宋 靜 王黎麗 侯 昕 沈際佳 (安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，合肥230001)

急性肝損傷指各種原因引起的肝臟功能的損害，肝損傷是急性肝功能衰竭的基礎(chǔ)，嚴重或持續(xù)的肝損傷最終導(dǎo)致肝功能衰竭。其中，病毒性肝損傷并不是肝炎病毒在肝細胞內(nèi)復(fù)制造成的直接損傷，而是病毒感染后機體的免疫反應(yīng)造成的肝臟損傷。由于缺乏足夠的人類肝臟病變標(biāo)本和人力實驗操作的困難以及倫理學(xué)難題，研究者們建立了模擬人類肝臟病理損傷的動物模型，用來探索肝臟疾病中的免疫致病機理。

1995年，Sakaguchi等人[1]發(fā)現(xiàn)在正常人和小鼠外周血及脾臟組織的CD4+T細胞中有一亞群持續(xù)高表達CD25分子(IL-2受體α鏈)，去除該群細胞可誘導(dǎo)各種自身免疫性疾病的發(fā)生[2]，據(jù)此表明該群細胞是一類重要的免疫調(diào)節(jié)細胞，將此類細胞命名為調(diào)節(jié)性T細胞。該細胞亞群具有顯著的免疫抑制作用，可通過不同途徑作用于多種靶細胞，從而對機體免疫應(yīng)答進行精細的負調(diào)節(jié)。

本試驗中我們用病毒模擬物Polyinosinic-polycytidylic acid(poly I:C)和致敏劑D-galactosamine(D-GalN)聯(lián)合注射建立小鼠爆發(fā)性肝炎模型，該損傷主要由天然免疫細胞Kupffer細胞和自然殺傷(NK)細胞介導(dǎo)，天然免疫細胞釋放的 IFN-γ和TNF-α等炎性因子參與了肝損傷的發(fā)生發(fā)展[3]。鑒于該模型的肝臟免疫損傷可以自愈[3]，而調(diào)節(jié)性T細胞是一群具有負調(diào)節(jié)作用的T細胞亞群，它不僅可以抑制效應(yīng)T細胞的反應(yīng)，而且可以緩解天然免疫細胞引發(fā)的病理損傷[4]。故我們推測調(diào)節(jié)性T細胞可能對該肝炎模型中天然免疫細胞有負向調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 C57BL/6，SPF級，雄性，4周齡，購于安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。C57BL/6遺傳背景的Rag1-/-小鼠，SPF級，購于南京大學(xué)模式動物遺傳中心。實驗動物由安徽醫(yī)科大學(xué)寄生蟲學(xué)教研室動物房飼養(yǎng)(SPF級，22℃，55%濕度，12 h白天/黑夜)。小鼠處理過程和實驗流程遵循實驗動物管理規(guī)范條例。

1.2 主要試劑 血清轉(zhuǎn)氨酶檢測試劑盒購于上海榮盛生物技術(shù)有限公司。Poly I:C、TRIzol、M-MLV、RT buffer和MDTT購于InvivoGen公司。D-GalN購于Sigma公司。Tag酶、SYBR Premix EX Tag購于大連寶生物工程有限公司。小鼠 IFN-γ和 TNF-α ELISA檢測試劑盒購于深圳達科為公司。Anti-FITC磁珠及分選儀購于Miltenyi Biotec公司。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及材料收集 從小鼠尾靜脈處注射poly I:C(2 μg/只)，同時給小鼠腹腔注射 DGalN(10 mg/只)，建立小鼠急性肝損傷模型。于藥物注射后12、18、24和48 h，剖殺小鼠，收集血清，-80℃冰箱保存，用于血清ALT檢測及TNF-α和IFN-γ檢測。摘取小鼠肝臟，留取部分放入4%甲醛溶液中固定，石蠟包埋并切片，用于病理分析。余下肝臟放入-80℃冰箱保存，用于RT-PCR檢測。

1.3.2 血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT)檢測 采集小鼠血清樣本后，按試劑盒說明書進行檢測。通過標(biāo)準品吸光度值繪制標(biāo)準曲線，然后計算各個樣品的值。

1.3.3 肝臟HE染色 取同一部位肝臟，福爾馬林固定，脫水，石蠟包埋，連續(xù)切片HE染色，顯微鏡下隨機選擇10個低倍視野觀察炎性細胞浸潤情況及肝組織細胞壞死情況。

1.3.4 實時熒光定量PCR檢測肝臟TNF-α和IFN-γ mRNA水平 用TRIzol試劑提取肝臟總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成互補cDNA，以此為模板RT-PCR擴增片段。RT-PCR按SYBY Premis EX Tag II(TaKaRa Code DRR 041A)試劑盒說明書加樣，之后用ABI公司的StepOnePlus Real-time PCR儀檢測。目的基因引物序列 β-actin的上游引物:5'-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA-3'，下游引物:5'-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3'。TNF-α 的上游引物:5'-ACT GGC AGA AGA GGC ACT C-3'，下游引物:5'-CTG GCA CCA CTA GTT GGT TG-3'。IFN-γ的上游引物:5'-AAC GCT ACA CAC TGC ATC T-3'，下游引物:5'-GAG CTC ATT GAA TGC TTG G-3'。反應(yīng)條件:95℃ 10 s，95℃ 15 s，60℃ 40 s，40 個循環(huán)進行擴增。采用ΔΔCt方法分析結(jié)果。

1.3.5 ELISA法檢測血清IFN-γ和TNF-α蛋白水平 采集小鼠血清樣本后，按試劑盒說明書進行檢測。通過標(biāo)準品吸光度值繪制標(biāo)準曲線，然后計算各個樣品的值。

1.3.6 免疫磁珠法分選CD25+細胞 殺鼠取脾臟，無菌分離脾臟單個核細胞，按照磁珠使用說明書分選CD25+單個核細胞和CD25-單個核細胞。

1.3.7 細胞轉(zhuǎn)輸 將免疫磁珠法分選出的CD25+細胞和 CD25-細胞按 1×106個/只鼠分別給Rag1-/-小鼠尾靜脈注射，然后立刻尾靜脈處注射poly I:C(2 μg/只)，腹腔注射 D-GalN(10 mg/只)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS11.0軟件統(tǒng)計，數(shù)據(jù)以±s表示，兩組數(shù)據(jù)均值，選用獨立樣本t檢驗;組間數(shù)據(jù)比較，采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 野生型小鼠較Rag1-/-小鼠的肝臟炎癥損傷明顯加重

2.1.1 野生型小鼠和Rag1-/-小鼠poly I:C/DGalN注射后血清ALT檢測和肝臟H-E染色分析Rag1-/-小鼠在注射poly I:C/D-GalN后注射后18、24和48 h血清ALT水平均高于野生型小鼠(P＜0.05)，可見Rag1-/-小鼠在同等劑量的poly I:C/DGalN聯(lián)合注射后肝臟損傷比野生型小鼠更為嚴重。見圖1。肝臟H-E染色可見注射后18和24 h，與野生型小鼠相比Rag1-/-小鼠肝臟呈現(xiàn)嚴重的充血、肝細胞壞死以及炎癥細胞浸潤。注射后48 h，野生型小鼠肝臟損傷基本恢復(fù)正常，而Rag1-/-小鼠肝臟仍存在輕微損傷。見圖2所示。

圖1 野生型小鼠和Rag1－/－小鼠poly I:C/D-GalN注射后12、18、24和48 h檢測轉(zhuǎn)氨酶水平Fig．1 WT mice and Rag1 －/－ mice were injected with poly I:C/D-GalN at 12，18，24 and 48 hours after injection，serum ALT levels were measured

圖2 野生型小鼠和Rag1－/－小鼠poly I:C/D-GalN注射后18、24和48 h肝臟H-E染色(×100)Fig．2 WT mice and Rag1 －/－ mice were injected with poly I:C/D-GalN at 18，24 and 48 hours after injection，liver samples from mice were analyzed by HE staining(original magnification×100)

圖3 RT-PCR檢測肝臟中 TNF-α和 IFN-γ的 mRNA水平Fig．3 TNF-α and IFN-γ mRNA expression of hepatic were measured by quantitative real-time RT-PCR

圖4 ELISA檢測血清中TNF-α和IFN-γ的蛋白水平Fig．4 Serum levels of TNF-α and IFN-γ were measured by ELISA

圖5 轉(zhuǎn)輸CD25+細胞，轉(zhuǎn)輸CD25－細胞以及未轉(zhuǎn)輸細胞的Rag1－/－小鼠poly I:C/D-GalN注射后18 h檢測轉(zhuǎn)氨酶水平Fig．5 Rag1－/－ mice with transfer CD25+，transfer CD25－cells and did not transfer cells were injected with poly I:C/D-GalN，at 18 hours after injection，serum ALT levels were measured

圖6 轉(zhuǎn)輸CD25+細胞，轉(zhuǎn)輸CD25－細胞以及未轉(zhuǎn)輸細胞的Rag1－/－小鼠poly I:C/D-GalN注射后18 h肝臟H-E染色(×100)Fig．6 Rag1－/－ mice with transfer CD25+，transfer CD25－cells and did not transfer cells were injected with poly I:C/DGalN，at 18 hours after injection，liver samples from mice were analyzed by H-E staining(original magnification×100)

圖7 轉(zhuǎn)輸CD25+細胞，轉(zhuǎn)輸CD25－細胞以及未轉(zhuǎn)輸細胞的Rag1－/－小鼠poly I:C/D-GalN注射后18 h ELISA檢測血清中TNF-α和IFN-γ的蛋白水平Fig．7 Rag1－/－ mice with transfer CD25+，transfer CD25－cells and did not transfer cells were injected with poly I:C/DGalN，at 18 hours after injection，serum levels of TNF-α and IFN-γ were measured by ELISA

2.1.2 野生型小鼠和Rag1-/-小鼠poly I:C/DGalN注射后肝臟炎癥損傷相關(guān)的炎癥因子TNF-α和IFN-γ mRNA水平和蛋白水平的動態(tài)表達Poly I:C/D-GalN 注射后12、18、24和48 h Rag1-/-小鼠肝臟IFN-γ的 mRNA水平明顯高于 WT小鼠(P＜0.05)，但是 Rag1-/-小鼠肝臟 TNF-α的 mRNA水平與野生型小鼠相比無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見圖3。同野生型小鼠相比，注射后18、24和48 h Rag1-/-小鼠血清 TNF-α和 IFN-γ含量明顯升高(P＜0.05)，而在注射后12 h兩種小鼠血清TNF-α和IFN-γ水平均無明顯差異(P＞0.05)。見圖4。

2.2 過繼轉(zhuǎn)輸調(diào)節(jié)性T細胞減輕poly I:C/D-GalN誘導(dǎo)的損傷 我們通過免疫磁珠分選細胞系統(tǒng)純化得到脾臟CD25+單個核細胞純度大于90%，而且一半以上表達Foxp3，是調(diào)節(jié)性T細胞。將分離純化的脾臟CD25+單個核細胞過繼轉(zhuǎn)輸給Rag1-/-小鼠。同過繼轉(zhuǎn)輸 CD25-細胞和未轉(zhuǎn)輸細胞的Rag1-/-小鼠相比，轉(zhuǎn)輸CD25+細胞的Rag1-/-小鼠的血清ALT水平明顯降低(P＜0.05)，見圖5。肝臟H-E染色分析轉(zhuǎn)輸CD25-細胞和未轉(zhuǎn)輸細胞的Rag1-/-小鼠肝臟可見大量充血，肝細胞死亡以及大量炎性細胞浸潤。而過繼轉(zhuǎn)輸了CD25+細胞的Rag1-/-小鼠肝臟充血減輕，僅有小片的壞死區(qū)域以及少量的炎性細胞浸潤。見圖6。而且轉(zhuǎn)輸CD25+細胞的Rag1-/-小鼠的血清中炎性因子IFN-γ和TNF-α含量明顯下降。見圖7。

3 討論

本研究我們通過給小鼠注射poly I:C/D-GalN誘導(dǎo)急性肝臟損傷模型，重點探討了調(diào)節(jié)性T細胞在此模型中的免疫調(diào)節(jié)作用。在這個模型中我們發(fā)現(xiàn)沒有調(diào)節(jié)性T細胞存在的Rag1-/-小鼠由poly I:C/D-GalN誘導(dǎo)的肝臟損傷更為嚴重，而給Rag1-/-小鼠過繼轉(zhuǎn)輸調(diào)節(jié)性T細胞可以減輕poly I:C/DGalN誘導(dǎo)肝臟損傷。

根據(jù)前期的研究，我們確定了poly I:C/D-GalN可以誘導(dǎo)小鼠急性爆發(fā)性肝損傷模型，而且該損傷在2 d內(nèi)基本自愈[3]。我們推測調(diào)節(jié)性T細胞可能限制了poly I:C/D-GalN誘導(dǎo)的急性肝臟損傷。因為調(diào)節(jié)性T細胞可以調(diào)節(jié)機體免疫反應(yīng)，維持自身耐受和避免過度免疫反應(yīng)。近年來的不少研究證實調(diào)節(jié)性T細胞在急性炎癥損傷如ConA誘導(dǎo)的急性肝炎[5]，AdHBV 感染的急性肝炎[2]，LPS 誘導(dǎo)的急性肺損傷[6]和腎臟缺血再灌注損傷[7]等早期均可被誘導(dǎo)而且具有免疫調(diào)節(jié)作用，限制炎癥損傷。于是我們首先比較了野生型小鼠和Rag1-/-小鼠在poly I:C/D-GalN注射后肝臟損傷輕重的不同，Rag1-/-小鼠在同等劑量的poly I:C/D-GalN注射后，肝臟炎癥損傷加重。同時Rag1-/-小鼠肝臟局部炎性因子IFN-γ，血清中TNF-α和IFN-γ分泌均高于野生型小鼠。將分離純化的CD25+細胞過繼轉(zhuǎn)輸給Rag1-/-小鼠，發(fā)現(xiàn)同過繼轉(zhuǎn)輸CD25-細胞以及未轉(zhuǎn)輸細胞的Rag1-/-小鼠相比轉(zhuǎn)輸調(diào)節(jié)性T細胞的小鼠肝臟炎癥損傷明顯減輕。以上結(jié)果均證實沒有調(diào)節(jié)性T細胞的存在，poly I:C/D-GalN誘導(dǎo)的急性炎癥反應(yīng)加重，損傷時間延長，且與天然免疫細胞分泌的炎性因子TNF-α和IFN-γ有關(guān)，而轉(zhuǎn)輸了調(diào)節(jié)性T細胞后能夠明顯抑制炎性細胞因子的分泌和肝臟損傷。

調(diào)節(jié)性T細胞被認為主要通過抑制自身反應(yīng)性T細胞的活化和擴增，得以限制變態(tài)反應(yīng)疾病、感染、移植、移植物抗宿主反應(yīng)和癌癥中的免疫反應(yīng)強度，達到調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的目的[8-11]。但是近年來越來越多的研究顯示調(diào)節(jié)性T細胞同樣可以通過抑制天然免疫細胞來發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。如調(diào)節(jié)性T細胞可以抑制NK細胞的細胞毒作用同時降低NK細胞分泌的IFN-γ[12]。調(diào)節(jié)性T細胞可以抑制中性粒細胞的功能，促進它們凋亡和死亡[13]。調(diào)節(jié)性T細胞還可以抑制巨噬細胞促炎因子反應(yīng)[14]。腫瘤免疫中清除調(diào)節(jié)性T細胞可以促進依賴IFN-γ的巨噬細胞的聚集和活化從而抑制淋巴瘤細胞[15]。本研究中，poly I:C/D-GalN誘導(dǎo)的肝臟損傷是由天然免疫細胞介導(dǎo)，在缺失獲得性免疫細胞的Rag1-/-小鼠中依然能夠復(fù)制，并且損傷更加嚴重。而給Rag1-/-小鼠轉(zhuǎn)輸調(diào)節(jié)性T細胞后能夠明顯抑制肝臟損傷和TNF-α和IFN-γ的分泌。我們以前的研究表明TNF-α和IFN-γ分別是由肝臟中的巨噬細胞和NK細胞分泌。因此我們的結(jié)果提示調(diào)節(jié)性T細胞可以負向調(diào)節(jié)天然免疫細胞。

另外，有實驗證明調(diào)節(jié)性T細胞行使調(diào)節(jié)功能需要通過細胞-細胞接觸。這種接觸可能通過調(diào)節(jié)性T細胞表面的CTLA-4及其在效應(yīng)性T細胞的配體相互作用而完成[16]。也有一些實驗發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細胞可以通過分泌免疫抑制細胞分子IL-10和TGF-β以及誘導(dǎo)其他細胞分泌這些細胞因子來發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[6，17-19]。在本研究模型中究竟調(diào)節(jié)性T細胞如何發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用來抑制poly I:C/D-GalN誘導(dǎo)的急性爆發(fā)性肝損傷還需進一步研究。

綜上所述，我們的實驗結(jié)果顯示poly I:C/DGalN誘導(dǎo)的急性肝損傷伴隨著調(diào)節(jié)性T細胞的顯著上升。調(diào)節(jié)性T細胞在poly I:C/D-GalN誘導(dǎo)的肝損傷中對限制肝臟免疫損傷起了重要作用。目前急性肝損傷治療并無特效的藥物治療，多以支持治療為主，調(diào)節(jié)性T細胞對肝臟免疫損傷的抑制作用可以為急性肝損傷的臨床治療、藥物研發(fā)開辟新的視角。

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