王洪峰 李 實(shí) 董 理 王宇峰(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，長(zhǎng)春 130117)

重癥肌無(wú)力(Myasthenia gravis，MG)是一種以部分或全身骨骼肌無(wú)力和極易疲勞為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病，大量的研究［1-3］證明:IL-12和IL-18在MG的發(fā)病過(guò)程中具有重要的作用，并與MG的病情嚴(yán)重程度密切相關(guān)。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為MG屬于“痿證”的范疇，患者以脾氣虛弱、腎陽(yáng)不足為主要病機(jī)，筆者以溫陽(yáng)補(bǔ)氣為主要治療原則，采用針灸療法治療本病取得了良好的臨床療效。為進(jìn)一步研究“溫陽(yáng)補(bǔ)氣”針?lè)ㄖ委烳G的作用機(jī)制，本研究采用國(guó)際公認(rèn)的免疫接種法建立實(shí)驗(yàn)性自身免疫性重癥肌無(wú)力(Experimental autoimmune myasthenia gravis，EAMG)大鼠動(dòng)物模型，觀察該針?lè)▽?duì)EAMG大鼠血清中IL-12和IL-18表達(dá)水平的影響，以期為針灸治療MG提供客觀的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)Lewis大鼠80只，雌性，6～8周齡，平均體質(zhì)量(162.21±4.7)g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供，合格證號(hào)碼:SCXK(滬)2007-0005，檢疫后送至長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，標(biāo)準(zhǔn)大鼠顆粒飼料喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑和儀器 AchRα1 129～145多肽片段(美國(guó)Sigma公司);大鼠AchR-ab ELISA檢測(cè)試劑盒(上海研輝生物科技有限公司);大鼠IL-12 ELISA檢測(cè)試劑盒(上海研輝生物科技有限公司);大鼠IL-18 ELISA檢測(cè)試劑盒(上海研輝生物科技有限公司);溴吡斯的明(60 mg/片，上海三維制藥有限公司);Σ960型全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Metertech公司);T-500型電子天平(美國(guó)雙杰兄弟集團(tuán)有限公司);GS-15R低溫高速離心機(jī)(美國(guó)Beckman公司);微量加樣器(日本Nichiryo公司);0.25 mm×25 mm毫針(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司);艾絨(南陽(yáng)綠瑩艾草生物制品有限公司)。

1.3 大鼠EAMG模型建立方法 選取SPF級(jí)Lewis大鼠60只，采用免疫接種法建立EAMG大鼠動(dòng)物模型。將AchRα1 129～145多肽片段按照1∶2的比例與弗氏完全佐劑(CFA)完全乳化，配比按照200 μl溶液內(nèi)含有50 μg片段，不足部分用 pH7.4的PBS液定容至20 ml，充分混勻制成免疫乳劑，取一滴乳劑滴入水中呈現(xiàn)球形而不分散為乳化好的標(biāo)志。首次免疫接種時(shí)，將上述抗原乳劑以300 μl/只(含 AchRα1 129～145:75 μg)多點(diǎn)注射于大鼠四只足墊部、尾根部、背部。在首次免疫后第4和第8周，分別進(jìn)行強(qiáng)化免疫接種，將AchRα1 129～145多肽片段以1∶2的比例與弗氏不完全佐劑(IFA)完全乳化，配比按照200 μl溶液含有50 μg片段，不足部分用pH7.4的PBS液定容至20 ml，以200 μl/只(含 AchRα1 129～145:50 μg)多點(diǎn)注射于大鼠四只足墊部、尾根部、背部。以 Lennon分級(jí)評(píng)分≥1分［4］，同時(shí)AchR-ab呈陽(yáng)性為EAMG大鼠模型造模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 分組及治療方法 選取建模成功的EAMG大鼠30只，隨機(jī)分為針灸治療組、藥物對(duì)照組和模型對(duì)照組，每組10只，選取同期購(gòu)進(jìn)未建模的SPF級(jí)Lewis大鼠10只設(shè)為空白對(duì)照組。針灸治療組予以“溫陽(yáng)補(bǔ)氣”針?lè)ㄖ委?，手三?雙)直刺5 mm，足三里(雙)直刺6 mm，脾俞(雙)直刺6 mm，腎俞(雙)直刺6 mm，平補(bǔ)平瀉，針上加灸，30 min/次，1次/d，7 d為1療程，療程間休息1 d，連續(xù)治療2個(gè)療程。藥物對(duì)照組予以溴吡斯的明灌胃治療，18.5 mg/(kg·d)，連續(xù)治療15 d。模型對(duì)照組和空白對(duì)照組大鼠不予特殊處置，同等條件下飼養(yǎng)，每日抓取1次，觀察一般情況。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法 大鼠血清IL-12、IL-18表達(dá)水平的檢測(cè):治療后抽取大鼠尾根靜脈血，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測(cè)定大鼠血清中IL-12和IL-18的表達(dá)水平，具體方法按上海研輝生物科技有限公司說(shuō)明書(shū)操作。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法 在Excel工作表中，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。計(jì)量資料均用表示，采用Newman-Keuls法進(jìn)行單因素多樣本均數(shù)比較，采用Spearman等級(jí)相關(guān)進(jìn)行相關(guān)回歸分析，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清IL-12表達(dá)水平 模型對(duì)照組EAMG大鼠血清中IL-12表達(dá)水平顯著升高，與空白對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);針灸治療組和藥物對(duì)照組EAMG大鼠血清中IL-12的表達(dá)水平均明顯下降，與模型對(duì)照組比較，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01);但針灸治療組與藥物對(duì)照組比較，兩組EAMG大鼠血清中IL-12的表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠血清IL-18表達(dá)水平 模型對(duì)照組EAMG大鼠血清中IL-18表達(dá)水平顯著升高，與空白對(duì)照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);針灸治療組和藥物對(duì)照組EAMG大鼠血清中IL-12的表達(dá)水平均明顯下降，與模型對(duì)照組比較，差異均具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01);但針灸治療組與藥物對(duì)照組比較，兩組EAMG大鼠血清中IL-18的表達(dá)水平無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。見(jiàn)表2。

表1 各組大鼠血清IL-12的表達(dá)水平(n=10，，pg/ml)Tab.1 Serum IL-12 expression levels of rats in various groups(n=10，，pg/ml)

表1 各組大鼠血清IL-12的表達(dá)水平(n=10，，pg/ml)Tab.1 Serum IL-12 expression levels of rats in various groups(n=10，，pg/ml)

q Groups IL-12 Acupuncture treatment 0.093 8 Model 32.71 ± 9.37(P＜0.01)(P＜0.05)(P＜0.05)(P＞0.05)Acupuncture treatment 23.94±3.88 vs Drug control Blank control 14.26±3.53 9.110 6 4.332 1 4.2383 Blank control vs Model Acupuncture treatment vs Model Drug control vs ModelDrug control 24.13±6.97

表2 各組大鼠血清IL-18的表達(dá)水平(n=10，，pg/ml)Tab.2 Serum IL-18 expression levels of rats in various groups(n=10，，pg/ml)

表2 各組大鼠血清IL-18的表達(dá)水平(n=10，，pg/ml)Tab.2 Serum IL-18 expression levels of rats in various groups(n=10，，pg/ml)

q Groups IL-18 Acupuncture treatment 7 6 0.218 9 Model 115.55 ± 20.60(P＜0.01)(P＜0.01)(P＜0.01)(P＞0.05)Acupuncture treatment 96.15±12.63 vs Drug control Blank control 27.49±5.81 20.962 0 4.618 7 4.83 Blank control vs Model Acupuncture treatment vs Model Drug control vs Model Drug control 95.23±9.40

圖1 Lennon癥狀評(píng)分與IL-12表達(dá)水平的線性回歸曲線Fig.1 Lennon symptom score and level of expression of IL-12 linear regression curve

2.3 Lennon癥狀評(píng)分與EAMG大鼠血清IL-12表達(dá)水平的相關(guān)性分析 以EAMG大鼠的Lennon癥狀評(píng)分為因變量，以EAMG大鼠血清IL-12的表達(dá)水平為自變量，進(jìn)行多元線性回歸分析顯示，IL-12的表達(dá)水平與Lennon癥狀評(píng)分呈線性正相關(guān)，等級(jí)相關(guān)系數(shù)r=0.970 2，P＜0.01，說(shuō)明 IL-12的表達(dá)水平與EAMG大鼠的臨床癥狀嚴(yán)重程度具有緊密的相關(guān)性。見(jiàn)圖1。

2.4 Lennon癥狀評(píng)分與EAMG大鼠血清IL-18表達(dá)水平的相關(guān)性分析 以EAMG大鼠的Lennon癥狀評(píng)分為因變量，以EAMG大鼠血清IL-18的表達(dá)水平為自變量，進(jìn)行多元線性回歸分析顯示，IL-18的表達(dá)水平與Lennon癥狀評(píng)分呈線性正相關(guān)，等級(jí)相關(guān)系數(shù)r=0.930 9，P＜0.01，說(shuō)明 IL-18的表達(dá)水平同樣與EAMG大鼠的臨床癥狀嚴(yán)重程度具有緊密的相關(guān)性。見(jiàn)圖2。

圖2 Lennon癥狀評(píng)分與IL-18表達(dá)水平的線性回歸曲線Fig.2 Lennon symptom score and level of expression of IL-12 linear regression curve

3 討論

乙酰膽堿受體抗體(Acetylcholine receptor antibody，AchR-ab)與神經(jīng)肌肉接頭處(Neuromus-cular junction，NMJ)突觸后膜的乙酰膽堿受體(Acetylcholine receptor，AchR)特異性結(jié)合，加速AchR的降解，導(dǎo)致突觸后膜上AchR數(shù)量減少，阻礙了神經(jīng)電信號(hào)的傳導(dǎo)是MG產(chǎn)生的主要原因。干擾素-γ(Interferon-gamma，IFN-γ)是Th1 類細(xì)胞因子，在MG 患者和 EAMG 大 鼠 中 均 有 高 水 平 的 表 達(dá)［5，6］，并 與AchR-ab之間在表達(dá)水平上呈正相關(guān)系，IFN-γ可能作為效應(yīng)因子參與了MG的發(fā)病過(guò)程。大量的研究［7-9］表明:IL-12具有促進(jìn)IFN-γ的分泌、調(diào)節(jié) Th1細(xì)胞的應(yīng)答、與IL-18的協(xié)同誘導(dǎo)IFN-γ分泌等生物學(xué)效應(yīng)。Sitaraman等［10］通過(guò)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn):給予EAMG小鼠不同劑量的IL-12，其臨床癥狀會(huì)隨著給予劑量的增加而加重。Moiola等［11］在研究中還發(fā)現(xiàn):IFN-γ基因被敲除的小鼠在被給予IL-12后并沒(méi)有EAMG癥狀。IL-18是具有多種生物學(xué)效應(yīng)的前炎性細(xì)胞因子，可以高水平地誘導(dǎo)IFN-γ的產(chǎn)生，還可以同時(shí)調(diào)節(jié)Th1和Th2類應(yīng)答的細(xì)胞因子，在EAMG的發(fā)病過(guò)程中具有高水平的表達(dá)［12］。本研究也證明，IL-12、IL-18在EAMG大鼠的血清中均具有較高水平的表達(dá)，并且IL-12和IL-18均與Lennon癥狀評(píng)分呈線性正相關(guān)的關(guān)系，說(shuō)明IL-12和IL-18在EAMG的發(fā)病過(guò)程中具有重要的作用，并與EAMG病情的嚴(yán)重程度緊密相關(guān)。盡管IL-12和IL-18在EAMG的發(fā)病過(guò)程中具有重要、特殊和復(fù)雜的作用，但其主要作用機(jī)制與強(qiáng)力誘導(dǎo)IFN-γ的生成和表達(dá)有關(guān)。此外，MG主要是由于Th1和Th2類免疫應(yīng)答異常而導(dǎo)致的一種自身免疫性疾病，IL-12、IL-18還可能通過(guò)調(diào)節(jié)Th1和Th2類的免疫應(yīng)答參與了MG的發(fā)病過(guò)程。

國(guó)內(nèi)中醫(yī)學(xué)者［13-15］認(rèn)為MG患者以虛證居多，其病因多由起居失常、勞逸失衡、飲食不節(jié)和七情內(nèi)傷所致，其病位主要在脾腎二臟，其病機(jī)主要為脾胃虛弱致氣血化生乏源，或腎陽(yáng)不足至精血虧虛，以致筋肉失于濡養(yǎng)，久之導(dǎo)致機(jī)體頹痿無(wú)力?！皽仃?yáng)補(bǔ)氣”針?lè)ǜ鶕?jù)MG患者脾氣虛弱，腎陽(yáng)不足的主要病機(jī)，取手陽(yáng)明經(jīng)穴之手三里，取足陽(yáng)明經(jīng)穴之足三里，堅(jiān)持了“治痿獨(dú)取陽(yáng)明”的治療原則;同時(shí)，脾為“后天之本”、“氣血生化之源”，腎為“先天之本”，藏命門之火，取脾俞、腎俞兩穴，通過(guò)溫補(bǔ)“先天之本”，健運(yùn)“后天之本”，以調(diào)節(jié)脾腎二臟之虛弱不足，達(dá)到了溫陽(yáng)補(bǔ)髓、益氣養(yǎng)血、濡潤(rùn)宗筋、補(bǔ)氣助力、壯肌治痿的治療目的。通過(guò)本研究可發(fā)現(xiàn):“溫陽(yáng)補(bǔ)氣”針?lè)梢灾苯咏档虴AMG大鼠血清中IL-12和IL-18的表達(dá)水平，繼而抑制IFN-γ的生成表達(dá)，已達(dá)到治療EAMG大鼠重癥肌無(wú)力的作用;“溫陽(yáng)補(bǔ)氣”針?lè)▽?duì)EAMG大鼠具有良好的治療作用，其治療效果與溴吡斯的明相近，推測(cè)該針?lè)▽?duì)人體MG癥狀同樣會(huì)具有較好的治療作用，但人體MG的病因及癥狀明顯比EAMG大鼠復(fù)雜，其具體治療作用有待通過(guò)系統(tǒng)的臨床研究進(jìn)行證實(shí)。

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