熊海軍，張興坦，吳向偉，謝小東，聶夢云，王根洪，夏慶友

家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室，西南大學(xué)，重慶市北碚區(qū)天生路2號 400715

栽培煙草抗逆相關(guān)WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達特征分析

熊海軍，張興坦，吳向偉，謝小東，聶夢云，王根洪，夏慶友

家蠶基因組生物學(xué)國家重點實驗室，西南大學(xué)，重慶市北碚區(qū)天生路2號 400715

采用RT-PCR反應(yīng)從栽培煙草中克隆獲得三條全長WRKY家族保守序列，長度分別為677bp、672bp、629bp,定名為NtWRKY10、NtWRKY11、NtWRKY12。生物信息分析表明三個基因與已經(jīng)報道的擬南芥WRKY家族基因具有較高同源性，保守結(jié)構(gòu)域?qū)儆诘诙怶RKY轉(zhuǎn)錄因子。RT-PCR分析表明，SA、ABA、MeJA 等信號分子均能誘導(dǎo)這三個基因的上調(diào)或下調(diào)表達，表明這三個基因可能在栽培煙草抗逆反應(yīng)中起作用。

煙草；WRKY轉(zhuǎn)錄因子；克隆；信號分子

轉(zhuǎn)錄因子是能夠結(jié)合在基因上游特異核苷酸序列上的蛋白質(zhì)，表現(xiàn)出激活或抑制靶基因轉(zhuǎn)錄的功能。其中WRKY轉(zhuǎn)錄因子是一類植物中所特有的轉(zhuǎn)錄因子。這類轉(zhuǎn)錄因子最先由Ishiguro等從甘薯中分離[1]。目前在至少20多種植物中發(fā)現(xiàn)了WRKY轉(zhuǎn)錄因子，并闡明了相應(yīng)的生物學(xué)功能[2]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子至少含有一個高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域由大約60個氨基酸殘基組成的。在N末端有7個絕對保守的氨基酸殘基WRKYGQK，是WRKY結(jié)構(gòu)域的核心序列[3]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子被分為三類[4]，第一類含有兩個典型WRKY結(jié)構(gòu)和Cys2.His2鋅指結(jié)構(gòu)；第二類含有一個典型WRKY結(jié)構(gòu)域和Cys2.His2鋅指結(jié)構(gòu)；第三類含有一個WRKY結(jié)構(gòu)域和Cys2.His／Cys的鋅指結(jié)構(gòu)。WRKY結(jié)構(gòu)域具有DNA結(jié)合能力，是WRKY蛋白生物學(xué)活性必需的，若WRKY結(jié)構(gòu)域中的氨基酸發(fā)生了變異，往往會導(dǎo)致其失去或減弱DNA結(jié)合活性[5]。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子與生物或非生物脅迫應(yīng)答、植物生長發(fā)育以及衰老有著密切的關(guān)系。大量研究工作證實大多數(shù)WRKY蛋白主要參與了植物從基礎(chǔ)免疫到獲得性抗性的多種抗病反應(yīng)之中，通過調(diào)控多通路多層次的抗病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響植物對病原物的生理反應(yīng)，在植物與病毒、細菌、真菌、線蟲以及昆蟲的相互作用過程中發(fā)揮重要作用[6-7]。植物在干旱、高溫、低溫和損傷等非生物脅迫應(yīng)激下會誘導(dǎo)WRKY基因快速表達[7]。例如擬南芥中的AtWRKY25、AtWRKY28、AtWRKY40和AtWRKY70同時受到高鹽、高溫、滲透脅迫的誘導(dǎo)[8]。其次，WRKY轉(zhuǎn)錄因子還參與植物的生長發(fā)育與新陳代謝。野燕麥中發(fā)現(xiàn)兩個WRKY蛋白ABF1和ABF2可以結(jié)合淀粉酶基因α-Amyl基因啟動子區(qū)的W盒上進而調(diào)控a-Amyl基因的表達[9]。另一方面，利用WRKY轉(zhuǎn)錄因子提高植物抗逆性的研究已取得了一定進展，如超表達AtWRKY33提高了擬南芥對灰霉病和黑斑病兩種真菌性病害以及鹽脅迫的抵抗能力[10-11]；OsWRKYl3的超表達增強了水稻對紋枯病和稻瘟病的抗性[12]；VvWRKYl在煙草中的表達增強了植株對腐霉病、霜霉病和白粉病三種真菌性病害的抗性[13]。綜上所述，WRKY轉(zhuǎn)錄因子對植物有著非常重要的作用。

煙草作為一種茄科植物，既是一種重要的模式植物，也具有重要的經(jīng)濟價值。在煙葉生產(chǎn)中經(jīng)常受到高鹽、低溫、病原菌的影響，其遺傳改良越來越受到重視。本實驗以煙草為材料，利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得了WRKY10、WRKY11、WRKY12基因，并探究其與其他物種WRKY蛋白的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系以及在SA、ABA、JA三種脅迫條件下的表達情況。為進一步研究WRKY轉(zhuǎn)錄因子基因功能，進而通過分子育種獲得高抗逆材料奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.2.1 供試植物材料

將紅花大金元煙草種子播種于MS固體培養(yǎng)基上，培養(yǎng)條件為光照16h，28℃，黑暗8h，25℃。待幼苗長至5-6真葉期，洗去培養(yǎng)基，并將幼苗浸在滅菌水中培養(yǎng)1周，使其適應(yīng)環(huán)境。再用各種激素（激素處理分別為：ABA 200μM，SA 2mM，MeJA 100μM）處理幼苗，在0h，1h，2h，5h，10h，24h時間點取樣，每個時間點取樣至少三株。

1.2.2 試劑

Roche公 司 Tripure Isolation Reagent；Promega公司反轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，RNase-Free DNase和Go Taq Green DNA聚合酶；Biowest公司瓊脂糖； Transgen公司pEASY-T1克隆載體和TransT1大腸桿菌感受態(tài)；百泰克公司DNA回收試劑盒。

1.2 RNA的提取和cDNA的合成

將1 ml Trizol加入EP管（樣品大于10%Trizol體積量），加入冰凍樣品勻漿，4℃12000rpm高速離心10 min，取上清靜置5 min，使核苷酸鏈打開，加入200 μL（1 mL體系）氯仿，劇烈搖晃15 s，20℃靜止10 min，然后4℃ 12000 rpm高速離心15 min，取上清加入500 μL（1 mL體系）異丙醇翻轉(zhuǎn)搖晃幾次，20℃靜止5 min使RNA形成，4℃ 12000 rpm高速離心10 min去除上清液，加入75%己醇漩渦清洗RNA，4℃ 7500 rpm離心5 min,去上清風(fēng)干5 min,加入無RNase水50 ml吹打幾次，55℃孵育15 min,最后將產(chǎn)物用RNase-Free DNase消化（具體步驟按產(chǎn)品說明書流程操作）。

在上述10 μL的體系RNA中加入Oligo（dT）1.5 μL，DEPC 水上調(diào)體系至 15 μL，混勻后 70℃反應(yīng) 10 min，冰浴 2 min；再加上 5×buffer 5.0 μL，dNTP（2.5mmol/L）4.0 μL，PNase inhibitor 1.0 μL，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶 1.0 μL，42℃溫浴65 min，70℃保溫5 min，即得cDNA。

1.3 PCR擴增和基因的克隆

以cDNA為模板，采用15 μL體系進行擴增：cDNA 1 μL,ddH2O 4.5 μL,sense primer 1 μL，Anti-Sense prime 1 μL，Taq聚合酶7.5μL。擴增程序為：94℃預(yù)熱3min，按94℃變性30s。1%的瓊脂糖電泳分離PCR產(chǎn)物中的目的條帶。片段回收按照百泰克DNA回收盒進行，PCR產(chǎn)物載體連接按照Transgen公司的說明書進行，PCR產(chǎn)物5 μL，pEASY-T1載體1 μL，37℃連接15 min，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌TransT1進行藍白斑篩選。使用Primer Premier 5分別設(shè)計全長引物和檢測引物。

1.4 多序列比對與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

從NCBI中下載相關(guān)WRKY序列，使用Multalin在線軟件對推測的氨基酸序列進行比對。利用Mega5.0軟件通過氨基酸序列比對將其他物種WRKY家族成員與目的序列構(gòu)建了N-J（Neighbor-Joining）系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 NtWRKY10，NtWRKY11和NtWRKY12三個基因的半定量分析

根據(jù)目的基因序列設(shè)計半定量引物（表1）擴增目的基因。經(jīng)克隆測序驗證其特異性后，依次采用各種激素處理的cDNA模板分析該基因表達差異。同時根據(jù)GenBank中EF-1a基因保守序列設(shè)計引物EF-1aF和EF-1aR（表1）作為內(nèi)參基因以確定PCR的模板量。為了證實外源信號處理實驗的有效性和準(zhǔn)確性，我們采用NtPR1a，NtSAM1和NtODC基因分別作為ABA，SA和MeJA誘導(dǎo)表達的marker基因[14-16](表1）。PCR產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進行分析。

表1 本研究中設(shè)計的引物及其序列Tab.1 Primers involved in this article

2 結(jié)果與分析

2.1 NtWRKY10-12三個基因全長ORF的克隆

以煙草各種激素處理的混合cDNA為模板，基于經(jīng)生物信息分析獲得的基因序列，設(shè)計煙草WRKY兩端特異性引物進行PCR擴增，得到約600bp的特異條帶（圖1），經(jīng)回收連接到pEASY-T1載體挑取陽性克隆后送于華大基因測序，得到NtWRKY10、NtWRKY11、NtWRKY12三個基因全長ORF分別為677 bp，672 bp，620bp。經(jīng)過NCBI的ORF-finder翻譯，發(fā)現(xiàn)三個基因全長ORF分別編碼178、175、208個預(yù)測氨基酸的蛋白質(zhì)。

2.2 NtWRKY10-12氨基酸多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

為進一步明確NtWRKY10-12三個基因預(yù)測蛋白質(zhì)序列的特征，從NCBI下載相關(guān)WRKY蛋白序列，使用Multalin在線軟件對其推測的氨基酸序列進行同源性比對（圖2）。

圖1 煙草NtWRKY10-12三個基因的PCR分析Fig.1 Electrophoresis analysis of WRKY10 WRKY11 WRKY12 PCR product

圖2 煙草NtWRKY10-12三個基因預(yù)測蛋白質(zhì)序列與其它WRKY轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列比較Fig.2 Multi-alignment of NtWRKY10-12 and other WRKY proteins

氨基酸序列比較得出：N末端含有WRKY蛋白的標(biāo)志片段WRKYGKK，以及C末端為鋅指結(jié)構(gòu)CX4CX23HXH。WRKY分為三類，其中第二類含有一個WRKY保守域和結(jié)構(gòu)為CX4-5CX22-23HXH的鋅指結(jié)構(gòu)[14-15]。比較發(fā)現(xiàn)NtWRKY10-12與第二類WRKY轉(zhuǎn)錄因子相符，可以認為這三個基因應(yīng)屬第二類轉(zhuǎn)錄因子。另外，WRKY轉(zhuǎn)錄因子除含有高度保守的結(jié)構(gòu)域外，其他位置片段可變度較高，故而其功能也應(yīng)具多樣性。

為了解 NtWRKY10、NtWRKY11 、NtWRKY12與其他WRKY家族成員的關(guān)系，利用Mega5.0軟件將上述三個轉(zhuǎn)錄因子與其他物種WRKY家族成員的氨基酸序列構(gòu)建了N-J（Neighbor-Joining）系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。

圖3 NtWRKY10-12三個基因編碼的蛋白與其他WRKY家族成員構(gòu)建的N-J系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of NtWRKY10-12 and other plant WRKY protein

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示NtWRKY10和NtWRKY11氨基酸序列與AtWRKY50具有較高的同源性，這暗示著它們可能具有相似的功能。NtWRKY12與AtWRKY51同源性較高，暗示他們可能是直系同源基因，并且行使相似的功能。

2.3 不同脅迫條件下栽培煙草紅花大金元NtWRKY10、NtWRKY11、NtWRKY12三個基因的表達分析

為了探索三個WRKY基因在不同脅迫下的表達情況，我們采用脫落酸(abscisic acid，ABA)、水楊酸（salicylic acid，SA）、茉莉酸甲酯（jasmonic acid，MeJA）三種外源信號分子進行誘導(dǎo)表達實驗分析 (圖4)。

結(jié)果顯示，NtWRKY10和NtWRKY11在ABA處理1 h和2h時表達量上升，而NtWRKY12受ABA誘導(dǎo)的結(jié)果卻不明顯（圖 4A）。

SA對三個基因的誘導(dǎo)表達情況都較為明顯（圖4B），NtWRKY10和NtWRKY11在經(jīng)過SA處理2 h和24 h時，表達水平明顯上調(diào)。NtWRKY12則在SA處理10 h時表達量最高。SA是植物抗病反應(yīng)重要的信號分子，三個WRKY基因受SA誘導(dǎo)上調(diào)表達的事實暗示著它們在參與植物的病原誘導(dǎo)的防御反應(yīng)中扮演著重要的角色。

煙草三個WRKY基因受茉莉酸甲酯(MeJA)的抑制表達，處理2小時后表達水平明顯下調(diào)。處理24小時后抑制效果逐漸消除（圖 4C）。

圖4 NtWRKY10-12在ABA（圖 4A）、SA（圖 4B）、MeJA（圖 4C）三種外源信號分子誘導(dǎo)表達情況Fig.4 NtWRKY10-12 gene expression effect by ABA (Fig 4A),SA (Fig 4B),MeJA (Fig 4C)

3 結(jié)論與討論

WRKY轉(zhuǎn)錄因子作為一種重要的誘導(dǎo)型調(diào)節(jié)因子，參與植物的多種反應(yīng)、生長發(fā)育調(diào)節(jié)及物質(zhì)代謝調(diào)節(jié)等多種重要生理活動。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)三個WRKY轉(zhuǎn)錄因子均只含有一個高度保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，屬于WRKY超家族中的第二亞族。根據(jù)系統(tǒng)進化樹分析比較，這三個基因與大豆GmWRKY6、GmWRKY21以及擬南芥AtWRKY51的同源性較高，其中GmWRKY21被報道直接參與低溫脅迫反應(yīng)[16]，故而與其同源性較高的NtWRKY12也可能執(zhí)行類似的功能，然而AtWRKY51和GmWRKY6的功能未見詳細的報道。由于WRKY超級基因家族中除WRKY保守域高度保守，其余區(qū)段可變性很高，表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子功能位點在保守區(qū)域。根據(jù)文獻報道，SA、MeJA 等外源誘導(dǎo)物能被植物細胞膜的某些受體特異識別并結(jié)合，繼而激活促分裂原激活蛋白激酶信號網(wǎng)絡(luò)通路，促分裂原激活蛋白激酶可以通過磷酸化或者去磷酸化將細胞外的信號放大并傳導(dǎo)進入細胞核內(nèi)，從而激活或抑制WRKY 類轉(zhuǎn)錄因子的活性[17]。從實驗結(jié)果來看，NtWRKY10等三個基因表達水平隨著誘導(dǎo)物處理時間變化而變化，在信號分子誘導(dǎo)下其表達特征不盡相同。

本研究證實ABA、SA和MeJA可誘導(dǎo)三個轉(zhuǎn)錄因子的上調(diào)或下調(diào)表達，表明它們可能在植物參與生長、發(fā)育以及抗逆過程中能實現(xiàn)功能互補與協(xié)調(diào)，因此可將這個性質(zhì)加以利用，以提高植物對非生物脅迫的適應(yīng)性。

本研究將在后續(xù)工作中，構(gòu)建重組表達干擾載體并將目標(biāo)基因轉(zhuǎn)入煙草，篩選煙草重組植株，進行表型分析，進一步研究相關(guān)基因的功能。

[1] Ishiguro S,Nakamura K.Characterization of a cDNA encoding a novel DNA.binding protein,SPF1,that recognizes SP8 sequences in the 5’ upstream regions of genes coding for sporamin and p.amylase from sweet potato[J].Mol Gen Genet,1994.

[2] Wu,K L,Guo Z J,Wang H H,et al.The WRKY family of transcription factors in rice and Arabidopsis and their origins[J].DNA Research,2005,12(1): 9-26.

[3] Eulgem T,P.J.R.,Robatzek s,Imre E.Somssich.The WRKY superfamily of plant transcription factors[J].trends in plant science.

[4] Dong Jixin ,Chen Chunhong,andChen Z.Expression profiles of the ArabidopsisWRKY gene superfamily during plant defense response[J].Plant Molecular Biology,2003(51): 21-37.

[5] Christian A.Ross,Liu Yue,and Shen Q J.The WRKY Gene Family in Rice (Oryza sativa)[J].Journal of Integrative Plant Biology,2007,49(6):827-842.

[6] Eulgem and Thomas.Regulation of the Arabidopsis defense transcriptome[J].trends in plant science,2005,10(2):71-78.

[7]ülker,et al.WRKY transcription factors: from DNA binding towards biological function[J].Current Opinion in Plant Biology,2004,7(5):491-498.

[8] Seki M,et al.Functional annotation of a full-length Arabidopsis cDNA collection[J].Science,2002,296(5565):141-5.

[9] Rushton P J,H Macdonald,et al.Members of a new family of DNA-binding proteins bind to a conservedcis-element in the promoters of a-Amy2 genes[J].Plant Molecular Biology,1995(29):691-702.

[10]Zheng Z,Qamar S A,Chen Z,et al.Arabidopsis WRKY33 transcription factor is required for resistance to necrotrophic fungal pathogens[J].Plant J,2006.

[11]Jiang Y,Deyholos M K.Functional characterization of Arabidopsis NaCl.inducible,WRKY25 and WRKY33 transcription factors in a biotic stresses[J].Plant Molecular Biology,2009.

[12]Wu Xiaolan,Shiroto Y,Kishitani S,et al.Enhanced heat and drought tolerance in transgenic rice seedlings overexpressing OsWRKY n under the control of HSPIOI promoter[J].Plant Cell Rep,2009(280):21-30.

[13]Marchive C,Mzid R,Deluc L,et al.Isolation and characterization of a Vitis vinifera transcription factor,VvWRKY1,and its effect on responses to fungal pathogens in transgenic tobacco plants[J].J Exp Bot,2007(58):8.

[14]T，,E,et al.The WRKY superfamily of plant transcriptional factors[J].Trends Plant Sci,2000,5(5):199-206.

[15]D，,Y.,C.C，,and C.Z.Evidence for an important role of WRKY DNA binding protein in the regulation of NPR1 gene expression[J].The Plant Cell,2001(13):1527-1539.

[16]Zhou Q Y，Tian A G，Zou H F，et al. Soybean WRKY-type transcription factor genes， GmWRKY13，GmWRKY21， and GmWRKY54， confer differential tolerance to abiotic stresses in transgenic Arabidopsis plants[J］. Plant Biotechnology Journal，2008，6(5) :486-503.

[17]Kim C Y,Zhang S.Activation of a mitogen-activated protein kinase cascade induces WRKY family of transcription factors and defense genes in tobacco[J].Plant J,2004,38(1): 142-151.

Expression analysis of WRKY transcription factors related to stress response in cultivated tobacco

XIONG Haijun,ZHANG Xingtan,WU Xiangwei,XIE Xiaodong,NIE Mengyun,WANG Genhong,XIA Qingyou
State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology,College of Biotechnology,Southwest University,Chongqing 400715,China

Three full-length WRKY-domain cDNA sequence of 677bp,672bp and 629bp,named NtWRKY10,NtWRKY11 and NtWRKY12 were cloned by RT-PCR from cultivated tobacco induced by SA,ABA and ET.Bioinformatics analysis showed that the three genes were highly similar with the reported WRKY family genes in Arabidopsis thaliana,which belonged to the second WRKY transcription.Results showed that molecules signals such as ABA,SA,MeJA could induce up-regulated expression or dowm-regulated expression,which indicated that the three genes play a role in stress response in cultivated tobacco.

tobacco; WRKY transcription factors; cloning; signal molecules

10.3969/j.issn.1004-5708.2014.06.023

S572.01; Q 7 文獻標(biāo)志碼：A 文章編號：1004-5708（2014）06-0144-06

中國煙草總公司煙草基因組計劃重大專項（110201301011A（JY-11A））；中央高校基本科研業(yè)務(wù)費專項資金(XDJK2013C043)；西南大學(xué)博士基金(SWU112061)；云南省煙草公司科技計劃項目(2013YN08)

熊海軍（1990—），碩士，研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué)，Email:songxiaoming@ swu.edu.cn

王根洪（1980—），博士，副研究員，Email: wanggh168@swu.edu.cn

2014-04-21