趙則海

（肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061）

黑桫欏(Alsophila podophylla Hook.)屬桫欏科(Cyatheaceae)桫欏屬(Alsophila)黑桫欏亞屬(Subgenus Gymnosphaera)[1]，是孑遺植物中瀕危蕨類植物的代表之一[2].桫欏植物含有黃酮類、甾體及三萜類、生物堿、酚類、蛋白質(zhì)類等多種活性物質(zhì)[3]，對(duì)許多疾病具有明顯的療效[4].近年來，有學(xué)者采用大孔樹脂吸附法研究了桫欏（Alsophila spinulosa(Hook.)Tryon）葉總黃酮提取純化工藝[5]，而涉及黑桫欏葉總黃酮測(cè)定的研究尚未見報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)采用分光光度法對(duì)黑桫欏葉總黃酮含量進(jìn)行了測(cè)定，并對(duì)溝底和山坡采樣樣品中的總黃酮含量進(jìn)行了比較.

1 儀器與試劑

本實(shí)驗(yàn)所用儀器如下：722型可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；SK8200H型超聲波清洗器（頻率59 kHz，功率500 W），上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；AE240S型電子分析天平，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司.本實(shí)驗(yàn)所用試劑如下：蘆丁對(duì)照品由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁、甲醇、乙醇、丙酮等試劑均為分析純.

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

在廣東省肇慶鼎湖山和九龍湖，分別從溝底和山坡按生長(zhǎng)條件采集樣品；黑桫欏葉復(fù)葉按嫩葉、成熟葉、老葉采集；每個(gè)復(fù)葉按葉片和復(fù)葉柄分別烘干粉碎備用.

2.2 對(duì)照品溶液的制備

在105 ℃的溫度下烘干蘆丁對(duì)照品至恒重，精確稱取蘆丁對(duì)照品4.82 mg置于10 mL容量瓶中，用乙醇定容，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液，質(zhì)量濃度為0.482 g/L.

2.3 供試樣品溶液制備

將干燥的黑桫欏粉末用孔徑0.2 mm的篩子過濾，精密稱取約0.1 g置于10 mL容量瓶中，加入體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，超聲提取1 h，定容至10 mL，作為供試品溶液[6].

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

精確吸取對(duì)照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2，1.4 mL 分別置于10 mL 容量瓶中，加蒸餾水至2 mL；加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的亞硝酸鈉試液0.4 mL，放置6 min；加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的硝酸鋁試液0.4 mL，放置6 min；加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的氫氧化鈉試液4 mL，加水定容，搖勻，放置15 min；于510 nm處測(cè)定吸光度.以濃度（C）與吸光度（A）進(jìn)行直線回歸，得回歸方程為C=10.147A+0.009 5，R2=0.999 1.

2.5 樣品的測(cè)定

吸取供試樣品溶液1 mL，置于10 mL容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟操作，于510 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算其總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)：總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)=(濃度×定容體積/樣品量)×100.

3 測(cè)定結(jié)果

3.1 黑桫欏葉片總黃酮的提取條件

1）超聲提取時(shí)間.以體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇為提取劑，在超聲功率不變的條件下，隨著超聲時(shí)間的增加，黑桫欏葉片中總黃酮含量升高，見圖1.超聲提取60 min后，總黃酮含量增長(zhǎng)緩慢，由此將超聲提取60 min作為提取條件.

2）不同濃度提取劑對(duì)總黃酮含量的影響.黃酮類化合物易溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙醚等有機(jī)溶劑中，其中乙醇和甲醇是常用的提取溶劑[7].用不同濃度的乙醇、甲醇、丙酮提取劑對(duì)黑桫欏葉片中總黃酮進(jìn)行1 h超聲提取，其中體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇和甲醇的提取效果較好，見圖2.高濃度的乙醇、甲醇及丙酮提取液顏色呈綠色或墨綠色，受葉綠素的影響較大.體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇黑桫欏提取液呈現(xiàn)淡黃色或淡綠色，具有很好的透光性.

圖1 超聲提取時(shí)間對(duì)黑桫欏葉片總黃酮含量的影響

圖2 不同濃度提取劑對(duì)黑桫欏葉片中總黃酮提取效果的影響

3）料液比對(duì)黑桫欏總黃酮提取效果的影響.黑桫欏葉片總黃酮的提取隨著提取溶劑量的增加而增加.由圖3可見，料液比在1:50～1:100之間增幅較小.溶劑用量少時(shí)，提取不完全，用量過多則會(huì)造成浪費(fèi)，所以黑桫欏葉片總黃酮提取的最佳料液比為1:50.

3.2 黑桫欏葉中不同部位總黃酮含量比較

山坡上采集的黑桫欏葉總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均為4.625%，葉片平均為5.672%，復(fù)葉柄平均為3.577%；溝底采集的黑桫欏葉總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均為3.303%，葉片平均為3.582%，復(fù)葉柄平均為3.025%（見表1）.黑桫欏葉片總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為嫩葉>成熟葉>老葉；復(fù)葉柄總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為成熟葉>老葉>嫩葉.山坡上的黑桫欏葉總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于溝底.

圖3 不同料液比對(duì)黑桫欏葉片總黃酮提取效果的影響

表1 黑桫欏葉不同部位總黃酮的含量

4 討論

黑桫欏是受國(guó)家重點(diǎn)保護(hù)的瀕危植物，因而不能采集其莖和根.本實(shí)驗(yàn)以黑桫欏葉片為原料進(jìn)行總黃酮測(cè)定.現(xiàn)有文獻(xiàn)中未見有關(guān)黑桫欏總黃酮測(cè)定的報(bào)道，通過超聲提取及分光光度法測(cè)定黑桫欏中總黃酮的含量，為黑桫欏的可持續(xù)開發(fā)利用提供了依據(jù).甲醇和乙醇均可作為黑桫欏總黃酮的提取溶劑.體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇是提取黑桫欏總黃酮安全、有效的溶劑.1:50的液料比，超聲60 min，對(duì)黑桫欏總黃酮的提取效果較好.溝底生境較為適宜黑桫欏生長(zhǎng)，而生長(zhǎng)于山坡的黑桫欏葉中總黃酮含量升高，可能與其受到環(huán)境脅迫有關(guān).黑桫欏葉中總黃酮含量較高（山坡和溝底總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.303%和4.625%），甚至老葉中總黃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)也達(dá)到3.0%以上.研究黑桫欏黃酮類物質(zhì)，對(duì)科學(xué)、合理地保護(hù)、利用黑桫欏資源具有重要意義.

[1]蘇應(yīng)娟,王艇,鄭博,等.根據(jù)cpDNA trnL-F非編碼區(qū)序列變異分析黑桫欏海南和廣東種群的遺傳結(jié)構(gòu)與系統(tǒng)地理[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2004,24(5):914-919.

[2]張麗兵,張憲春.中國(guó)植物志:第6卷第3分冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,2000:265-267.

[3]陳封政,李書華,向清祥.瀕危植物桫欏不同部位化學(xué)組分的比較研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2006,34(15):3 710-3 711.

[4]戴錫玲,李新國(guó),張瑩.藥用蕨類植物資源研究及其開發(fā)利用[J].資源開發(fā)與市場(chǎng),2003,19(6):397-399.

[5]陳封政,李書華,向清祥.桫欏葉總黃酮正交提取工藝和大孔樹脂吸附分離特性的研究[J].中成藥,2008,30(11):1 600-1 604.

[6]曹建國(guó),趙則海,李慶勇,等.刺五加丁香苷和總黃酮含量及其季節(jié)動(dòng)態(tài)[J].植物學(xué)通報(bào),2006,23(3):269-274.

[7]趙兵,王玉春,歐陽藩,等.超聲波在植物提取中的應(yīng)用[J].中草藥,1999,30(9):1-3.