仉 潔 郝京生 李俊甫 邢龍龍 劉志文 鐘 理 劉 薇

(河北大學生命科學學院，保定 071002)

CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Tregs)是近年來逐漸被人們認識的一類新型的具有免疫抑制功能的T細胞亞群，其可以分為天然調(diào)節(jié)性T細胞(natural Tregs，nTregs)和誘導產(chǎn)生的適應(yīng)性調(diào)節(jié)性 T細胞(inducible Tregs，iTregs)，nTregs在胸腺中發(fā)育，在維持機體免疫耐受、移植免疫和腫瘤免疫逃逸等方面發(fā)揮著重要作用［1］;iTregs是由CD4+T細胞在某些特定生理條件下在外周誘導分化而來。Tregs可通過細胞間的直接接觸和分泌大量IL-10、TGF-β等機制抑制多種免疫細胞，如B細胞、NK細胞、CD4+T細胞、DC細胞和 CIK細胞。Tregs表面主要的特異性標記有CD4、CD25、Foxp3等，其中Foxp3在Tregs發(fā)生及功能維持中起著重要的作用，被認為是Tregs的主要調(diào)控基因，可作為nTregs的特異性鑒定和功能特異性標志。nTregs主要分布于人體的胸腺、外周血、淋巴器官及臍靜脈血中，在小鼠和健康人體中約占外周 CD4+T細胞5%～10%［2］，新生兒、幼兒與成人外周血中 nTregs含量無明顯差異，但臍血來源廣泛。由于Tregs在體內(nèi)含量低，體外的培養(yǎng)擴增又面臨很大的困難，造成Tregs的數(shù)量遠遠低于臨床用量，因此限制了其在臨床治療上的應(yīng)用。近來研究證實聯(lián)合應(yīng)用CD3/CD28單抗和高濃度的IL-2可提高CD25及Foxp3在細胞內(nèi)的表達，并且IL-2能在體外誘導CD4+CD25－T 細胞轉(zhuǎn)化為 CD4+CD25+Tregs［3］，IL-7可維持CD4表達［4］，因此本研究旨在初步探討IL-7聯(lián)合IL-2對新生兒臍血CD4+CD25－T細胞誘導成為CD4+CD25+Tregs增殖的影響，以滿足臨床對CD4+CD25+Tregs數(shù)量的需求。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 CD4+CD25+Tregs磁分選試劑盒、抗人CD3/CD28單克隆抗體(mAbCD3/CD28)購自德國MACS公司;改良型RPMI1640培養(yǎng)基購自美國 HyClone公司;胎牛血清(Fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自Excell公司;重組人白細胞介素7(rh IL-7)購自美國PeproTech公司;重組人白細胞介素2(rh IL-2)購自北京四環(huán)生物制藥有限公司;CD4-PE、CD25-FITC、Foxp3-APC 購自 eBioscience公司;MTS試劑購自美國Promega公司;DMSO購自美國Sigma公司;Ficoll淋巴細胞分離液(1.077±0.002)g/ml購自天津灝洋生物制品科技有限責任公司;一次性培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板等耗材購自德國Corning公司。

1.2 標本 新生兒臍血采自婦產(chǎn)科足月健康新生兒，胎兒娩出后立即從胎盤臍靜脈穿刺采血放入含有28ml保存液的采血袋中。外周血取自健康志愿者。所有血液樣本均在采樣后4 h內(nèi)送達實驗室。

1.3 CD4+CD25－T細胞分選、鑒定及純化 采用常規(guī)的密度梯度離心法分離臍血及成人外周血單個核細胞，用生理鹽水洗滌細胞3遍，放入培養(yǎng)瓶中，37℃，體積分數(shù)5%CO2，完全飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育過夜，去除黏附細胞后，調(diào)整細胞濃度進行MACS免疫磁珠分選，CD8、CD19、CD123和CD127雞尾酒抗體陰性分選得到CD4+T細胞，結(jié)合CD25抗體的磁珠陽性分選出CD4+CD25+T細胞和陰性分選出CD4+CD25－T細胞。CD4-PE和CD25-FITC染色劑對CD4+CD25－T細胞染色，流式細胞儀檢測所得該細胞純度。

1.4 體外添加不同濃度細胞因子IL-7誘導CD4+CD25－T細胞的增殖 將上述分離出的 CD4+CD25－T細胞調(diào)整細胞濃度至1×106個/ml，加入24孔培養(yǎng)板中，依據(jù)加入細胞因子IL-7濃度的不同分為4組，即 A1組(2 ng/ml)，A2組(4 ng/ml)，A3組(6 ng/ml)，陰性對照組(0 ng/ml)，每組設(shè)4個復孔，于培養(yǎng)第1天和第3天同時加入IL-7和mAb-CD3/CD28(2 μg/ml)。各組細胞每隔兩天半量換液，同時只補充細胞因子IL-2(2 000 U/ml)，37℃，體積分數(shù)5%CO2，完全飽和濕度進行培養(yǎng)。培養(yǎng)第3周用流式細胞術(shù)檢測擴增后各組細胞CD4及CD25的表型變化。

1.5 CD4+CD25+T細胞體外培養(yǎng)條件 調(diào)整CD4+CD25+T細胞濃度至1×106個/ml，用含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，培養(yǎng)第1天加入IL-2(2 000 U/ml)，同時加入mAbCD3/CD28(2 μg/ml)，37℃，體積分數(shù) 5%CO2，完全飽和濕度進行培養(yǎng)。培養(yǎng)第3周用流式細胞術(shù)檢測擴增后CD4+CD25+T細胞CD4及CD25的表型變化。

1.6 細胞活力及細胞計數(shù)的測定 將細胞樣本與0.2%的臺盼藍按照1∶1比例混勻染色后，靜置3～4 min。用Countstar細胞計數(shù)儀分別計數(shù)活細胞數(shù)，死細胞數(shù)和細胞活率。細胞活率=(染色陰性細胞數(shù)/細胞總數(shù))×100%。

1.7 誘導生成的CD4+CD25+T細胞增殖抑制試驗

MTS法檢測體外誘導擴增的iTregs及擴增后的nTregs對成人外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)的增殖抑制作用。細胞培養(yǎng)第21天，用結(jié)合CD25抗體的磁珠從IL-7組陽性分選出誘導生成的CD4+CD25+Tregs，PBMCs與CD4+CD25+Tregs細胞數(shù)的比例分別為 2∶1、1∶1，PBMCs的起始細胞數(shù)為8×104個，Tregs的起始細胞數(shù)分別為4×104個、8×104個，混合培養(yǎng)于96孔板中，加入 mAbCD3(2 μg/ml)及 IL-2(1 000 U/ml)刺激共培養(yǎng)5 d。培養(yǎng)終止前4 h，每孔加入20 μl MTS試劑，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶聯(lián)免疫分析儀上檢測波長為 492 nm 的光密度(OD)值［5］。抑制PBMC的增殖(%)=［(未含有Tregs的孔中被刺激的PBMC細胞的吸光率－加入Tregs后的被刺激的PBMC細胞的吸光率)/未含有Tregs的孔中被刺激的PBMC細胞的吸光率］×100%。

1.8 Real-time PCR檢測體外擴增的各組細胞內(nèi)因子表達 Trizol法分別提取純化nTregs及iTregs總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以其為模板進行PCR擴增。Real-time PCR根據(jù)試劑盒說明書將1 μl cDNA置于10 μl含有PCR引物的反應(yīng)體系中，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性 30 s，隨后 95℃ 3 s，60℃ 30 s，共 40 個循環(huán)。引物序列如表1所示。

1.9 統(tǒng)計學分析 相對Real-Time PCR結(jié)果的分析方法為2－△△Ct法，用SPSS17.0統(tǒng)計學軟件進行分析，計量資料以表示。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 CD4+CD25+Treg細胞的純度和活性 免疫磁珠分選出的CD4+CD25－T細胞經(jīng)流式細胞儀檢測，CD4+CD25－T 細胞占 95.08% ±0.87%(n=3，下同，P＜0.01)(圖1A)，表明起始時主要是 CD4+CD25－T細胞。免疫磁珠分選出的CD4+CD25+T細胞占94.43% ±0.40%(P＜0.01)(圖1B)。細胞計數(shù)儀檢測免疫磁珠分選后CD4+CD25－T細胞的活率為90.39% ±8.52%(P＜0.05)，CD4+CD25+T細胞活率為92.67% ±5.56%(P＜0.05)。

2.2 體外擴增nTregs和iTregs后的流式檢測結(jié)果

經(jīng)過3周的體外培養(yǎng)，各組細胞均有較明顯的增殖(如圖2所示)，鏡下觀察可見細胞飽滿透亮，聚集成團，呈現(xiàn)集落樣生長，隨培養(yǎng)時間的增長，集落數(shù)增多，組成集落的細胞數(shù)亦增多，細胞呈現(xiàn)堆積樣(如圖3所示)。免疫磁珠分選后nTregs的擴增倍數(shù)為(30±6)倍，細胞純度隨擴增倍數(shù)的增加而下降，由培養(yǎng)前的94.43% ±0.40%下降到83.17% ±4.35%(P＜0.05)。CD4+CD25－T細胞培養(yǎng)前CD4+CD25+T細胞的比例為0.36% ±0.55%，IL-7試驗組的平均擴增倍數(shù)為(105±3)倍，各組間無顯著性差異(P＞0.05)，加入不同濃度IL-7培養(yǎng)后反應(yīng)體系中的CD4+CD25+T細胞比例明顯上調(diào)，即不同試驗組A1組(2 ng/ml)為59.93% ±1.45%，A2組(4 ng/ml)為80.21% ±1.65%，A3組(6 ng/ml)為 71.70% ±1.21%;陰性對照組(0 ng/ml)擴增倍數(shù)為(90±4)倍，CD4+CD25+T細胞比例為59.31% ±6.32%，(如圖4所示)，各組間有顯著性差異(P＜0.05)。

表1 各基因引物序列及產(chǎn)物片段大小Tab.1 Primer sequence and product size for each gene

圖1 細胞免疫磁珠分選后的流式細胞儀檢測結(jié)果Fig.1 Percentage of Tregs after purification with MACS beads

圖2 各組細胞擴增倍數(shù)的比較Fig.2 Comparison of amplification multiples between each group

圖3 培養(yǎng)過程中的細胞形態(tài)變化(×100)Fig.3 Changes of cells morphology in process of culture(×100)

圖4 各組細胞擴增后的流式細胞儀檢測結(jié)果Fig.4 FACS results of every groups after amplification in vitro

2.3 體外擴增后的CD4+CD25+T細胞對PBMCs增殖的抑制試驗 為進一步了解擴增后CD4+CD25+Tregs的免疫抑制功能，我們通過MTS法鑒定擴增后CD4+CD25+Tregs對PBMCs的增殖是否存在抑制作用，結(jié)果顯示有明顯的抑制作用，并且抑制率呈濃度依賴性(如圖5所示)，說明體外擴增的CD4+CD25+Tregs具有免疫抑制功能(P＜0.05)(如圖6、7所示)。

2.4 RT-PCR檢測 Foxp3、IL-10和 TGF-β的 mRNA表達 在體內(nèi)，IL-10和TGF-β屬于可溶性抑制因子，是Tregs產(chǎn)生抑制效應(yīng)的活性分子，可直接或間接參與Tregs的活化及抑制性作用。Tregs控制炎癥和自身平衡擴增的體內(nèi)模型上顯示出IL-10的抑制功能，Powrie等［7］在大腸炎小鼠模型上，證實IL-10是Tregs對抗原刺激后的T細胞產(chǎn)生抑制作用的關(guān)鍵分子，但不能抑制初始T細胞。結(jié)果顯示IL-7誘導組和陰性對照組較nTregs可產(chǎn)生較多的抑制性細胞因子:IL-10、TGF-β，但降低了轉(zhuǎn)錄因子 Foxp3的表達(如圖8所示)。

圖5 擴增后的CD4+CD25+Tregs對異體PBMCs增殖的抑制率與濃度之間的關(guān)系Fig.5 Relationship between inhibitory rates of CD4+CD25+T cells on allo PBMCs

圖6 擴增后的CD4+CD25+Tregs對PBMCs增殖的影響Fig.6 Inhibitory effect of CD4+CD25+Tregs on proliferation of PBMCs

圖7 擴增后的CD4+CD25+Tregs對PBMCs的增殖抑制Fig.7 Inhibitory effect of CD4+CD25+Tregs on proli-feration of PBMCs

圖8 Foxp3、IL-10和TGF-β的mRNA在Tregs中的表達Fig.8 Foxp3，IL-10 and TGF-β mRNA in Tregs

3 討論

Tregs在針對自身抗原和外來抗原的免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵調(diào)控作用，其缺乏或功能性的缺陷將導致多重病理性的失調(diào)，多項研究證實，在不明復發(fā)性流產(chǎn)、類風濕性關(guān)節(jié)炎等多種疾病患者體內(nèi)，Tregs數(shù)量顯著低于正常水平［8，9］。Tregs可通過產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)細胞因子如IL-10、TGF-β等調(diào)節(jié)Tregs與Th17細胞的平衡來控制自身反應(yīng)性或直接對效應(yīng)T細胞產(chǎn)生抑制作用［10］。因此，將Tregs應(yīng)用于移植免疫和免疫耐受的誘導中，有望降低免疫排斥反應(yīng)。但由于在體外nTregs增殖較慢，細胞活性較低且對常用抗原的無反應(yīng)性，使Tregs的體外擴增成為免疫學的一大難題，這就限制了其在臨床治療領(lǐng)域的應(yīng)用。近年研究表明，在體外可用CD4+CD25－T細胞為前體細胞，通過各種細胞因子的刺激，CD4+CD25－T 細胞可以轉(zhuǎn)化為 Tregs［10］。

IL-7是一種多效細胞因子，對維持CD4+T細胞的動態(tài)增殖起重要作用，可以延長CD4+T細胞的存活［4］。有證據(jù)表明，IL-7可以抑制由IL-2引起的激活誘導死亡效應(yīng)［12］。IL-2在CD25及Foxp3持續(xù)高表達中發(fā)揮重要作用［13］。國內(nèi)外已有研究證實給患者回輸臍血來源的nTregs療效明顯，且無毒副作用、安全性及耐受性良好［14］。在本試驗研究中，我們同時采用 IL-7、IL-2和 mAbCD3/CD28對臍血CD4+CD25－T細胞進行體外誘導培養(yǎng)，結(jié)果顯示，CD4+CD25－T細胞可被誘導成為具有較強免疫抑制功能的成熟iTregs，2～3周后可見細胞因子IL-7誘導產(chǎn)生的iTregs擴增倍數(shù)明顯高于nTregs的擴增(P＜0.05)，而且iTregs保持了nTregs的主要表型，更重要的是應(yīng)用IL-7、IL-2和mAbCD3/CD28誘導產(chǎn)生的iTregs與nTregs有著相似的抑制功能。IL-7可以提高CD4及CD25細胞表型表達，大大提高擴增倍數(shù)，與文獻報道一致［15］，iTregs較 nTregs可產(chǎn)生較多的抑制性細胞因子如:IL-10、TGF-β。為建立移植免疫耐受、自身免疫疾病的治療等提供一條新的途徑，由于本試驗中樣本數(shù)量有限，國內(nèi)外的參考數(shù)據(jù)不足，所以不排除個體差異造成的結(jié)果上的偏倚，仍需大量的研究對本試驗的結(jié)論進行驗證，并且克服體外擴增 iTregs的缺陷，繼續(xù)加深 IL-7對iTregs產(chǎn)生機制的認識。

［1］Sakaguchi S，Yamaguchi T，Nomura T，et al.Regulatory T cells and immune tolerance［J］.Cell，2008，133(5):775-787.

［2］Sakaguchi S.Regulatory T cells:history and perspective ［J］.Methods Mol Biol，2011，707:3-17.

［3］Shi Q，Cao H，Liu J，et al.CD4+Foxp3+regulatory T cells induced by TGF-beta，IL-2 and all-trans retinoic acid attenuate obliterative bronchiolitis in rat trachea transplantation［J］.Int Immuno-pharmacol，2011，11(11):1887-1894.

［4］Seddon B，Tomlinson P，Zamoyska R.Interleukin 7 and T cell receptor signals regulate homeosta-sis of CD4 memory cells［J］.Nat Immunol，2003，4(7):680-686.

［5］Terme M，Chaput N，Combadiere B，et al.Regulatory T cells control dendritic cell/NK cell cross-talk in lymph nodes at the steady state by inhibiting CD4+self-reactive T cells［J］.J Immunol，2008，180(7):4679-4686.

［6］Gao Z，Gao Y，Li Z，et al.Synergy between IL-6 and TGF-beta signaling promotes FOXP3 degra-dation［J］.Int J Clin Exp Pathol，2012，5(7):626-633.

［7］Powrie F.Immune regulation in the intestine:a balancing act between effector and regulatory T cell responses［J］.Ann N Y Acad Sci，2004，1029:132-141.

［8］易 姣，劉雨生.原因不明復發(fā)性流產(chǎn)患者主動免疫治療后調(diào)節(jié)性T細胞比例變化及意義［J］.中國優(yōu)生與遺傳雜志，2010，18(4):77-78.

［9］陳瑞林，陶 怡，邱可為，等.類風濕關(guān)節(jié)炎患者Treg細胞變化及與病情活動度的關(guān)系［J］.南方醫(yī)科大學學報，2012，32(6):886-889.

［10］楊麗娟，單保恩.Th17細胞與Th1、Treg細胞關(guān)系的研究進展［J］.免疫學雜志，2010，26(4):353-355.

［11］Razmara M，Hilliard B，Ziarani AK，et al.CTLA-4 x Ig converts naive CD4+CD25－T cells into CD4+CD25+regulatory T cells［J］.Int Immunol，2008，20(4):471-483.

［12］Le HK，Graham L，Miller CH，et al.Incubation of antigen-sensitized T lymphocytes activated with bryostatin 1+ionomycin in IL-7+IL-15 increases yield of cells capable of inducing regression of melanoma metastases compared to culture in IL-2［J］.Cancer Immunol Immunother，2009，58(10):1565-1576.

［13］Gupta SK，Choudhury S，Srivastava N，et al.Zona pellucida glycoproteins based immunocontra-ceptive vaccines:strategies for development and their applications［J］.Indian J Exp Biol，2003，41(7):682-693.

［14］Brunstein CG，Miller JS，Cao Q，et al.Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood:safety profile and detection kinetics［J］.Blood，2011，117(3):1061-1070.

［15］Heninger AK，Theil A，Wilhelm C，et al.IL-7 abrogates suppr-essive activity of human CD4+CD25+FOXP3+regulatory T cells and allows expansion of alloreactive and autoreactive T cells［J］.J Immunol，2012，189(12):5649-5658.