徐祎欣 樊竑冶 董冠軍 劉 飛 任德善 侯亞義

(南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院和生物醫(yī)藥技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京210093)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是一群中胚層來源的多能性成體干細(xì)胞。由于它們具有自我增殖、免疫調(diào)節(jié)和低免疫原性等特征，間充質(zhì)干細(xì)胞被應(yīng)用于研究移植、自身免疫性疾病和癌癥的治療。MSC可以來源于骨髓、臍帶、皮膚、脂肪等多種組織，其中人臍帶來源的MSC由于其來源優(yōu)勢性(腫瘤及病原體污染幾率低、獲取相對方便等)和與造血細(xì)胞的相關(guān)性，尤為引起廣泛關(guān)注[1]。

MSC對參與天然和獲得性免疫的多種免疫細(xì)胞的表型和功能都有影響，包括調(diào)控樹突狀細(xì)胞(DC)的成熟和 NK的功能[2，3]。不過目前 MSC的免疫調(diào)節(jié)功能主要集中在研究其對T細(xì)胞的抑制效應(yīng)[4]。而MSC對B細(xì)胞的調(diào)控研究還很缺乏，其作用尚未有非常明確的結(jié)論，作用機(jī)制更加不明[5]。

最近，臍帶來源的MSC已被用于小鼠疾病模型和臨床上治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)，并取得令人欣慰的療效[6-8]。由于B細(xì)胞在SLE等自身免疫性疾病的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，研究MSC對B細(xì)胞的調(diào)控顯得尤為重要。然而大量獲取人原代B細(xì)胞非常不易，原代B細(xì)胞難以進(jìn)行基因修飾也更加限制了MSC對B細(xì)胞作用機(jī)制的研究。一些臨床研究顯示，非Hodgkin淋巴瘤和SLE疾病相關(guān)[9-12]，這提示我們?nèi)朔荋odgkin淋巴瘤B細(xì)胞系可以作為研究MSC對B細(xì)胞作用的模型。

本文通過研究人臍帶來源MSC對3種B細(xì)胞系Daudi、Namalwa和Raji，在CpG刺激或無刺激下，細(xì)胞周期、凋亡、表面分子活化、細(xì)胞因子表達(dá)、信號通路等方面的影響，闡述了MSC對其調(diào)控的特征，并試圖揭示其調(diào)節(jié)機(jī)制，為解釋MSC治療B細(xì)胞相關(guān)性疾病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 臍帶來源的間充質(zhì)干細(xì)胞的分離及培養(yǎng) 臍帶取自南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院婦產(chǎn)科，正常足月妊娠剖腹產(chǎn)胎兒的臍帶。所用材料嚴(yán)格遵守醫(yī)院倫理道德，經(jīng)產(chǎn)婦及家屬同意，并經(jīng)過醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。無菌狀態(tài)下用PBS沖洗臍帶組織，剝除臍帶動脈和靜脈后，將其余部分轉(zhuǎn)入包含100 μg/ml青霉素和10 μg/ml鏈霉素(Invitrogen公司)的無菌培養(yǎng)基DMEM/F12(Gibco公司)中。用剪刀和鑷子將其剪成1～2 mm3碎塊，加入混合酶(10 U/ml透明質(zhì)酸酶、250 U/ml膠原酶Ⅱ和100 U/ml中性蛋白酶)，37℃振蕩孵育2～3 h。1 000r/min離心5 min，培養(yǎng)于含 20%FBS(Hyclone公司)的DMEM/F12完全培養(yǎng)基中，5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)細(xì)胞。3～4d后換液，待細(xì)胞長至70% ～80%匯合，用0.25%胰酶消化(Invitrogen公司)，常規(guī)傳代后逐漸降低FBS含量至10%的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)。取4～5代細(xì)胞分析其表面標(biāo)志CD105+CD73+CD90+HLA-ABC+CD29+CD44+HLA-DRCD19-CD11b-CD14-CD34-CD31-，確定為 MSC后用于試驗(yàn)。

1.2 人B細(xì)胞系的培養(yǎng)及與MSC的共培養(yǎng) 人B細(xì)胞株Daudi、Namalwa和Raji細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，培養(yǎng)于含10%FBS和雙抗的 RPMI1640(Gibco公司)培養(yǎng)基中，置于 5%CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。細(xì)胞復(fù)蘇1周后使用，連續(xù)培養(yǎng)不超過3個(gè)月。間充質(zhì)干細(xì)胞以2×104個(gè)細(xì)胞/ml的密度接種于24孔或12孔板，RPMI1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)過夜，換新培養(yǎng)基并按比例加入B細(xì)胞系細(xì)胞(MSC∶B 細(xì)胞 =1∶10 或1∶1)共同培養(yǎng)，0.4 μmol/L CpG刺激或無刺激6～72 h后收取懸浮細(xì)胞(B細(xì)胞系細(xì)胞)進(jìn)行檢測。人工合成硫代CpG-ODN 2006(Invitrogen公司)，序列為 TCGTCGTTTTGTCGTTTTGTCGTT。部分試驗(yàn)中，10 μmol/L COX抑制劑吲哚美辛(Sigma公司)預(yù)處理MSC 2 h，或10 μmol/L ERK抑制劑U0126(Beyotime公司)預(yù)處理Daudi細(xì)胞2 h，再混合兩種細(xì)胞培養(yǎng)。Transwell實(shí)驗(yàn)中，Transwell 6孔板(Corning公司)每孔上層小室接種4×104MSC，下層接種4×105Daudi細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞周期和凋亡檢測 收取懸浮的B細(xì)胞，PBS洗滌離心兩次，70%乙醇4℃固定過夜。PBS洗去乙醇后，加入100 μl含10 μg/ml PI(碘化丙啶)(Sigma公司)、0.2%Triton-100和2%RNAse(Sigma)的染液，室溫避光孵育30 min。PBS洗滌后重懸于BD流式管，流式細(xì)胞儀(BD公司)檢測DNA含量，每樣收取至少20 000個(gè)細(xì)胞。ModFit軟件分析結(jié)果。細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)用binding緩沖液重懸細(xì)胞于流式管，先后加入0.5 μl Annexin V-FITC試劑(BD公司)和2 μl 10 μg/ml PI染液，避光孵育10 min后，流式細(xì)胞儀檢測。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞表面標(biāo)志 收集各組懸浮的B細(xì)胞系細(xì)胞轉(zhuǎn)至BD流式管，流式專用PBS洗滌兩次，每組設(shè)3重復(fù)樣，每管約5×105細(xì)胞、100 μl體系，加入同型對照和相應(yīng)熒光抗體，CD19和HLA-DR/CD86/CD40/IgM(eBiosicence公司)雙染色標(biāo)記，避光孵育30 min，專用PBS洗滌兩次后上機(jī)檢測，每樣收集10 000個(gè)細(xì)胞。FlowJo軟件分析結(jié)果。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR檢測mRNA表達(dá) 收取B細(xì)胞系細(xì)胞，用Trizol(Invitrogen公司)提取總RNA，分光光度計(jì)(Bio-Rad公司)測定濃度。Revert AidTMFirst Strand cDNA合成試劑盒(Fermentas公司)逆轉(zhuǎn)錄mRNA，合成cDNA。以GAPDH作為內(nèi)參照，按照FastStart Universal SYBR Green Master Real Time PCR定量試劑盒說明書操作，Applied BioSystems 7300熒光定量PCR儀檢測，相對mRNA表達(dá)水平用2-△△Ct計(jì)算。引物由Invitrogen公司合成(表1)。

1.6 Western blot檢測蛋白表達(dá) 收集各組Daudi細(xì)胞，轉(zhuǎn)入eppendorf管中，PBS洗滌去除培養(yǎng)基，加入預(yù)冷細(xì)胞裂解液(含 20 mmol/L Tris-Cl，250 mmol/L NaCl，0.5%NP40，3 mmol/L EDTA，1.5 mmol/L EGTA，1 μg/ml抑酶肽，1 μg/ml亮抑酶肽，1 mmol/L DTT，1 mmol/L PMSF和 0.1 mmol/L Na3VO4)，冰上放置 30 min，12 000 r/min離心 5 min，吸取上清置于-70℃保存。使用前用BCA法測定蛋白濃度，樣品加上樣緩沖液后煮10 min，每個(gè)樣品上樣總蛋白量為100 μg，進(jìn)行10%SDS-PAGE電泳。然后100 V 90 min恒壓濕轉(zhuǎn)印蛋白至0.45 μm PVDF膜(Millipore公司)上。用含5%BSA的TBST封閉膜1.5～2 h，加入按比例稀釋于2%BSA TBST 的抗人 ERK、p38、STAT1、STAT3(Cell Signaling Technology公司)和p85(Santa Cruz Biotechnology公司)抗體，4℃孵育過夜。TBST洗3次后，分別加入1∶3 000稀釋的HRP標(biāo)記二抗，室溫孵育1 h。TBST洗3次，TBS洗1次后，用 Immobilon Western Chemiluminescent HRP substrate化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore)和 Mini Chemiluminescence imaging系統(tǒng)(賽智創(chuàng)業(yè)公司)檢測蛋白條帶。

表1 mRNA上下游引物序列Tab．1 Primers of mRNA

圖1 MSC對B細(xì)胞系細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞周期的影響Fig．1 Influence of MSC on the cell numbers and cycles of B cell lines

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 結(jié)果以x-±s表示，用單因素方差分析法(one-way ANOVA)或雙尾T檢驗(yàn)分析數(shù)據(jù)，P＜0.05時(shí)具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 MSC對B細(xì)胞系細(xì)胞周期和凋亡的影響 由于Daudi、Namalwa和Raji三種B細(xì)胞均高表達(dá)Toll樣受體9(TLR9)，我們用 TLR9激動劑 CpG-ODN 2006刺激細(xì)胞[13]。首先，我們將三種 B細(xì)胞分別和臍帶來源的MSC在CpG刺激或不刺激的情況下，以一定比例(MSC∶B=1∶10)混合培養(yǎng)3 d。輕吹培養(yǎng)液收集懸浮細(xì)胞(B細(xì)胞)，細(xì)胞計(jì)數(shù)板對小細(xì)胞(B細(xì)胞)進(jìn)行計(jì)數(shù)，PI染色檢測細(xì)胞周期，PI/Annexin-V雙染檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示，臍帶來源的MSC對3種B細(xì)胞系的細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞凋亡的影響沒有顯著性差異(圖1)，MSC阻滯Namalwa和Raji細(xì)胞于G0/G1期(圖2)。

2.2 MSC抑制B細(xì)胞系表面CD86和IgM的表達(dá)為了確定在CpG刺激與不刺激下臍帶來源MSC對B細(xì)胞活化的影響，我們將3種B細(xì)胞系分別與MSC如前所述共培養(yǎng)3 d后，用流式細(xì)胞術(shù)檢測了B細(xì)胞表面MHCⅡ類分子(HLA-DR)、共刺激分子(CD86、CD40)和IgM的表達(dá)。結(jié)果表明，無論有無CpG刺激，MSC對3種B細(xì)胞系表面MHCⅡ類分子的表達(dá)都沒有顯著影響(圖3C);但可抑制Daudi和Namalwa細(xì)胞表面CD86、IgM的表達(dá)，抑制Raji細(xì)胞CD40和在CpG刺激下CD86的表達(dá)(圖3A、B，圖4)。由于之前有報(bào)道不同混合細(xì)胞比可能得到不同的調(diào)控效果，我們分別用1∶10和1∶1的常用細(xì)胞比混合培養(yǎng)MSC和Daudi細(xì)胞，結(jié)果均可得到抑制Daudi細(xì)胞CD86的表達(dá)(圖5A)。為了證明MSC對B細(xì)胞表面分子的抑制效應(yīng)是否依賴于細(xì)胞間的相互接觸，我們進(jìn)行了Transwell小室分隔實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，使用Transwell系統(tǒng)混合培養(yǎng)MSC和Daudi細(xì)胞，同樣可下調(diào)CD86、IgM的表達(dá)，這提示MSC對Daudi細(xì)胞的調(diào)控主要是通過MSC分泌調(diào)節(jié)因子實(shí)現(xiàn)的(圖5B)。由于PGE2(前列腺素E2)是MSC可分泌的一種常見免疫調(diào)節(jié)因子[14]，我們用COX2(環(huán)氧化物酶2)抑制劑吲哚美辛處理細(xì)胞，從而減少M(fèi)SC分泌PGE2。結(jié)果顯示Daudi細(xì)胞CD86和IgM的下調(diào)程度并未減少(圖5C)，說明MSC還可通過分泌其他調(diào)節(jié)因子抑制B細(xì)胞表面分子的表達(dá)。

2.3 MSC對B細(xì)胞系細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)控 由于細(xì)胞與細(xì)胞之間可通過細(xì)胞因子的自分泌和旁分泌進(jìn)行調(diào)控，我們用實(shí)時(shí)定量PCR檢測了與臍帶來源MSC分別共培養(yǎng)6、12、24、48 h后 Daudi細(xì)胞內(nèi)相關(guān)細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，與MSC共培養(yǎng)6 h后 Daudi細(xì)胞 CCL2/MCP-1、IL-8、COX2 的mRNA水平即顯著升高，而后持續(xù)上調(diào)至少48 h;而另一重要的促炎癥因子TNF-α的水平卻沒有發(fā)生顯著變化(圖6)。

圖2 MSC對B細(xì)胞系凋亡的影響Fig．2 Influence of MSC on the apoptosis of B cell lines

圖3 MSC對B細(xì)胞系表面IgM和HLA-DR表達(dá)的影響Fig．3 Effects of MSC on the surface expression of IgM and HLA-DR

圖4 MSC對B細(xì)胞系表面共刺激分子表達(dá)的影響Fig．4 Effects of MSC on the surface expression of co-stimulatory molecules

圖5 MSC對Daudi表面CD86和IgM的抑制不依賴于細(xì)胞間相互接觸、細(xì)胞混合比例和COX2-PGE2Fig．5 Inhibitions of CD86 and IgM expression were not dependent on cell contact，cell ratio and COX2-PGE2

圖6 MSC對Daudi細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的影響Fig．6 Effects of MSC on the mRNA expression of cytokines in Daudi cells

圖7 MSC對B細(xì)胞系信號通路的調(diào)控Fig．7 The regulations of signal pathways on B cell lines by MSC

圖8 ERK信號參與MSC對Daudi細(xì)胞功能的調(diào)控Fig．8 ERK signal involves in the effect of MSC on Daudi cells

2.4 ERK信號通路參與MSC對B細(xì)胞系的調(diào)控為了進(jìn)一步研究MSC對B細(xì)胞系調(diào)控的分子機(jī)制，我們用Western blot檢測了在不同條件下與MSC共同培養(yǎng)后Daudi胞內(nèi)和胞外調(diào)節(jié)因子相關(guān)的通路(JAK-STAT、PI3K和MAPK)信號分子的蛋白表達(dá)和激活情況。結(jié)果表明，3種B細(xì)胞系無論有無CpG刺激，ERK(MAPK通路)的磷酸化水平都顯著上調(diào)，Daudi在CpG刺激下更明顯，并且呈持續(xù)增強(qiáng)(圖7A、C);而PI3K調(diào)節(jié)亞基p85、STAT1和STAT3磷酸化水平、p38(MAPK通路)的總蛋白和磷酸化水平都沒有發(fā)生非常明顯的變化(圖7B)。為了證明ERK的活化在MSC調(diào)控B細(xì)胞功能上的作用，我們用ERK特異性抑制劑U0126預(yù)處理Daudi細(xì)胞2 h(其中preU0126組在預(yù)處理后離心棄上清后重懸于無抑制劑的培養(yǎng)基)，再和MSC共培養(yǎng)3 d后檢測Daudi細(xì)胞表面分子和細(xì)胞因子mRNA的水平。結(jié)果顯示，經(jīng)過 U0126處理的 Daudi細(xì)胞的ERK激活受到部分抑制(圖7D)，MSC對Daudi細(xì)胞表面IgM和CD86表達(dá)的抑制效應(yīng)有所減弱，MSC促進(jìn)Daudi細(xì)胞CCL2 mRNA表達(dá)的效應(yīng)受到抑制(圖8)。

3 討論

目前，已有一些報(bào)道指出MSC可以調(diào)控B細(xì)胞的生長，MSC對B細(xì)胞有一定抑制作用，但是由于MSC來源和B細(xì)胞類型及刺激物等的不同，結(jié)果并不一致。在對于小鼠的研究中，MSC可抑制由CpG或有絲分裂原刺激引起的B細(xì)胞增殖，而不影響細(xì)胞凋亡[15，16]，SLE小鼠模型研究顯示MSC能抑制B細(xì)胞的生長和活化[17，18]。在人源細(xì)胞的研究中，雖然MSC對B細(xì)胞增殖的影響存在矛盾，但多數(shù)結(jié)果顯示MSC阻滯B細(xì)胞于細(xì)胞周期的G0/G1期[19，20]。我們發(fā)現(xiàn)人臍帶來源的MSC對人B細(xì)胞系細(xì)胞的凋亡沒有顯著影響，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期，這與原代B細(xì)胞的研究報(bào)道基本一致。

在CpG刺激和不刺激的情況下，我們均發(fā)現(xiàn)MSC抑制B細(xì)胞系表面IgM(3種B細(xì)胞系Ig分型均為IgM)和共刺激分子CD86的表達(dá)，這提示MSC可抑制B細(xì)胞的活化及與T細(xì)胞間的相互作用。雖然3種細(xì)胞系來源于同類淋巴瘤，但各自特性有所差異，其中Raji細(xì)胞與另外兩種細(xì)胞區(qū)別較大(如CpG對其激活作用較小)，MSC對Raji表面分子的調(diào)節(jié)也不同于其他兩種細(xì)胞系。Daudi細(xì)胞是非Hodgkin淋巴瘤的最常用模型[21]，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)中我們以Daudi為代表。以往有研究表明MSC對B細(xì)胞增殖和分化的影響非細(xì)胞間相互接觸依賴，但MSC的培養(yǎng)上清并不起作用(可能還需要B細(xì)胞的旁分泌作用)[16，19，22]。我們通過 Transwell實(shí)驗(yàn)證明MSC對B細(xì)胞CD86和IgM的表達(dá)抑制不依賴于細(xì)胞間接觸、細(xì)胞混合比例、COX2-PGE2作用，提示MSC通過分泌其他可溶性調(diào)節(jié)因子抑制B細(xì)胞功能。

我們研究發(fā)現(xiàn)MSC可以持續(xù)上調(diào)Daudi細(xì)胞CCL2、IL-8、COX2等的 mRNA表達(dá)水平，而不影響促炎癥因子TNF-α。如前所述，COX2促進(jìn)合成具有免疫抑制功能的PGE2;我們之前的研究提示IL-8參與抑制小鼠腸炎[23]。CCL2抑制抗原遞呈細(xì)胞分泌 IL-12[24]，參與抑制自身免疫性糖尿病[25]，我們最近的研究也顯示其可能參與SLE中MSC與免疫細(xì)胞之間的作用。IL-8、CCL2和COX2還與腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因而，MSC對B細(xì)胞系的調(diào)控趨于促進(jìn)其產(chǎn)生有免疫抑制效應(yīng)的細(xì)胞因子。

在細(xì)胞因子相關(guān)信號通路的研究中，我們發(fā)現(xiàn)MSC促進(jìn)3種B細(xì)胞系ERK信號通路的持續(xù)激活，ERK抑制劑削弱MSC對B細(xì)胞表面分子和細(xì)胞因子CCL2的調(diào)控。雖然ERK信號主要調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖及分化，但是最近也有研究揭示了ERK信號的另一面。Puig-Kr?ger 等[26]發(fā)現(xiàn)，使用 ERK 通路的抑制劑，可增強(qiáng)由LPS刺激引起的DC表面分子活化和IL-12的分泌;一種黑色素瘤通過激活ERK信號通路抑制DC的功能[27]。自身抗原信號通過ERK抑制CpG-DNA引起的漿細(xì)胞分化[28];Tabera等[20]的研究表明MSC促進(jìn)B細(xì)胞在CpG與抗體刺激下ERK和p38的磷酸化。我們的研究首次揭示了MSC可通過激活ERK信號通路調(diào)控B細(xì)胞的功能。

綜上所述，我們發(fā)現(xiàn)人臍帶來源的MSC不影響3種人非Hodgkin B細(xì)胞系的增殖和凋亡，可阻滯細(xì)胞周期;通過分泌可溶性物質(zhì)，抑制B細(xì)胞系表面IgM和CD86的表達(dá);增強(qiáng)COX2、CCL2、IL-8等免疫調(diào)節(jié)因子的表達(dá);促進(jìn)ERK信號的激活并從而調(diào)節(jié)細(xì)胞功能。以上研究顯示了臍帶來源MSC對于B細(xì)胞的免疫抑制調(diào)節(jié)作用，為進(jìn)一步探討MSC對B細(xì)胞的調(diào)控機(jī)制打下了研究基礎(chǔ)。

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