王雪妹 , 王 晶 張全斌

(1. 中國(guó)科學(xué)院 海洋研究所 海洋生物技術(shù)工程研究發(fā)展中心, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)科學(xué)院大學(xué), 北京100049)

褐藻多糖硫酸酯是來(lái)源于褐藻細(xì)胞壁的一種主要由硫酸化的巖藻糖組成的結(jié)構(gòu)復(fù)雜多變的雜多糖。褐藻多糖硫酸酯具有多種生物活性, 主要有抗病毒、抗腫瘤、抗凝血和抗血栓、抗炎癥和增強(qiáng)機(jī)體免疫功能等, 且隨著他們的化學(xué)組分不盡相同, 其生物活性也有很大差異[1]。研究發(fā)現(xiàn)[2], 褐藻多糖硫酸酯在動(dòng)物腎臟損傷模型中具有很好的腎臟保護(hù)作用, 可緩解慢性腎衰, 且已在臨床得到了應(yīng)用。褐藻多糖硫酸酯在慢性腎衰中對(duì)腎臟的保護(hù)作用表現(xiàn)在可降低尿蛋白、血清肌酐和尿素氮水平, 改善腎臟功能[3]。對(duì)于褐藻多糖硫酸酯抗腎衰的機(jī)制已有一些研究, 褐藻多糖硫酸酯對(duì)腎臟的保護(hù)作用與其抗氧化能力相關(guān)[3], 褐藻多糖硫酸酯可抑制阿霉素腎病腎硬化大鼠腎臟中TGF-β1表達(dá), 并減少細(xì)胞外基質(zhì)中Ⅳ型膠原蛋白和纖連蛋白的合成[4], 褐藻多糖硫酸酯可抑制腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化[5]。但是褐藻多糖硫酸酯抗腎衰的機(jī)制尚不明確, 有待進(jìn)一步的研究。

NO是哺乳動(dòng)物體內(nèi)一種重要的信號(hào)分子, 與機(jī)體的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)。LPS是革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁中的一種成分, 對(duì)宿主是有毒性的, 是一種細(xì)菌內(nèi)毒素。LPS可誘導(dǎo)人腎小球系膜細(xì)胞的炎癥反應(yīng), 包括 NO含量的增加[6]。研究證明, 分子質(zhì)量對(duì)多糖活性有重要影響, 本研究制備了兩種不同分子質(zhì)量褐藻多糖硫酸酯, 選取大鼠腎小球系膜細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)材料, 以 LPS誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)作為模型, 探討不同分子質(zhì)量褐藻多糖硫酸酯是否能夠抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)液中 NO含量的增加, 從而抑制細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。通過(guò)實(shí)驗(yàn)結(jié)果探究褐藻多糖硫酸酯抗炎效果與其分子質(zhì)量之間的關(guān)系, 從而對(duì)不同分子質(zhì)量的褐藻多糖硫酸酯抗腎衰效果的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞

大鼠腎小球系膜細(xì)胞(HBZY-1)購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(China Center for Type Culture Colle-ction, CCTCC)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物

從海帶(Laminaria japonica)中提取褐藻多糖硫酸酯[7], 標(biāo)記為F1。由F1降解得到低分子質(zhì)量褐藻多糖硫酸酯[8], 標(biāo)記為F2。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑

DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium)高糖(4500 mg/L Glucose)培養(yǎng)基(Hyclone公司); 胎牛血清(Fetal Bovine Serum, FBS, Hyclone公司); 脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS, 美國(guó)Sigma公司); 胰蛋白酶(含 EDTA, Solarbio公司); MTT(美國(guó) Sigma公司); 一氧化氮檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 褐藻多糖硫酸酯化學(xué)組成的測(cè)定

褐藻多糖硫酸酯分子質(zhì)量用高效凝膠色譜法以葡聚糖作為分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定。巖藻糖含量用半胱氨酸鹽酸鹽法(Gibbons法)以巖藻糖為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定[9]。硫酸根含量用明膠氯化鋇法以硫酸鉀為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定[10]。糖醛酸含量用咔唑比色法以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定[11]。單糖含量組成用PMP柱前衍生-HPLC法進(jìn)行測(cè)定[12]。

1.2.2 大鼠腎小球系膜細(xì)胞HBZY-1的培養(yǎng)

大鼠腎小球系膜細(xì)胞 HBZY-1的培養(yǎng)條件為:90%DMEM高糖培養(yǎng)基, 10%胎牛血清, 青鏈霉素混合液(青霉素的工作濃度為100 U/mL, 鏈霉素的工作濃度為0.1 g/L), 37℃, 5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。傳代時(shí)間為2 d, 消化液為含0.25%EDTA的胰蛋白酶溶液。

1.2.3 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力

待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí), 消化收集細(xì)胞, 調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度, 使細(xì)胞濃度為5×104個(gè)/mL。鋪96孔板, 每孔加入100 μL細(xì)胞懸液, 細(xì)胞數(shù)目為5×103個(gè)/孔。過(guò)夜培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁, 換0.5%FBS的DMEM培養(yǎng)基, 培養(yǎng)24 h, 使細(xì)胞處于G0期。換10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基, 正常組和模型組不加任何藥物, 藥物組加入藥物F1或F2使其終濃度為12.5、25、50、100 mg/L, 處理1 h后, 模型組和藥物組加入LPS使其終濃度為 0.5 mg/L, 繼續(xù)培養(yǎng) 24 h。每孔加入20 μL 5g/L MTT(避光), 培養(yǎng) 4 h。吸去培養(yǎng)液, 每孔加入 150μL DMSO, 低速搖床振蕩 10 min, 酶標(biāo)儀490 nm測(cè)各孔吸光值。

1.2.4 細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量的測(cè)定

待細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí), 消化收集細(xì)胞, 調(diào)整細(xì)胞懸液的濃度, 使細(xì)胞濃度為3×104個(gè)/mL。鋪24孔板, 每孔加入 1 mL細(xì)胞懸液, 細(xì)胞數(shù)目為 3×104個(gè)/孔。過(guò)夜培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁, 換0.5%FBS的DMEM培養(yǎng)基, 培養(yǎng)24 h。換10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基, 正常組和模型組不加任何藥物, 藥物組加入藥物 F1 或 F2 使其終濃度為 12.5、25、50、100 mg/L, 處理 1 h后, 模型組和藥物組加入 LPS使其終濃度為0.5 mg/L。培養(yǎng)24 h, 取培養(yǎng)液200 μL, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h,取培養(yǎng)液200 μL, Griess法測(cè)培養(yǎng)液中NO含量。

用完全培養(yǎng)基稀釋標(biāo)準(zhǔn)品 NaNO2, 使標(biāo)準(zhǔn)品的濃度依次為 0、1、2、5、10、20、40、60、100 μmol/L。按50 μL/孔, 在96孔板中加入樣品(設(shè)3個(gè)平行)及標(biāo)準(zhǔn)品, 在各孔中加入室溫Griess Reagent I 和Griess Reagent II 各 50 μL。10 min 后, 540 nm 測(cè)定吸光度。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)均采用(x±s)表示, 采用SPSS13.0進(jìn)行成組間方差分析, P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 褐藻多糖硫酸酯化學(xué)組成測(cè)定結(jié)果

來(lái)源于海帶的褐藻多糖硫酸酯及其低分子質(zhì)量產(chǎn)物(F1和 F2)的化學(xué)組成測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表 1。結(jié)果表明, F1的分子質(zhì)量為 87 305 Da, F2的分子質(zhì)量為6 500 Da, F1分子質(zhì)量明顯高于F2。F1和F2的主要化學(xué)成分均為巖藻糖和硫酸根, 另外均含有較多的半乳糖。F2與F1相比, F2巖藻糖和硫酸根含量略低于F1, 且F2含有較多的半乳糖。

2.2 MTT法測(cè)定細(xì)胞活力

MTT法測(cè)定各組細(xì)胞活力結(jié)果如圖 1(以 F2為例)所示。結(jié)果表明, 各組間細(xì)胞活力無(wú)顯著性差異。因此, 在此基礎(chǔ)上測(cè)定其他指標(biāo)是可行的, 可排除因各組間細(xì)胞活力差異導(dǎo)致的其他指標(biāo)的變化。

表1 來(lái)源于海帶的褐藻多糖硫酸酯(F1和F2)的化學(xué)組成Tab.1 Chemical composition of fucoidan (F1 and F2) from Laminaria japonica

圖1 MTT法測(cè)定各組細(xì)胞活力(以F2為例)Fig.1 The cell viability of each group detected by MTT method (taking F2 as the example)

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量的測(cè)定

細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)圖2及圖3。由圖2可知, F1可以抑制LPS引起的大鼠腎小球系膜細(xì)胞NO產(chǎn)生量的增加, 24 h時(shí), 25、50、100 mg/L三個(gè)藥物組與模型組相比 NO含量有顯著性差異,48 h時(shí), 12.5、25、50、100 mg/L四個(gè)藥物組與模型組相比NO含量均有顯著性差異。由圖3可知, F2可以抑制LPS引起的大鼠腎小球系膜細(xì)胞NO產(chǎn)生量的增加, 24 h時(shí), 50、100 mg/L兩個(gè)藥物組與模型組相比NO含量有顯著性差異, 48 h時(shí), 12.5、25、50、100 mg/L四個(gè)藥物組與模型組相比NO含量均有顯著性差異。

圖2 F1對(duì)LPS誘導(dǎo)HBZY-1 NO產(chǎn)生量的影響(24 h和48 h)Fig.2 The effect of F2 on NO production by HBZY-1 cells induced by LPS (24 h and 48 h)

圖3 F2對(duì)LPS誘導(dǎo)HBZY-1 NO產(chǎn)生量的影響(24 h和48 h)Fig.3 The effect of F2 on NO production by HBZY-1 cells induced by LPS (24 h and 48 h)

為了比較F1和F2抑制LPS誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞 NO產(chǎn)生的效果大小, 選取作用時(shí)間為 48h,藥物濃度為 25 mg/L的組別與對(duì)應(yīng)的模型組進(jìn)行比較, 結(jié)果如表2所示。由表2可知, F1和F2的作用劑量為 25 mg/L時(shí), 與模型組相比, 細(xì)胞培養(yǎng)液中NO含量下降比例分別為 22.52%和 38.65%, 藥物抗炎效果為F2>F1。

表2 F1和F2抑制LPS誘導(dǎo)大鼠腎小球系膜細(xì)胞NO產(chǎn)生的效果比較Tab.2 Comparison of inhibitory effect of F1 and F2 on NO production induced by LPS

3 討論

褐藻多糖硫酸酯具有抗炎和抗腎衰的活性, 且其抗腎衰活性已在臨床的得到了應(yīng)用。雖然對(duì)于褐藻多糖硫酸酯腎臟保護(hù)作用的機(jī)制有一定的研究,但是其腎臟保護(hù)機(jī)制尚不明確。在慢性腎衰的進(jìn)程中伴隨著炎癥反應(yīng)的發(fā)生, 研究褐藻多糖硫酸酯抗炎作用對(duì)于褐藻多糖硫酸酯抗腎衰效果及機(jī)制的研究具有一定的意義。腎小球系膜細(xì)胞是腎臟中三種固有細(xì)胞之一, 對(duì)于腎臟炎癥、慢性腎衰的進(jìn)程中起到重要的作用。本文研究結(jié)果表明, LPS可引起大鼠腎小球系膜細(xì)胞NO產(chǎn)量的增加, F1和F2均可在一定程度上抑制細(xì)胞的 NO的產(chǎn)生, 從而降低細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

由F1和F2化學(xué)組成及其抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞 NO產(chǎn)生的效果可知, F2抗炎作用(NO含量降低比例為 38.65%)顯著高于 F1(22.52%),且 F2分子質(zhì)量(6 500 Da)明顯低于 F1(87 305 Da),由此可推斷分子量較低時(shí)抗炎效果更好, 可能是由于分子量較低時(shí)更易被細(xì)胞吸收, 從而更易起到抗炎的作用。在以后的研究工作中, 可通過(guò)研究不同化學(xué)組成的褐藻多糖硫酸酯的抗腎衰效果, 通過(guò)對(duì)褐藻多糖硫酸酯抗腎衰效果與抗炎效果進(jìn)行比較, 從而確定褐藻多糖硫酸酯抗腎衰是否與其具有抗炎作用有一定的關(guān)系。

NO是以精氨酸作為底物在NO合酶的作用下生成的, 在部分炎癥反應(yīng)中, 會(huì)有NO合酶含量的升高從而導(dǎo)致NO生成量的增加。因此, 褐藻多糖硫酸酯可能通過(guò)某種方式影響 NO合酶的含量或活性, 從而對(duì) NO的產(chǎn)生過(guò)程產(chǎn)生一定的影響。為了探究褐藻多糖硫酸酯影響 NO產(chǎn)生的原因和途徑, 在接下來(lái)的研究工作中, 可通過(guò)研究 NO合成酶含量的變化來(lái)探究褐藻多糖硫酸酯對(duì)于 NO含量產(chǎn)生影響的途徑。

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