王汝杰 劉復(fù)州 沈偉偉 胡 旭 陳 培 毛德舉 卓云云 陳武桂 周 躍 初同偉

(第三軍醫(yī)大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，重慶 400037)

惡性腫瘤患者大部分死于轉(zhuǎn)移，骨骼是腫瘤最常見的轉(zhuǎn)移部位之一［1］。腫瘤細(xì)胞到達(dá)骨組織定居并釋放大量因子，與骨細(xì)胞及腫瘤相關(guān)免疫細(xì)胞相互作用，引起破骨細(xì)胞異常活化，導(dǎo)致骨溶解破壞，而骨破壞后又可釋放多種因子促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，形成惡性循環(huán)。在此過程中眾多的腫瘤相關(guān)細(xì)胞因子及信號(hào)通路發(fā)揮了重要的作用［2］。腫瘤一旦發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，將引起嚴(yán)重的骨痛、病理性骨折、惡性高鈣血癥、脊髓壓迫等骨相關(guān)事件，嚴(yán)重影響患者的生存時(shí)間和生活質(zhì)量［3］。

Jagged1為Ⅰ型跨膜蛋白，是Notch受體的重要配體之一。當(dāng)Jagged1與Notch受體結(jié)合后激活Notch通路，首先Notch的胞外段被細(xì)胞外基質(zhì)金屬蛋白酶切割，再被γ-分泌酶復(fù)合體識(shí)別并將Notch的胞內(nèi)段酶切，釋放Notch的活性片段NICD，NICD轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核內(nèi)與DNA結(jié)合蛋白CSL及Mastermindlike蛋白結(jié)合形成三聚體，使CSL蛋白由原來的轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)轉(zhuǎn)換為激活狀態(tài)。Jagged1與腫瘤的發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，Jagged1高表達(dá)的前列腺癌和乳腺癌預(yù)后不佳。Kung等［3］通過全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)發(fā)現(xiàn)我國及中歐混血人群中Jagged1的多態(tài)性與骨密度密切相關(guān)。但Jagged1對(duì)破骨細(xì)胞的作用目前尚不清楚。本研究通過探討Jagged1/Notch通路對(duì)破骨細(xì)胞的作用，為進(jìn)一步研究Notch通路在腫瘤骨轉(zhuǎn)移中的作用機(jī)制提供支持。

1 材料與方法

1.1 主要材料 RAW 264.7細(xì)胞系(ATCC，美國)，胎牛血清(Gibco，美國)，DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰酶和青鏈霉素雙抗(HyClone，美國)，鼠重組RANKL(R＆D，美國)，Jagged1重組蛋白(義翹神州，北京)，γ-分泌酶抑制劑{3，5-二氟笨乙酰-L-丙氨酰-S-苯基甘氨酸 t-丁酯 N-［N-(3，5-difluorophenacetyl)-L-alanyl］-S-phenylglycine t-butyl ester，DAPT}和 TRAP 染色試劑盒(Sigma，美國)，兔抗人Notch1多克隆抗體(Abnova，美國)，山羊抗兔 FITC熒光二抗(中杉金橋，北京)，RNAiso Plus、PrimeScript?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光染料SYBR?Premix EX TaqTMII試劑盒(TaKa-Ra，日本)，CCK-8 試劑盒(碧云天，北京)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 RAW 264.7細(xì)胞用含10%胎牛血清及100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，2～3 d換液1次。將RAW 264.7細(xì)胞分為三組:對(duì)照組(10%胎牛血清+DMEM+100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素+鼠重組RANKL 50 ng/ml)、Jagged1組(10%胎牛血清+DMEM+100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素+鼠重組RANKL 50 ng/ml+50 ng/ml Jagged1重組蛋白)、DAPT組(10%胎牛血清+DMEM+100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素+鼠重組RANKL 50 ng/ml+50 ng/ml Jagged1重組蛋白+10 nmol/L DAPT)。接種細(xì)胞當(dāng)天計(jì)為0 d，第3、6天換液同0 d。

1.2.2 Real-time PCR檢測破骨細(xì)胞標(biāo)志基因及Notch通路下游靶基因mRNA的表達(dá) RAW264.7細(xì)胞約5×105個(gè)接種于25 cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，按分組誘導(dǎo)培養(yǎng)。各組細(xì)胞培養(yǎng)至第3天提取細(xì)胞總RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后實(shí)時(shí)定量PCR檢測組織蛋白酶K(Cathepsin K，CK)、抗酒石酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase，TRAP)、降鈣素受體(Calcitionin receptor，CTR)及Notch通路下游靶基因Hes-1、Hey-1的mRNA表達(dá)。引物序列見表1，由大連寶生物工程有限公司設(shè)計(jì)合成。反應(yīng)條件:95℃ 30 s 1個(gè)循環(huán);95℃ 5 s、60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)?；蛳鄬?duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt方法計(jì)算表達(dá)。

1.2.3 TRAP染色檢測RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化情況 96孔板內(nèi)各分組每孔接種細(xì)胞約1 ×103個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)體系 1 000 μl，培養(yǎng)第 6 天按TRAP試劑盒說明行TRAP染色，細(xì)胞漿呈玫瑰紅且細(xì)胞核≥3為TRAP+破骨細(xì)胞。低倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.4 掃描電鏡檢測骨陷窩的形成 牛皮質(zhì)骨硬組織切片機(jī)切割成100 μm厚的薄片，細(xì)砂紙打磨至50 μm厚，切成大小約4 mm ×4 mm，75%乙醇沖洗3次，放于75%乙醇中浸泡過夜，無菌PBS沖洗3次，48孔培養(yǎng)板中高糖DMEM培養(yǎng)基中孵育24 h。每孔放置1片骨片，每孔接種約2×105個(gè)細(xì)胞，每3 d換液1次，第9天超純水沖洗骨片3次，每次5 min，清除骨片上的細(xì)胞，梯度乙醇脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥，噴金，掃描電鏡觀察骨吸收陷窩。于200倍下隨機(jī)選取5個(gè)視野，用Image-Pro plus6.0軟件分析溶骨面積所占整個(gè)視野面積的百分率。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for real-time fluorescence quantitative-PCR

1.2.5 細(xì)胞免疫熒光檢測NICD的表達(dá) 每個(gè)共聚焦培養(yǎng)皿種植RAW264.7細(xì)胞約104個(gè)，接種24 h換為含0.5% 胎牛血清的高糖DMEM饑餓培養(yǎng)24 h，再按分組換液:對(duì)照組(10%胎牛血清+DMEM+100 U/ml青霉素 +100 μg/ml鏈霉素)、Jagged1組(10%胎牛血清+DMEM+100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素+50 ng/ml Jagged1重組蛋白)、DAPT組(10%胎牛血清+DMEM+100 U/ml青霉素+100 μg/ml鏈霉素 +50 ng/ml Jagged1重組蛋白+10 nmol/L DAPT)。72 h后行激光共聚焦免疫熒光檢測。

1.2.6 CCK-8檢測細(xì)胞的增殖 RAW264.7細(xì)胞以2 000個(gè)/孔接種于96孔板中，含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)24 h后按同免疫熒光檢測所分組換液。每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)體系100 μl，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后加入10 μl/孔CCK-8試劑，37℃孵育2 h，在全波長掃描式多功能讀數(shù)儀上檢測波長為450 nm處各孔的吸光度(D)值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS18.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以應(yīng)表示，組間比較采用單因素方差分析，樣本間兩兩比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Jagged1重組蛋白上調(diào)RAW264.7細(xì)胞中的破骨細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá) Real-time PCR結(jié)果顯示，RAW264.7細(xì)胞在RANKL存在條件下50 ng/ml Jagged1作用6 d后，其破骨細(xì)胞標(biāo)志基因TRAP、CK、CTR mRNA的表達(dá)量與對(duì)照組相比均顯著增加(P＜0.05)。而 DAPT組較 Jagged1組TRAP、CK、CTR表達(dá)量明顯下降，但與對(duì)照組無明顯變化(圖1)。

圖1 Jagged1重組蛋白對(duì)RAW264.7細(xì)胞中的破骨細(xì)胞標(biāo)志基因表達(dá)影響Fig.1 Effects of Jagged1 on mRNA expression levels of TRAP，CK and CTR in RAW264.7 cells

2.2 Jagged1重組蛋白促進(jìn)TRAP+多核細(xì)胞的形成 TRAP染色結(jié)果顯示，在50 ng/ml Jagged1作用下RAW264.7細(xì)胞形成破骨細(xì)胞的數(shù)量明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，DAPT阻斷Notch通路后破骨細(xì)胞的數(shù)量較Jagged1組明顯降低(P＜0.05)，但與對(duì)照組無明顯差異。在光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野對(duì)破骨細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖2)。

2.3 Jagged1重組蛋白促進(jìn)骨吸收陷窩的形成 掃描電鏡顯示Jagged1重組蛋白組骨陷窩面積明顯高于對(duì)照組，DAPT組溶骨面積較Jagged1蛋白組明顯降低，但較對(duì)照組無明顯變化。掃描電鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，對(duì)溶骨面積占整個(gè)視野面積的百分率Image-Pro plus6.0軟件分析并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)照組與Jagged1重組蛋白組、Jagged1重組蛋白組與DAPT組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而對(duì)照組與DAPT組兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3)。

2.4 Jagged1上調(diào) Notch靶基因 HES-1、HEY-1 mRNA的表達(dá) Real-time PCR結(jié)果顯示，Jagged1干預(yù)3 d后，HES-1和HEY-1 mRNA的表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，γ-分泌酶抑制劑(DAPT)阻斷 Notch通路后 Jagged1組 HES-1和HEY-1表達(dá)量下降，明顯低于對(duì)照組(P＜0.05，圖4)。

2.5 細(xì)胞免疫熒光檢測NICD的熒光表達(dá) 細(xì)胞免疫熒光顯示對(duì)照組NICD主要表達(dá)于細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核，Jagged1蛋白組NICD除主要表達(dá)于細(xì)胞膜，細(xì)胞質(zhì)外細(xì)胞核表達(dá)明顯較對(duì)照組及DAPT組增強(qiáng)(圖5)。

2.6 Jagged1對(duì) RAW264.7細(xì)胞的增殖作用CCK-8結(jié)果顯示，培養(yǎng) 48h后 Jagged1組RAW264.7細(xì)胞的增殖率與對(duì)照組相比明顯降低［(0.95 ±0.12)vs(1.44 ±0.13)，P ＜0.05］，DAPT組的增殖率高于 Jagged1組［(1.41±0.12)vs(0.95±0.12)，P ＜0.05］，而 DAPT組增殖率低于對(duì)照組［(1.41±0.12)vs(1.44±0.13)，P＞0.05］，但組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖2 Jagged1蛋白誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化(TRAP染色，×400)Fig.2 Jagged1 stimulates osteoclastic differentiation(TRAP staining，×400)

圖3 Jagged1蛋白誘導(dǎo)破骨細(xì)胞分化細(xì)胞活性骨陷窩形成掃描電鏡檢測(SEM，×400)Fig.3 Jagged1 stimulates osteoclastic differentiation measured by scanning electron microscopy(SEM，×400)

圖4 Jagged1上調(diào)Notch靶基因HES-1、HEY-1 mRNA的表達(dá)Fig.4 Jagged1 upregulated mRNA expression of HES-1 and HEY-1

3 討論

肺癌骨轉(zhuǎn)移主要為破骨細(xì)胞異常活化所引起溶骨性病變?yōu)橹?。惡性循環(huán)學(xué)說可以較好地解釋腫瘤的骨轉(zhuǎn)移和骨損害。一方面，腫瘤細(xì)胞到達(dá)骨組織定居并釋放多種因子，影響成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成與破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收直接的生理平衡，另一方面，成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞及骨基質(zhì)溶解也同時(shí)釋放多種因子，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移。抑制破骨細(xì)胞異?；罨粌H可以減少骨吸收并可以減輕腫瘤負(fù)荷［5］。

圖5 免疫熒光檢測Notch活性片段NICD表達(dá)情況Fig.5 Nuclear translocation of active fragment NICDwas determined by immunofluorescence

有研究表明Jagged1在乳腺癌骨轉(zhuǎn)移標(biāo)本中較在肝、腦、肺轉(zhuǎn)移增高，可能為促進(jìn)腫瘤細(xì)胞定植于骨的特異因子［6］。Jagged1不僅與前列腺癌、乳腺癌的預(yù)后相關(guān)，還通過激活Notch通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移等。Notch通路還通過調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)等作用與腫瘤的發(fā)展相關(guān)。Notch 通路通過調(diào)節(jié) TGF-β、β-鏈蛋白、低氧［7-9］等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲，也可以通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)及血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)促進(jìn)腫瘤的侵襲［10］，并可以被MARK活化后促進(jìn)腫瘤血管的形成［11］。

我們前期發(fā)現(xiàn)血小板衍生生長因子-D(PDGFD)可以促進(jìn)破骨細(xì)胞的活化［12］，而抑制Notch通路可以抑制由PDGF-D所引起的細(xì)胞生長及血管生成［13］。本研究證實(shí)Jagged1在RANKL存在下可促進(jìn)RAW 264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞的分化并增加骨溶解的能力，而γ-分泌酶抑制劑(DAPT)阻斷Notch通路可以明顯降低其促進(jìn)破骨細(xì)胞分化及骨溶解的作用。免疫熒光顯示Jagged1可以使Notch活化并向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移，同樣通過基因表達(dá)檢測Notch下游靶基因HEY1、HES1的表達(dá)也證明了Jagged1可以使Notch活化，而加入DAPT后這些變化受到抑制，說明DAPT可以有效阻斷Notch通路。Jagged1在RANKL和M-CSF存在下可以明顯促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞形成破骨細(xì)胞個(gè)數(shù)及破骨細(xì)胞標(biāo)志基因CK、CTR、TRAP的表達(dá)，增加所形成破骨細(xì)胞的骨溶解能力，而DAPT阻斷Notch通路后可以明顯降低Jagged1促進(jìn)RAW264.7細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化及骨溶解的作用。我們還發(fā)現(xiàn)，Jagged1可以抑制RAW264.7細(xì)胞的增殖，而加入 DAPT后 Jagged1抑制RAW264.7細(xì)胞增殖作用明顯減弱。

腫瘤骨轉(zhuǎn)移所引起的骨溶解是一個(gè)多因子參與的復(fù)雜過程，目前尚無十分有效的治療手段。我們的實(shí)驗(yàn)證明DAPT可阻斷Notch通路，抑制Jagged1所引起的促破骨細(xì)胞分化和骨質(zhì)溶解。目前Jagged1活化Notch通路后如何促進(jìn)破骨細(xì)胞分化的分子機(jī)制尚不明確，DAPT在動(dòng)物肺癌骨轉(zhuǎn)移模型中的作用仍不明確，因此將Jagged1作為抑制肺癌骨轉(zhuǎn)移骨破壞的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)，仍需要進(jìn)一步的研究。

［1］Siegel R，Naishadham D，Jemal A.Cancer statistics，2013［J］.CA:Cancer J Clin，2013，63:11-30.

［2］Sterling JA，Edwards JR，Martin TJ，et al.Adances in the biology of bone metastasis:How the skeleton affects tumor behavior［J］.Bone，2011，48(1):6-15.

［3］Loftus LS，Edwards-Bennett S，Sokol GH.Systemic therapy for bone metastases［J］.Cancer Control，2012，19:145-153.

［4］Kung AW，Xiao SM，Cherny S，et al.Association of JAG1 with bone mineral density and osteoporotic fractures:a genome-wide association study and follow-up replication studies［J］.Am J Hum Genet，2010，86:229-239.

［5］Kawatani M，Osada H.Osteoclast-targeting small molecules for the treatment of neoplastic bone metastases［J］.Cancer Sci，2009，100:1999-2005.

［6］Zhang XH，Wang Q，Gerald W，et al.Latent bone metastasis in breast cancer tied to Src-dependent survival signals［J］.Cancer Cell，2009，16:67-78.

［7］Timmerman LA，Grego-Bessa J，Raya A，et al.Notch promotes epithelial-mesenchymal transition during cardiac development and oncogenic transformation［J］.Genes Dev，2004，18:99-115.

［8］Balint K，Xiao M，Pinnix CC，et al.Activation of Notch1 signaling is required for beta-catenin-mediated human primary melanoma progression［J］.J Clin Invest，2005，115:3166-3176.

［9］Bedogni B，Warneke JA，Nickoloff BJ，et al.Notch1 is an effector of Akt and hypoxia in melanoma development［J］.J Clin Invest，2008，118:3660-3670.

［10］Wang Z，Banerjee S，Li Y，et al.Down-regulation of notch-1 inhibits invasion by inactivation of nuclear factor-kappaB，vascular endothelial growth factor，and matrix metalloproteinase-9 in pancreatic cancer cells［J］.Cancer Res，2006，66:2778-2784.

［11］Zeng Q，Li S，Chepeha DB，et al.Crosstalk between tumor and endothelial cells promotes tumor angiogenesis by MAPK activation of Notch signaling［J］.Cancer Cell，2005，8:13-23.

［12］劉栓得，黃晨，許紅飛，等.PDGF-D抗體對(duì)體外破骨前體細(xì)胞分化過程影響的相關(guān)研究［J］.中國免疫學(xué)雜志，2013，29(7):681-685.

［13］Wang Z，Kong D，Banerjee S，et al.Down-regulation of platelet-derived growth factor-D inhibits cell growth and angiogenesis through inactivation of Notch-1 and nuclear factor-kappaB signaling［J］.Cancer Res，2007，67:11377-11385.