明顯增加（對比圖4），結合定量測定的結果，進一步說明MCF-7細胞對2種納米粒子的攝取具有時間依賴性。而且細胞在孵育1和4h后，細胞對2種納米粒子的吞噬情況無明顯差異。

圖5 孵育4h后MCF-7細胞對2種載藥納米粒子的細胞攝取Fig.5 Fluorescence microscopic images of different nanoparticles with MCF-7cells incubated for 4h

3.4 載藥納米粒對腫瘤細胞生長抑制的定量測定

通過MCF-7細胞對空白熒光納米粒攝取的定量測定和觀察，證明了經(jīng)殼聚糖修飾的2種納米粒子CNPs和G-NPs可以有效的被細胞吞噬，然而藥物包載后，經(jīng)殼聚糖修飾的載藥納米粒子藥物釋放效果的評價，則需要進一步通過腫瘤細胞生長的抑制來進行測定。

圖6為3種載藥納米粒子對比游離DOX在細胞孵育12h后，細胞生長抑制率隨藥物濃度變化的情況。PLGA、C-NPs、G-NPs和游離藥物對 MCF-7細胞生長的抑制率都隨著藥物濃度的增加而增加，在低濃度條件下（1～4μg/mL），3種載藥納米粒子的細胞生長抑制率基本都要高于游離藥物組，而當藥物濃度從8μg/mL上升到16μg/mL時，游離藥物的細胞生長抑制率快速升高（16μg/mL，58.77%），超過了3種載藥納米粒子（16μg/mL PLGA 33.07%；C-NPs 39.66%；GNPs 40.05%），說明在較低藥物濃度下，通過納米藥物載體的靶向性和細胞吞噬增加了細胞對納米藥物載體的攝取，而納米載體對P-gp主導的MDR效應的削弱進一步提高了細胞內藥物的有效濃度，而游離阿霉素在較低濃度下，無法形成較高的滲透壓，而導致藥物擴散作用相對較弱，而且藥泵P－gp的作用和溶酶體的吞噬溶解，進一步降低了游離藥物在細胞內的積聚；而隨著藥物濃度的升高（16μg/mL），游離藥物的擴散作用增強，細胞內游離阿霉素的濃度迅速增加，而納米載體藥物的緩釋性使得在12h的孵育條件下，高濃度的游離藥物明顯高于包載藥物的納米載體對細胞生長的抑制作用。

圖6 孵育12h載藥納米粒對MCF-7細胞生長的抑制率Fig.6 Inhibitory rate of drug-loaded nanoparticles to MCF-7cells incubated for 12h

同時在12h孵育條件下，3種納米藥物載體中，CNPs和G-NPs在不同的藥物濃度下均表現(xiàn)出比PLGA NPs高的細胞生長抑制率，這主要是由于C-NPs和GNPs納米載體表面殼聚糖親水性基團和正電性氨基的存在，使得這2種納米藥物載體的靶向性和細胞黏附效率明顯增加，從而表現(xiàn)出相對于PLGA納米載體更好的細胞生長抑制效果。而在12h孵育條件下，未觀察到C-NPs和G-NPs的細胞生長抑制差異。

4 結語

以人乳腺癌細胞MCF-7為模型細胞對熒光標記納米載體的攝取和生長抑制情況進行了研究，殼聚糖修飾的2種納米粒子C-NPs和G-NPs表現(xiàn)出良好的細胞靶向性，通過熒光顯微鏡觀察，均能有效的被MCF-7細胞攝取，而2種殼聚糖修飾的納米載體的攝取效率無顯著差異。細胞生長抑制的定量測定表明，由于殼聚糖的靶向作用，載藥后C-NPs和G-NPs在低藥物濃度1～4μg/mL時，具有優(yōu)于游離阿霉素和載藥PLGA納米載體的腫瘤細胞生長抑制率，另外載藥納米載體對MCF-7細胞生長的抑制具有一定的時間和濃度依賴性。結果表明，G-NPs包載疏水抗癌藥物后，有潛力成為抑制腫瘤細胞生長的新型納米載體。

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