劉 皓, 姚 維, 劉海情, 劉楚吾, 劉 麗

(廣東海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院 南海水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物增養(yǎng)殖廣東普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 湛江 524025)

動(dòng)物線(xiàn)粒體基因組(mitochondrial DNA, mtDNA)是核外遺傳物質(zhì), 結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單, 具有典型的母系遺傳特征[1], 受精時(shí), 父本 mtDNA 無(wú)法進(jìn)入卵細(xì)胞, 受精卵的 mtDNA直接來(lái)自母本, 不存在父母雙方mtDNA的重組過(guò)程。mtDNA進(jìn)化速度相對(duì)較快, 大約是單拷貝核基因進(jìn)化速度的6～7倍[2-3]。mtDNA還缺少具有校對(duì)功能的酶, 呈游離裸露狀態(tài)且無(wú)組蛋白的保護(hù), 由于其修復(fù)系統(tǒng)不健全、代增時(shí)間比較短和選擇壓力小等原因, 造成的突變很容易固定下來(lái)。盡管動(dòng)物線(xiàn)粒體在基因組成上具有很高的保守性,但在種群內(nèi)或不同物種間存在較大的差異[2,4-6]。利用這種高效的單倍體母系遺傳方式以及差異性,只需少量材料就能反映群體的遺傳結(jié)構(gòu), 可縮減用于測(cè)有效種群的群體大小, 提高對(duì)遺傳漂變的敏感性, 便于進(jìn)行群體分析[7]。后生動(dòng)物 mtDNA為典型的環(huán)狀雙鏈分子結(jié)構(gòu), 長(zhǎng)度大多在14～18 kb,編碼 37個(gè)基因, 包括 13個(gè)蛋白質(zhì)基因、22個(gè)tRNA基因以及12s rRNA和16s rRNA基因[8]。近年來(lái), 研究者們非常關(guān)注后生動(dòng)物 mtDNA的基因排列, 主要是因?yàn)樗茄芯肯到y(tǒng)進(jìn)化的一個(gè)很好的模型[9-12]。

作者報(bào)道了雜色龍蝦的線(xiàn)粒體基因組全序列特征, 并在雜色龍蝦(Panulirus versicolor)、中國(guó)龍蝦(Panulirus stimposni)、波紋龍蝦(Panulirus homarus)3個(gè)物種線(xiàn)粒體基因組全序列的基礎(chǔ)上分析了龍蝦屬線(xiàn)粒體基因組多態(tài)位點(diǎn)及遺傳變異, 為進(jìn)一步從分子水平對(duì)龍蝦類(lèi)的分類(lèi)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)所用雜色龍蝦樣品來(lái)自廣東湛江霞山水產(chǎn)品市場(chǎng), 取其肌肉, –20℃保存于無(wú)水乙醇中備用。

1.2 基因組總DNA的提取

以雜色龍蝦的肌肉為實(shí)驗(yàn)材料, 參照《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》, 采用苯酚-氯仿法提取基因組總DNA[13]。并利用核酸定量?jī)x檢測(cè)DNA的濃度和純度,然后4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)

利用甲殼動(dòng)物cox1,nad5和Cytb 3種編碼基因的通用引物擴(kuò)增出 3個(gè)片段[14-16]。然后在 GenBank中選取與雜色龍蝦線(xiàn)粒體基因組同源性比較高的 3個(gè)物種(中國(guó)龍蝦(NC014339)、日本龍蝦(Panulirus japonicus)(NC004251)和錦繡龍蝦(Panulirus ornatus)(NC014854)[17-19])的序列進(jìn)行序列比對(duì), 選取保守性較高的區(qū)域, 利用Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)了19對(duì)PCR引物(表 1), 覆蓋雜色龍蝦線(xiàn)粒體基因組全序列, 引物由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.4 PCR擴(kuò)增

PCR 反應(yīng)體系: 反應(yīng)總體積為 25 μL, 其中,10×Buffer 2.5 μL, dNTP2 μL, 上下游引物各 1 μL,TaqDNA聚合酶0.15 μL, DNA模板1 μL, 去離子水18.35 μL。反應(yīng)程序?yàn)? 95℃預(yù)變性3 min; 94℃變性20 s, 48～58℃退火50 s, 72℃延伸90 s, 35個(gè)循環(huán); 最后72℃延伸10 min。

1.5 擴(kuò)增產(chǎn)物的純化回收及測(cè)序

取PCR產(chǎn)物2 μL在1%的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳, 凝膠成像儀拍照記錄。用QIAquick Gel Extraction 50柱式膠回收試劑盒純化擴(kuò)增產(chǎn)物, 純化的步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取適量純化產(chǎn)物作為測(cè)序反應(yīng)的模板, 委托上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.6 序列拼接及分析

所測(cè)得序列用Lasergeneversion 7.0(DNASTAR)軟件包進(jìn)行分析, 用Seqman對(duì)重疊群進(jìn)行拼接, 然后用Clustal W軟件對(duì)拼接后的序列進(jìn)行人工校對(duì)。參考中國(guó)龍蝦、日本龍蝦和錦繡龍蝦的線(xiàn)粒體基因組 DNA數(shù)據(jù)對(duì)所獲得序列的蛋白編碼基因、rRNA和tRNA基因進(jìn)行識(shí)別, 并通過(guò)tRNAscan-SE搜索服務(wù)器(http: //lowelab.ucsc.edu/t RNAscan-SE/)[20]進(jìn)行識(shí)別tRNA的再驗(yàn)證。利用MEGA5.0[21]分析各種區(qū)段的堿基組成特征, 密碼子使用頻率, 通過(guò) DnaSP 4.10.7[22]分析龍蝦屬線(xiàn)粒體基因組的編碼基因多態(tài)位點(diǎn)和基因變異特征。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜色龍蝦線(xiàn)粒體基因組全序列的基本特征

雜色龍蝦mtDNA全長(zhǎng)為15 700 bp(GenBank登錄號(hào)為JQ320274), 由13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、22個(gè)tRNA基因、2個(gè)rRNA基因(16S rRNA和12S rRNA)以及D-loop控制區(qū)組成(表2)。其中14個(gè)基因位于輕鏈(L)上, 分別為12S rRNA, 16S rRNA,nad1,nad4L,nad4,nad5,tRNAVal,tRNALeu-CUN,tRNAPro,tRNAHis,tRNAPhe,tRNACys,tRNATyr,tRNAGln, 其余23個(gè)基因位于重鏈(H)上。

表2 雜色龍蝦線(xiàn)粒體基因組組成Tab.2 Gene organization of P. versicolor mitochondrial genome

雜色龍蝦線(xiàn)粒體基因組存在11處基因重疊, 重疊區(qū)長(zhǎng)度1～6 bp不等, 基因間隔有10處, 大小在1 ～36 bp,基因間隔最大的在tRNASer與nad1和nad1與tRNALeu之間, 分別是 17 bp和 36 bp; 既沒(méi)有重疊,也沒(méi)有間隔的基因共計(jì)15處。雜色龍蝦線(xiàn)粒體DNA的堿基組成具有AT偏好性, A+T含量為67%, 4種堿基的含量分別為(A=34.6%, T=32.1%, C=20.5%, G=12.8%), 變化趨勢(shì)與其他甲殼動(dòng)物基本一致, A含量最高而G含量最低, 在A+T富集區(qū)表現(xiàn)更為明顯。

線(xiàn)粒體基因排列能夠提供重要的系統(tǒng)進(jìn)化信息,一般而言, 泛甲殼動(dòng)物的線(xiàn)粒體基因組的基因排列順序基本相同, 但十足目較為復(fù)雜。作者研究的雜色龍蝦保持了泛甲殼動(dòng)物線(xiàn)粒體基因組的原始排列,沒(méi)有出現(xiàn)重組/隨機(jī)丟失現(xiàn)象。

2.2 蛋白編碼基因

在雜色龍蝦線(xiàn)粒體基因組中, 參與蛋白質(zhì)編碼的基因有13個(gè)(表3), 核苷酸共11140 bp, 占全序列的70.96%。雜色龍蝦的atp6與atp8之間和nad4與nad4L之間的重疊情況一致, 均重疊 7個(gè)堿基。除cox1和nad2外, 其余的11個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因都以標(biāo)準(zhǔn)的ATN作為起始密碼子。nad2的起始密碼子為GTG,cox1的起始密碼子為ACG。除atp6、atp8、cox3、nad1、nad2、nad4L和nad6的終止密碼子是TAA外, 其余的終止密碼子為不完全的T或TA,在后生動(dòng)物中這種不完全密碼子比較常見(jiàn)。Ojala等[23]的研究表明, 成熟的終止密碼子 TAA 可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄后的多腺苷酸化產(chǎn)生。

表3 雜色龍蝦粒體基因組13個(gè)蛋白編碼基因密碼子使用情況Tab.3 Average codon frequencies and usage in the 13 mitochondrial protein-coding genes in P. versicolor

2.3 tRNA基因與rRNA基因

雜色龍蝦mtDNA序列與其他物種一樣, 也包含22個(gè)tRNA基因。除tRNALeu和tRNASer有2個(gè), 其他18個(gè)均只有1個(gè)序列。每個(gè)tRNA均能折疊成三葉草狀二級(jí)結(jié)構(gòu), 長(zhǎng)度為61～75 bp不等。12s rRNA基因位于tRNAVal和 D-loop之間, 長(zhǎng)度為 861 bp, 16s rRNA基因位于tRNALeu和tRNAVal之間, 長(zhǎng)度為1 460 bp。兩個(gè)rRNA基因都位于輕鏈上, 其方向與龍蝦屬的其他物種完全一致。本研究成功地預(yù)測(cè)出 18個(gè)tRNA基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)和兩個(gè)rRNA基因的二級(jí)結(jié)構(gòu)。預(yù)測(cè)到的12s rRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)含有3個(gè)結(jié)構(gòu)域, 40個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu), 它的3'端存在一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu); 16s rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)都有6個(gè)結(jié)構(gòu)域, 53個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)。

在相近種種間或種內(nèi)的遺傳變異分析研究中,選取分子標(biāo)記片段至關(guān)重要。本研究在中國(guó)龍蝦, 雜色龍蝦, 波紋龍蝦 3個(gè)物種線(xiàn)粒體基因組全序列基礎(chǔ)上分析了龍蝦屬線(xiàn)粒體基因組13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、D-loop及2個(gè)核糖體RNA 基因的多態(tài)位點(diǎn)分析(表 4)。結(jié)果顯示: 多態(tài)位點(diǎn)比例較大的基因有nad2、nad4、nad5、Cytb、D-loop。

3 討論與結(jié)論

3.1 雜色龍蝦線(xiàn)粒體基因組全序列

雜色龍蝦線(xiàn)粒體基因組序列全長(zhǎng)15 700 bp, 稍大于中國(guó)龍蝦[18]的15 677 bp, 而稍小于日本龍蝦[17]的15 717 bp, 在軟甲亞綱的范圍內(nèi)。雜色龍蝦線(xiàn)粒體基因組的基因排列次序與其他龍蝦類(lèi)及節(jié)肢動(dòng)物的基本模式相同, 沒(méi)有KD倒置現(xiàn)象, 即tRNAAsp(D)排在tRNALys(K)基因上游(DK排列)[24]。雜色龍蝦線(xiàn)粒體DNA的堿基組成具有很強(qiáng)的 AT偏好性, A+T含量為 67%, 稍高于中國(guó)龍蝦的 65.6%和日本龍蝦的64.5%。4種堿基的含量分別為(A=34.6%, T=32.1%,C=20.5%, G=12.8%), 變化趨勢(shì)與其他甲殼動(dòng)物基本一致, A含量最多而G含量最少, 在A+T富集區(qū)表現(xiàn)更為明顯, 這與線(xiàn)粒體含有大量 ATP有著密切的聯(lián)系。蛋白質(zhì)基因nad4和nad4L,atp6、atp8和cox3緊密相連, 沒(méi)有tRNA基因的間隔, 這也說(shuō)明存在于蛋白質(zhì)編碼基因間的tRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)是多順?lè)醋? 在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中不進(jìn)行蛋白質(zhì)編碼基因間隔序列的形成[25]。

表4 龍蝦屬線(xiàn)粒體基因組13個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因、D-loop及2個(gè)核糖體RNA基因的多態(tài)位點(diǎn)分析Tab.4 Polymorphic loci analysis of 13 protein-coding genes, D-loop and two ribosomes RNA gene in Lobster (Panulirus) mitochondrial genome

3.2 蛋白質(zhì)編碼基因

與日本龍蝦及中國(guó)龍蝦一樣, 雜色龍蝦的atp6與atp8之間和nad4與nad4L之間均重疊7個(gè)堿基。除cox1的起始密碼子為ACG、nad2的起始密碼子為GTG外, 其余的11個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因都以標(biāo)準(zhǔn)的ATN作為起始密碼子。除atp6、atp8、cox3、nad1、nad2、nad4L和nad6的終止密碼子是TAA外, 其余的終止密碼子為不完全的T或TA, 在后生動(dòng)物中這種不完全密碼子比較常見(jiàn)。Ojala等[23]的研究表明,成熟的終止密碼子 TAA 可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄后的多腺苷酸化產(chǎn)生。

從表 3可以看出, 雜色龍蝦組成蛋白質(zhì)的氨基酸中按數(shù)目的多少排列分別為: Ser, Leu, Ile, Phe, Tyr,Pro, Asn, Thr, Lys, Met, Gln, Val, His, Ala, Glu, Arg,Gly, Asp, Trp, Cys。這與已知的龍蝦屬其他物種的氨基酸排列順序大致相同, 說(shuō)明龍蝦屬各物種的蛋白質(zhì)編碼基因序列之間的替換多為同義替換, 沒(méi)有影響所編碼的氨基酸種類(lèi)。在雜色龍蝦線(xiàn)粒體基因組中, 占主導(dǎo)地位的是非極性氨基酸, 其次是極性不帶電的氨基酸。根據(jù)生物分子的相似相溶性原理可知, 其線(xiàn)粒體DNA所編碼的蛋白質(zhì)為疏水蛋白質(zhì)。另外, 從編碼同一個(gè)氨基酸不同密碼子的使用個(gè)數(shù)和百分比來(lái)看, 三聯(lián)密碼子的第三位點(diǎn)有 4種擺動(dòng)形式, 第三位點(diǎn)為 G的密碼子使用個(gè)數(shù)較少, 這也反映了線(xiàn)粒體蛋白質(zhì)編碼基因在使用密碼子上的明顯偏好, 即反G偏倚。

3.3 tRNA基因與rRNA基因

雜色龍蝦 mtDNA也編碼 22個(gè)tRNA基因。tRNALeu和tRNASer有 2個(gè)序列, 其他 18個(gè)均只有 1個(gè)序列。長(zhǎng)度范圍為 61～75 bp。所預(yù)測(cè)到的二級(jí)結(jié)構(gòu), 僅tRNASer無(wú)DHC臂, 由7個(gè)核苷酸取代了該位置, 其余的tRNA都能形成典型的三葉草結(jié)構(gòu), 這是后生動(dòng)物線(xiàn)粒體基因組的一個(gè)普遍特征。雜色龍蝦的18個(gè)tRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)中出現(xiàn)16處錯(cuò)配, 其中14處為 GU錯(cuò)配, 2處 UU錯(cuò)配, 發(fā)生在tRNATyr和tRNAGln的氨基酸接受臂和TψC臂。有學(xué)者認(rèn)為線(xiàn)粒體基因組tRNA基因的部分錯(cuò)配可以通過(guò)RNA編輯校正, 不會(huì)引起氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)上的障礙[26]。12s rRNA基因位于tRNAVal和D-loop之間, 長(zhǎng)度為861bp, 16s rRNA基因位于tRNALeu和tRNAVal之間, 長(zhǎng)度為1 460 bp。兩個(gè)rRNA基因都編碼在輕鏈上, 其方向與龍蝦屬的其他物種完全一致[17-18]。預(yù)測(cè)到的雜色龍蝦 16s rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu), 有6個(gè)結(jié)構(gòu)域, 53個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu); 12srRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)含有 3個(gè)結(jié)構(gòu)域, 40個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu),它的3'端存在一個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu), Cannone等[27]認(rèn)為12s rRNA和類(lèi)似12srRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)都存在該莖環(huán)結(jié)構(gòu)。雜色龍蝦的rRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)與其他脊椎動(dòng)物的基本相同[28], 這說(shuō)明rRNA基因進(jìn)化非常慢, 在相當(dāng)長(zhǎng)的進(jìn)化過(guò)程中, 其分子的排列變化不大, 功能幾乎保持恒定。

3.4 A+T富集區(qū)

目前對(duì)A+T富集區(qū)域的關(guān)注主要集中于所包含的與復(fù)制相關(guān)的調(diào)控信息。由于其在進(jìn)化過(guò)程中選擇壓力相對(duì)較小, 較線(xiàn)粒體其他區(qū)域具有更高的多態(tài)性, 不同種類(lèi)動(dòng)物線(xiàn)粒體DNA大小的差異主要是由該區(qū)域的變化造成的[29]。雜色龍蝦控制區(qū)與其他后生動(dòng)物的相似, 主要包括5個(gè)結(jié)構(gòu): 輕鏈復(fù)制起點(diǎn)(origin of minoritystrand replication)、poly T(poly-thymidine stretch)結(jié)構(gòu)、高度變異區(qū)、類(lèi)似微衛(wèi)星的重復(fù)序列以及靠近tRNAIle上游的一段 poly T結(jié)構(gòu)[30-31],這段Poly(T)結(jié)構(gòu), 與復(fù)制起點(diǎn)的識(shí)別有關(guān)[32]。

3.5 基因多態(tài)位點(diǎn)分析

通常cox1、Cytb被認(rèn)為適用于近緣物種的區(qū)分和鑒定, 在群體遺傳、分類(lèi)學(xué)、系統(tǒng)進(jìn)化、動(dòng)物保護(hù)生物學(xué)以及古生物化石等研究方面得到了廣泛的應(yīng)用[33-35]。本研究中, 通過(guò)對(duì)多態(tài)位點(diǎn)的分析得知:cox1的多態(tài)位點(diǎn)比例較低, 不適宜用于龍蝦類(lèi)分子進(jìn)化研究。nad2、D-loop基因的多態(tài)位點(diǎn)比例較高, 尤其是D-loop, 高達(dá)39.50%, 且基因片段較長(zhǎng), 而nad5基因擁有的多態(tài)位點(diǎn)總數(shù)最多(>400), 因此, 他們比較適合作為分子標(biāo)記用于分析龍蝦類(lèi)生物進(jìn)化過(guò)程中的譜系發(fā)生和遷移流動(dòng)以及群體間線(xiàn)粒體基因組進(jìn)化全序列比較分析、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化、種內(nèi)多態(tài)性研究、遺傳分化等。

[1] 李冬玲. 線(xiàn)粒體病的母系遺傳[J]. 濰坊學(xué)院學(xué)報(bào),2006, 6(4): 85-87.

[2] Moriyama E N, Powell J R. Synonymous substitution rates in Drosophila: mitochondrial versus nuclear genes[J]. Journal of Molecular Evolution, 1997, 45(4):378-391.

[3] Caccone A, Gentile G, Burns C E, et al. Extreme difference in rate of mitochondrial and nuclear DNA evolution in a large ectothermGalapagos tortoises[J].Molecular Phylogenetics and Evolution, 2004, 31(2):794-798.

[4] Brown W M, George M, Wilson A C. Rapid evolution of animal mitochondrial DNA[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 1979, 76(4): 1967-1971.

[5] 劉麗, 李曉娜, 陳育盛, 等. 基于線(xiàn)粒體基因的石珊瑚分子系統(tǒng)學(xué)研究[J]. 海洋與湖沼, 2012, 43(4):814-820.

[6] 劉麗, 李文娟, 劉楚吾. 廣東徐聞地區(qū)濱珊瑚遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系[J]. 海洋與湖沼, 2013, 44(2):371-376.

[7] 廖順堯, 魯成. 動(dòng)物線(xiàn)粒體基因組研究進(jìn)展[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展, 2000, 27(5): 508-512.

[8] Wolstenholme D R. Animal mitochondrial DNA: structure and evolution[J]. International Review of Cytology,1992, 141: 173-216.

[9] Beagley C T, Okimoto R, Wolstenholme D R. The mitochondrial genome of the sea anemoneMetridium senile(Cnidaria): introns, a paucity oftRNAgenes, and a near-standard genetic code[J]. Genetics, 1998, 148(3):1091-1108.

[10] 牛屹東, 李明, 魏輔文, 等. 線(xiàn)粒體 DNA 用作分子標(biāo)記的可靠性和研究前景[J]. 遺傳, 2001, 23(6):593-598.

[11] 劉楚吾, 徐田軍, 劉麗, 等. 笛鯛屬(Lutjanus)魚(yú)類(lèi)線(xiàn)粒體16s rRNA基因序列比較及系統(tǒng)學(xué)分析[J]. 海洋與湖沼, 2009, 40(5): 563-571.

[12] Liu X, Guo Y, Wang Z, et al. The complete mitochondrial genome sequence ofTrichiurus nanhaiensis(Perciformes: Trichiuridae) [J]. Mitochondrial DNA,2013, 24(5): 516-517.

[13] 盧圣棟. 現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(第2版)[M]. 北京:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社, 1999: 61-66.

[14] Folmer O, Black M, Hoeh W, et al. DNA primers for amplification of mitochondrial cytochrome c oxidase subunit I from diverse metazoan invertebrates [J].Molecular Marine Biology and Biotechnology, 1994, 3:294-299.

[15] Lavrov D V, Brown W M, Boore J L, et al. Phylogenetic position of the Pentastomida and (pan) crustacean relationships[J]. Proceedings of the Royal Society B, 2004, 271(1538): 537-544.

[16] Boore J L, Brown W M. Mitochondrial genomes ofGalathealinum,Helobdella, andPlatynereis: sequence and gene arrangement comparisons indicate that Pogonophora is not a phylum and Annelida and Arthropoda are not sister taxa[J]. Molecular Biology and Evolution,2000, 17(1): 87-106.

[17] Yamauchi M, Masaki U M, Mutsumi N. Complete mitochondrial DNA sequence of the Japanese spiny lobster,Panulirus japonicus(Crustacea: Decapoda) [J].Gene, 2002, 295 (1): 89-96.

[18] Liu Y, Cui Z. Complete mitochondrial genome of the Chinese spiny lobsterPanulirus stimpsoni(Crustacea:Decapoda): genome characterization and phylogenetic considerations [J]. Molecular Biology Reports, 2011,38(1): 403-410.

[19] Liang H F. Complete mitochondrial genome of the ornate rock lobsterPanulirus ornatus(Crustacea:Decapoda) [J]. African Journal of Biotechnology, 2012,11(80): 14519-14528.

[20] Newman S J, Cappo M, Williams D M. Age, growth and mortality of the stripey,Lutjanus carponotatus(Richardson) and the brown-stripe snapper,L. vitta(Quoy and Gaimard) from the central Great Barrier Reef, Australia [J]. Fishery Research, 2000, 48(3):263-275.

[21] Koichiro T, Daniel P, Nicholas P, et al. MEGA5:Molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods[J]. Molecular Biology and Evolution, 2011, 28 (10): 2731-2739.

[22] Rozas J, Sanche E L. DNA polymorphism analyses by the coalescent and other methods [J]. Biomedical Informatics, 2003, 19(18): 2496-2497.

[23] Ojala D, Montoya J, Attardi G. tRNA punctuation model of RNA processing in human mitochondria [J].Nature, 1981, 290(5806): 470-474.

[24] Ballard J W O, Dean M D. The mitochondrial genome:mutation, selection and recombination [J]. Current Opinion in Genetics and Development, 2001, 11(6):667-672.

[25] Kurabayashi A, Ueshima R. Complete sequence of the mitochondrial DNA of the primitive Opisthobranch gastropodPupa strigosa: systematic implication of the genome organization [J]. Molecular Biology and Evolution, 2000, 17(2): 266-277.

[26] Yokobori S, Paabo S. Transfer RNA editing in land snail mitochondria [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1995, 92(22): 10432-10435.

[27] Cannone J J, Subramanian S, Schnare M N, et al. The comparative RNA web (CRW) site: an online database of comparative sequence and structure information for ribosomal intron and other RNAs [J]. BMC Bioinfor-matics, 2002, 3(1): 15.

[28] Hixson J E, Brown W M. A comparison of the small ribosomal RNA genes from the mitochondrial DNA of the great apes and humans: sequence, structure evolution and phylogenetic implications[J]. Molecular Biology and Evolution, 1986, 3(1): 1-18.

[29] Zhang D X, Hewitt G M. Insect mitochondrial control region: a review of its structure, evolution and usefulness in evolutionary studies[J]. Biochemical Systematics and Ecology, 1997, 25(2): 99-120.

[30] Lee W J, Conroy J. Structure and evolution of teleost mitochondrial control regions[J]. Molecular Iology and Evolution, 1995, 41(1): 54-66.

[31] Giles R E, Blane H. Maternal inheritance of human mitochondrial DNA[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,1980, 77(11): 6715-6719.

[32] Ye W, Dang J P, Xie L D, et al. Complete mitochondrial genome ofteleogryllus emma(Orthoptera:Gryllidae) with a new gene order in Orthoptera[J].Zoological Research, 2008, 29(3): 236-244.

[33] Ferran P. Phylogenetic relationships between spiny,slipper and coral lobsters (Crustacea, Decapoda,Achelata) [J]. Molecular Phylogenetics and Evolution,2009, 50(1): 152-162.

[34] George R W, Main A R. The evolution of spiny lobsters(Palinuridae): a study of evolution in the marine environment[J]. Society for the Study of Evolution,1967, 21(4): 803-820.

[35] George R W. Tethys origin and subsequent radiation of the spiny lobsters (Palinuridae) [J]. Crustaceana, 2006,79(6): 397-422.