司俊康 郭俊國(guó) 唐 凱 杜宇翔 郭大東 王興榮

2山東中醫(yī)藥大學(xué)眼科研究所

3山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬眼科醫(yī)院

糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量的主要致盲性眼病之一。DR的主要機(jī)制是高血糖造成的微血管病變，毛細(xì)血管功能障礙可以導(dǎo)致視網(wǎng)膜局部缺血缺氧以及由此引起的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞（retinal ganglion cell，RGC）的氧化應(yīng)激損傷〔1-3〕。研究表明，通過藥物干預(yù)可以抑制DR患者RGC的凋亡，從而改善患者的視功能〔4〕。黃芪多糖（astragalus polysaccharide，APS）是從黃芪中提取的主要活性成分，具有抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、調(diào)節(jié)血糖等作用。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)黃芪多糖對(duì)于體外培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞具有抗氧化保護(hù)作用〔5〕，但是其對(duì)體外培養(yǎng)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞是否具有抗氧化保護(hù)作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過觀察黃芪多糖對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的大鼠RGC細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，為黃芪多糖及黃芪類藥物治療DR提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

傳代培養(yǎng)的RGC細(xì)胞株RGC-5由吉林大學(xué)白求恩第二醫(yī)院眼科醫(yī)院惠贈(zèng)。RGC-5置于含10%胎牛血清（FBS）（美國(guó) Hyclone公司)，1 g/L 葡萄糖和谷氨酰胺，100 U/ml青霉素，100 U/ml鏈霉素的 Dulbecco改良 Eagle培養(yǎng)液（DMEM）（美國(guó) Hyclone公司）的培養(yǎng)瓶中，于體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；隔夜換液，然后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。 配制含 250 μg/ml、500 μg/ml、1 000 μg/ml黃芪多糖（西安奧澤生物科技有限公司）的DMEM高糖培養(yǎng)液；胰蛋白酶凍干粉（含EDTA）（美國(guó)Sigma公司）。流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司），倒置相差顯微鏡（日本 OlympusⅨ71，日本 Olympus公司），酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司），實(shí)時(shí)細(xì)胞電子分析系統(tǒng)（xCELLigence System，瑞士Roche公司），Annexin V-FITC/PI凋亡試劑盒（碧云天生物公司），噻唑藍(lán)（MTT）（美國(guó) Sigma 公司），4’，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI，美國(guó) Sigma公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

RGC-5細(xì)胞分為正常對(duì)照組、陰性對(duì)照組、過氧化氫損傷組、黃芪多糖干預(yù)組。正常對(duì)照組不做任何處理，陰性對(duì)照組和過氧化氫損傷組分別加入1 000 μg/ml的黃芪多糖和100 μmol/L的過氧化氫，黃芪多糖干預(yù)組在加入不同劑量濃度（1 000 μg/ml、500 μg/ml、250 μg/ml）黃芪多糖孵育 12 h 后加入 100 μmol/L的過氧化氫作用24 h，然后用倒置相差顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)變化。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性

采用MTT比色法檢測(cè)RGC-5細(xì)胞的活性。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RGC-5，接種于96孔板，1×104個(gè)/L。按各個(gè)分組的要求處理后，每孔加入5 mg/ml的 MTT溶液 20 μL，孵育4 h，然后棄掉上清，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）溶液 150 μl，低速振蕩 10 min，選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上測(cè)定各孔光密度，細(xì)胞活性以相對(duì)于正常對(duì)照組的百分比表示。

1.4 DAPI染色

應(yīng)用DAPI染色觀察各組細(xì)胞核形態(tài)學(xué)變化。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的RGC-5細(xì)胞，接種于6孔板，1×104個(gè)／L。按各組要求處理后，每孔用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，每孔加入4%的多聚甲醛固定液固定15 min，然后加入5 μg/ml的DAPI染色液室溫作用15 min。在倒置相差顯微鏡下觀察并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 實(shí)時(shí)細(xì)胞電子分析（RT-CES）

應(yīng)用RT-CES系統(tǒng)監(jiān)測(cè)各組細(xì)胞的生長(zhǎng)的動(dòng)態(tài)信息。RT-CES是基于檢測(cè)電子傳感器阻抗變化以反映細(xì)胞生理狀態(tài)的新型細(xì)胞分析系統(tǒng)。在RTCES系統(tǒng)中，傳感器培養(yǎng)板的底部有特殊的傳感器陣列，靶細(xì)胞可以直接生長(zhǎng)在傳感器表面，造成傳感器阻抗的變化，從而實(shí)時(shí)記錄靶細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。在RT-CES 系統(tǒng)中，應(yīng)用細(xì)胞指數(shù)（cell index，CI）來反映細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)〔6〕。將RGC-5細(xì)胞接種于16孔的RT-CES傳感器培養(yǎng)板上，密度1×104個(gè)/L，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，24 h后按上述實(shí)驗(yàn)分組處理，記錄處理后72 h內(nèi)的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各樣本經(jīng)Levene檢驗(yàn)總體方差相等，采用單因素方差分析，各組間的兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 倒置相差顯微鏡下各組細(xì)胞形態(tài)

正常生長(zhǎng)的RGC-5細(xì)胞呈扁平梭形，細(xì)胞透亮，邊緣清晰，有較短突起，隨著細(xì)胞生長(zhǎng)，突起相互連接（圖1A）。過氧化氫損傷組RGC-5細(xì)胞皺縮，細(xì)胞密度減低，軸突縮短（圖1C）。其他各組RGC-5細(xì)胞形態(tài)變化不大，僅見少量細(xì)胞皺縮（見圖1B，圖1D～圖 1F）。

圖1 各組RGC-5細(xì)胞倒置熒光顯微鏡像。1A.正常對(duì)照組；1B.陰性對(duì)照組；1C.過氧化氫損傷組；1D.1 000 μg/ml干預(yù)組；1E.500 μg/ml干預(yù)組；1F.250 μg/ml干預(yù)組。正常生長(zhǎng)的RGC-5細(xì)胞呈扁平梭形，細(xì)胞透亮，邊緣清晰，有較短突起，隨著細(xì)胞生長(zhǎng)，突起相互連接。過氧化氫損傷組RGC-5細(xì)胞皺縮，細(xì)胞密度減低，軸突縮短。其他各組RGC-5細(xì)胞形態(tài)未見明顯改變（×200倍）RGC：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞

2.2 MTT檢測(cè)

陰性對(duì)照組、過氧化氫損傷組以及1 000 μg/ml、5 00 μg/ml、250 μg/ml的黃芪多糖干預(yù)組的細(xì)胞活性分別為（98.17±1.06）%、（64.22±2.10）%、（88.14±2.62）%、（81.51±1.48）%、（78.37±1.64）%。 與正常對(duì)照組相比，過氧化氫損傷組RGC-5細(xì)胞的活性明顯降低（P＜0.01）。 與過氧化氫損傷組相比，1 000 μg/ml、500 μg/ml、250 μg/ml濃度的黃芪多糖干預(yù)組的細(xì)胞活性明顯升高（P＜0.01）（圖 2）。

圖2 各組RGC-5細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果。A.正常對(duì)照組；B.陰性對(duì)照組；C.過氧化氫損傷組；D.1 000 μg/ml干預(yù)組；E.500 μg/ml干預(yù)組；F.250 μg/ml干預(yù)組 RGC：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞

2.3 DAPI染色

正常對(duì)照組（圖 3A）和陰性對(duì)照組（圖 3B）RGC-5細(xì)胞核核型完整，細(xì)胞核淡染，染色質(zhì)均勻，未見明顯凋亡表現(xiàn)；過氧化氫損傷組（圖3C）RGC-5細(xì)胞核發(fā)生形變，可見染色質(zhì)凝聚，邊緣化；各個(gè)濃度干預(yù)組（圖3D～圖 3F）的RGC-5細(xì)胞核基本完整，少量細(xì)胞可見染色質(zhì)濃縮現(xiàn)象。

2.4 實(shí)時(shí)細(xì)胞電子分析（RT-CES）

圖4反映了不同分組細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)。從圖中可以看出，與正常對(duì)照組（曲線a）和陰性對(duì)照組（曲線b）相比，過氧化氫損傷組（曲線f）RGC-5細(xì)胞的生長(zhǎng)明顯受到抑制。與過氧化氫組相比，不同濃度黃芪多糖干預(yù)組（曲線c、d、e）RGC-5細(xì)胞的細(xì)胞指數(shù)有所上升。

3 討論

近年來，視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞凋亡與氧化應(yīng)激機(jī)制的研究越來越多。氧化應(yīng)激機(jī)制認(rèn)為，細(xì)胞內(nèi)氧化代謝產(chǎn)物積累導(dǎo)致細(xì)胞毒性損傷，從而造成細(xì)胞凋亡〔7-8〕。應(yīng)用過氧化氫損傷模擬體內(nèi)環(huán)境中細(xì)胞的氧化應(yīng)激狀態(tài)，已經(jīng)為眾多的實(shí)驗(yàn)所證實(shí)〔9-14〕。本實(shí)驗(yàn)在過氧化氫誘導(dǎo)RGC-5細(xì)胞氧化損傷的基礎(chǔ)上觀察黃芪多糖對(duì)RGC-5細(xì)胞的保護(hù)作用，從而探討黃芪多糖保護(hù)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的作用機(jī)制，并為黃芪多糖的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖3 各組RGC-5細(xì)胞DAPI染色圖像。3A.正常對(duì)照組；3B.陰性對(duì)照組；3C.過氧化氫損傷組；3D.1 000 μg/ml干預(yù)組；3E.500 μg/ml干預(yù)組；3F.250 μg/ml干預(yù)組。正常對(duì)照組和陰性對(duì)照組RGC-5細(xì)胞核核型完整，細(xì)胞核淡染，染色質(zhì)均勻，未見明顯凋亡表現(xiàn)；過氧化氫損傷組RGC-5細(xì)胞核發(fā)生形變，可見染色質(zhì)凝聚，邊緣化；各個(gè)濃度干預(yù)組的RGC-5細(xì)胞核基本完整，少量細(xì)胞可見染色質(zhì)濃縮現(xiàn)象（×200倍）RGC：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞

圖4 實(shí)時(shí)細(xì)胞電子分析。a.正常對(duì)照組；b.陰性對(duì)照組；c.1000μg/ml干預(yù)組；d.500 μg/ml干預(yù)組；e.250 μg/ml干預(yù)組；f.過氧化氫損傷組。與正常對(duì)照組相比，陰性對(duì)照組和各個(gè)濃度黃芪多糖干預(yù)組呈現(xiàn)正常的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線，過氧化氫損傷組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制

黃芪是臨床上常用的補(bǔ)氣類藥物，在糖尿病及糖尿病視網(wǎng)膜病變和糖尿病腎病中應(yīng)用較多。循證醫(yī)學(xué)證據(jù)也證實(shí)了黃芪類藥物對(duì)于糖尿病治療的有效性〔15〕。黃芪多糖是黃芪中提取的有效成分，具有增強(qiáng)心肌收縮力、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、保護(hù)心肌細(xì)胞、改善心肌功能的作用，此外還有清除自由基、改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫等多種有益的生物學(xué)效應(yīng)〔16-19〕。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，黃芪多糖對(duì)于周圍神經(jīng)損傷的功能恢復(fù)具有促進(jìn)作用，而且在損傷早期即可發(fā)揮作用〔20〕。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們用過氧化氫誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的RGC-5細(xì)胞氧化損傷，應(yīng)用不同濃度的黃芪多糖干預(yù)保護(hù)，發(fā)現(xiàn)黃芪多糖干預(yù)組的細(xì)胞活性及細(xì)胞凋亡的數(shù)量較單純過氧化氫損傷組有明顯的逆轉(zhuǎn)，證實(shí)了黃芪多糖對(duì)過氧化氫誘導(dǎo)的RGC-5細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，提示黃芪多糖對(duì)于糖尿病視網(wǎng)膜病變等疾病中視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞的損傷可能有一定的保護(hù)作用，黃芪多糖可能是黃芪類藥物治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的有效成分之一。鑒于體外培養(yǎng)的RGC-5細(xì)胞與活體內(nèi)的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有一定差別，對(duì)各種損傷的反應(yīng)也可能會(huì)有所不同，所以黃芪多糖對(duì)于糖尿病視網(wǎng)膜病變RGC的保護(hù)作用及其在臨床上的治療效果和具體應(yīng)用還有待進(jìn)一步研究。

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