潘忠超，石和榮，楊慧榮，王樹啟，趙會(huì)宏

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院水產(chǎn)系，廣東廣州 510642;2.廣東海大畜牧獸醫(yī)研究院有限公司，廣東廣州 510630;3.汕頭大學(xué)廣東省海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東汕頭 515063）

斜帶石斑魚 (Epinephelus coioides)屬鱸形目(perciformes)，鮨科 (Serranidae)，石斑魚亞科(Epinephelinae)，石斑魚屬，是我國華南沿海及東南亞地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖魚類。由于其味道鮮美，營養(yǎng)豐富，受到廣大消費(fèi)者的青睞，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

魚類生長激素 (GH)是垂體細(xì)胞分泌的一種多功能的激素，由173～188個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為20000～22000。研究表明GH參與眾多的生理調(diào)控過程，包括代謝、生長、發(fā)育、繁殖和滲透壓調(diào)節(jié)等，而且可以增加魚食欲，提高飼料轉(zhuǎn)化率［1］。目前，超過40多種魚類的GH基因已經(jīng)克隆得到［2］。從得到的氨基酸組成分析，同一目的魚類GH同源性比較高，其氨基酸組成大約有80%是相同的［3］。但是不同目的魚類GH差異較大，同源性大約只有37% ～58%，表現(xiàn)出明顯的種屬特異性［4］。將基因重組生長激素通過注射［5－7］、埋植［6－8］、浸泡［6－9］、食道插管或投喂等給藥途徑［6－9］，都可以促進(jìn)魚類的生長。因此，在魚類養(yǎng)殖業(yè)中采用GH來促進(jìn)魚類生長是可行的。但是，這些給藥方法都需要消耗大量的人力、物力，還易引起魚的應(yīng)激反應(yīng)或造成魚體損傷，是推廣應(yīng)用GH的主要障礙。研究證實(shí)，魚類消化系統(tǒng)具有完整吸收蛋白多肽的能力［10］，GH通過投喂的方式處理魚類，能有效促進(jìn)魚體的生長。目前已在金魚 (Carassius auratus)［11－15］、虹鱒 (Oncorhynchus mykiss)［11－15］、 黑 鱸 (Micropterus salmoides)［11－15］、牙 鲆 (Paralichthys olivaceus)［11－15］、斑 馬 魚 (Daniorerio)［11－15］、 鯉 魚 (Cyprinus carpio)［11－15］和尼羅羅非魚 (Tilapia nilotica)［11－15］等魚類中證明了生長激素具有促進(jìn)攝食和生長的作用。

本試驗(yàn)研究在飼料中添加重組生長激素的酵母上清液 (其中重組生長激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2，4，8 mg/kg)，并與空白對(duì)照進(jìn)行對(duì)比，通過現(xiàn)場(chǎng)噴涂飼料，養(yǎng)殖試驗(yàn)并測(cè)定相關(guān)生長指標(biāo)、血脂、消化酶、抗氧化指標(biāo)以及組織磷酸酶的活性，探討重組生長激素對(duì)斜帶石斑魚生長的影響，為斜帶石斑魚養(yǎng)殖生產(chǎn)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)時(shí)間:2012年7－10月。

試驗(yàn)動(dòng)物及管理:斜帶石斑魚幼魚購自廣東省大亞灣水產(chǎn)試驗(yàn)中心。養(yǎng)殖試驗(yàn)在該中心進(jìn)行。試驗(yàn)魚暫養(yǎng)于500 L玻璃纖維缸中，用對(duì)照組飼料投喂2周，使其逐步適應(yīng)養(yǎng)殖環(huán)境和膨化飼料。試驗(yàn)前挑選出體格健康、規(guī)格相近的試驗(yàn)魚，平均體質(zhì)量為 (15.15±0.51)g，平均體長 (8.33±0.21)cm進(jìn)行隨機(jī)分組，設(shè)對(duì)照組G0，3個(gè)處理組G1、G2、G3，每組3個(gè)重復(fù)，每缸40尾。

試驗(yàn)在室內(nèi)流水系統(tǒng)進(jìn)行，水流速度為3.2 L/min，海水鹽度27.45‰～31.26‰。試驗(yàn)期間，氣溫為 (30.38±1.22)℃，水溫為 (29.39±1.49)℃，溶解氧為 (5.96±1.38)mg/L，pH為7.43±0.22，氨氮為 (0.01±0.01)mg/L，亞硝態(tài)氮為 (0.02±0.01)mg/L，每天投喂3次，日投喂量為試驗(yàn)魚體質(zhì)量的2% ～3%，并根據(jù)天氣和攝食情況靈活調(diào)整。攝食1 h后清理糞便及殘餌，自然光照，24 h流動(dòng)海水并充氣，試驗(yàn)養(yǎng)殖周期為10周。

1.2 飼料制備

基礎(chǔ)飼料配方和營養(yǎng)成分組成見表1。試驗(yàn)飼料由中山統(tǒng)一飼料有限公司制備。畢赤酵母工程菌由中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院水生經(jīng)濟(jì)動(dòng)物研究所提供，生長激素重組蛋白在廣州大學(xué)微生物試驗(yàn)室發(fā)酵獲得，采用噴涂技術(shù)將發(fā)酵所得上清混入飼料中。

表1 飼料基礎(chǔ)配方及營養(yǎng)組成Table 1 The basical diet and nutrition composition

1.3 試驗(yàn)器材及試劑

剪刀，鑷子，解剖刀，注射器，紗布，試驗(yàn)盤，凱氏定氮儀 (Tecato，1030型自動(dòng)分析儀)，索氏抽提系統(tǒng) (Tecato，Soxtec system HT6)，烘箱(MBE，GZC－9246)，天平 (JA1003N)，水浴鍋(上海一恒，DK.8D)，酶標(biāo)儀 (Thermo，MULTISKAN MK3)，分光光度計(jì) (MC，UV759S)等。

1.4 樣品處理

養(yǎng)殖試驗(yàn)結(jié)束后，將試驗(yàn)魚饑餓24 h。稱取每缸魚的總質(zhì)量并統(tǒng)計(jì)數(shù)量。每缸隨機(jī)選取10尾魚，取5尾魚作全魚體成分分析，剩余5尾魚用于生化分析采樣。首先采血，將血液低溫離心 (4℃，3000 r/min，15min)分離血清，低溫保存(－40℃)備用。肝臟、肌肉、腸道等組織，稱量后加入9倍的生理鹽水，研磨均勻，將研磨液低溫離心 (4℃，3000 r/min，15 min)，取其上清液低溫保存 (－80℃)備用。記錄每尾魚體質(zhì)量、體長以及解剖后的內(nèi)臟、肝臟、肌肉和腸系膜脂肪的質(zhì)量，并收集肌肉以測(cè)定其粗蛋白和粗脂肪。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

1.5.1 生長指標(biāo)的測(cè)定 記錄各組魚的采食量，分別在試驗(yàn)開始和結(jié)束時(shí)獲取魚體質(zhì)量、肌肉、肝胰臟和腸系膜脂肪質(zhì)量數(shù)據(jù)。

初均質(zhì)量 (W0)、末均質(zhì)量 (Wt)、均攝食量(g)、增質(zhì)量率 (WGR)、體長增長率 (LGR)、特定生長率 (SGR)、飼料系數(shù) (FC)、成活率(%)、肥滿度 (CF)、臟體比 (%)、肝體比(%)和脂體比 (%)的計(jì)算公式如下:

初均質(zhì)量 (W0)=初總質(zhì)量/魚尾數(shù);末均質(zhì)量 (Wt)=末總質(zhì)量/魚尾數(shù);

均攝食量 (g)=攝食總量/魚尾數(shù);肥滿度(CF)=體質(zhì)量 (g)/體長 (cm)3;

臟體比=內(nèi)臟的質(zhì)量/魚的體質(zhì)量;肝體比=肝的質(zhì)量/魚的體質(zhì)量;

脂體比=腸系膜脂肪質(zhì)量/魚的體質(zhì)量;

其中 Lt、Wt、Nt和 L0、W0、N0分別為試驗(yàn)結(jié)束時(shí)和放養(yǎng)魚時(shí)的平均體長、平均體質(zhì)量、數(shù)量;G為攝餌的總量;T為試驗(yàn)總天數(shù)。

1.5.2 樣品分析 飼料、全魚和肌肉的粗蛋白測(cè)定采用凱氏微量定氮法 (GB6432－86);粗脂肪采用索氏抽提法測(cè)定 (GB/T5009.6－2003);粗灰分采用燒灼法 (GB6438－86);水分的測(cè)定采用105℃恒溫烘干失重法 (GB6435－86);血脂含量采用高效液相法檢測(cè)。

采用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白含量，淀粉酶(AMS)、脂肪酶 (LPS)、胰蛋白酶、超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶 (CAT)、總抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛 (MDA)、堿性磷酸酶 (AKP)和酸性磷酸酶 (ACP)的測(cè)定方法均由南京建成生物工程研究所的測(cè)試盒提供。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)用Excel電子表格記錄，用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(means±SE)的形式表示，采用單因素方差分析，顯著水平為p＜0.05。當(dāng)差異顯著時(shí)采用Duncan's多重比較分析組間的差異顯著程度。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 基因重組生長激素對(duì)斜帶石斑魚生長性能的影響

飼養(yǎng)試驗(yàn)結(jié)束后，斜帶石斑魚的各項(xiàng)生長性能指標(biāo)見表2。由表2可知，試驗(yàn)組斜帶石斑魚的末均質(zhì)量、增質(zhì)量率、攝食量、體長增長率以及特定生長率均高于對(duì)照組，其中G2組斜帶石斑魚末均質(zhì)量最高，達(dá)到57.23 g，高出對(duì)照組9.97%(p＜0.05)，增質(zhì)量率達(dá)到293.16%，高出對(duì)照組23.75%(p＜0.05);G2組斜帶石斑魚的攝食量最多，且高于其它試驗(yàn)組，高出對(duì)照組9.99%(p＜0.05);體長增長率趨勢(shì)與攝食量一致，G2組最高，顯著高于對(duì)照組 (p＜0.05);G2組的特定生長率最高，但4組之間無顯著差異;飼料系數(shù)方面，3個(gè)試驗(yàn)組較對(duì)照組均低，G2組最低，但4組之間無顯著差異。

表2 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚生長、攝食、飼料系數(shù)和成活率的影響1)Table 2 Effects of r-gGH on the growth，feeding，feeding rate and survival rate of Epinephelus coioides

2.2 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚形態(tài)學(xué)和體成分的影響

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，斜帶石斑魚的形態(tài)學(xué)指標(biāo)和魚體成分分析，見表3和表4。形態(tài)學(xué)方面，飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚的形態(tài)學(xué)指標(biāo)均沒有顯著影響 (p＞0.05);G3組斜帶石斑魚肥滿度較對(duì)照組高出4.7%;G1及G3組斜帶石斑魚臟體比與G0組比較均下降;試驗(yàn)組斜帶石斑魚脂體比與對(duì)照組相比有一定程度的下降，其中G1組最低，比G0組下降17.24%。

魚體成分分析表明，G2組全魚粗蛋白含量最高，顯著高于G0組 (p＜0.05)。G2組魚體肌肉中粗脂肪的含量低于其它試驗(yàn)組，并且顯著低于G0組 (p＜0.05)。

表3 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚形態(tài)學(xué)指標(biāo)的影響Table 3 Effects of r-gGH on morphology of Epinephelus coioides

表4 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚體成分的影響1)Table 4 Effects of r-gGH on body composition of Epinephelus coioides

2.3 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚血脂的影響

如表5所示，G1、G2、G3組斜帶石斑魚的膽固醇 (CHOL)、低密度脂蛋白 (LDL)和甘油三酯 (TG)含量均低于對(duì)照組，且G1和G2組的低密度脂蛋白 (LDL)含量顯著低于G0組 (p＜0.05)，試驗(yàn)組魚的高密度脂蛋白含量均高于對(duì)照組，其中G2組最高，高出G0組80%。

表5 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚血脂的影響1)Table 5 Effects of r-gGH on blood fat of Epinephelus coioides

2.4 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚消化酶活性的影響

試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，取斜帶石斑魚的腸道檢測(cè)消化酶的活性，試驗(yàn)結(jié)果見表6。在斜帶石斑魚的腸道中3種消化酶均有表達(dá)，其中胰蛋白酶活性最高;試驗(yàn)組魚的淀粉酶活性均高于對(duì)照組，G2組最高，并且顯著高于G0組 (p＜0.05);試驗(yàn)組魚脂肪酶活性均顯著高于對(duì)照組 (p＜0.05)。

表6 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚消化酶活性的影響1)Table 6 Effects of r-gGH on digestive enzymes of Epinephelus coioides

2.5 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚體組織抗氧化指標(biāo)的影響

試驗(yàn)結(jié)束后，對(duì)肌肉進(jìn)行丙二醛 (MDA)含量測(cè)定，抗氧化指標(biāo)均用肝臟組織檢測(cè)。如表7所示，試驗(yàn)組斜帶石斑魚的MDA水平均低于對(duì)照組，并隨著濃度的增加而降低，G3組最低并且顯著低于G0組 (p＜0.05);過氧化氫酶 (CAT)活性與MDA的趨勢(shì)相反，試驗(yàn)組斜帶石斑魚的CAT活性均高于對(duì)照組，并隨著濃度的增加而升高，G3組最高且顯著高于G0組 (p＜0.05);試驗(yàn)組魚的總抗氧化能力高于對(duì)照組，G2組魚的的總抗氧化能力顯著高于G0組 (p＜0.05)，飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚的SOD活性影響不大。

表7 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚體組織抗氧化指標(biāo)的影響1)Table 7 Effects of r-gGH on antioxidant indexes of Epinephelus coioides tissue

2.6 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚組織磷酸酶活性的影響

試驗(yàn)結(jié)束后，檢測(cè)肝臟和血液的磷酸酶活性。如表8所示，G2組魚肝臟堿性磷酸酶 (AKP)和酸性磷酸酶 (ACP)的活性最高而且顯著高于對(duì)照組 (p＜0.05);血液中G2組魚的磷酸酶活性也是最高的，但各組之間無顯著性差異。

表8 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚組織磷酸酶活性的影響1)Table 8 Effects of r-gGH on phosphates activities of Epinephelus coioides tissue

3 討論

魚類重組GH的基本功能是促生長，研究報(bào)道較為全面。在轉(zhuǎn)基因魚類中研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)生長激素基因的銀大馬哈魚 (Oncorhynchus kisutch)生長速度顯著提高，其血漿中GH的水平明顯高于非轉(zhuǎn)基因魚［16］。然而，隨著生物安全性越來越被重視，對(duì)轉(zhuǎn)基因食品的質(zhì)疑聲也越來越多，其安全問題有待驗(yàn)證。研究表明［17］，外源生長激素的半衰期一般在6 h以內(nèi)，在12～24 h之后，基本檢測(cè)不到。美國食品和藥物管理局 (FDA)公布了30年來對(duì)牛生長激素的研究結(jié)果，從多方面證實(shí)了使用牛生長激素的安全性［18］。目前，北美和歐洲許多國家已批準(zhǔn)牛生長激素在乳牛養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用［19］。從理論上講，魚類生長激素是一種蛋白激素，對(duì)熱不穩(wěn)定，蒸煮時(shí)會(huì)分解為氨基酸而失去激素的生理功能活性，食用后對(duì)人畜無害。人的生長激素能促進(jìn)魚的生長，但對(duì)魚生長激素受體的結(jié)合活性要比魚類自身生長激素低150倍，而魚類生長激素對(duì)哺乳動(dòng)物的生長激素受體無任何結(jié)合活性［18－19］。因此，從不同的角度分析和實(shí)驗(yàn)證實(shí)，作為餌料添加劑的魚類生長激素是安全的。

3.1 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚生長性能的影響

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在飼料中添加4 mg/kg的重組生長激素蛋白能顯著提高斜帶石斑魚的生長性能。前人通過不同的方法證明重組GH能夠促進(jìn)魚類的生長，例如用重組GH通過腹腔注射，口服，浸泡等方式處理魚類，都能顯著提高魚類的生長速度［6－7，19］，與本試驗(yàn)研究結(jié)果相同。本研究以 4 mg/kg的劑量重組生長激素上清為餌料添加劑時(shí)，斜帶石斑魚的增質(zhì)量率與體長增長率與對(duì)照組相比較有顯著性差異。而較高 (8 mg/kg)或者較低質(zhì)量分?jǐn)?shù) (2 mg/kg)也能促進(jìn)魚類的生長，但不如4 mg/kg組明顯，這可能是因?yàn)橹亟MGH的質(zhì)量分?jǐn)?shù)太低，不足以引起魚類較大的生理反應(yīng)，太高可能引起GH下游相關(guān)因子的負(fù)反饋調(diào)節(jié)所致。現(xiàn)有的研究表明，魚類內(nèi)分泌調(diào)控GH—IGF-Ⅰ軸是魚類生長發(fā)育的重要調(diào)控軸，外源化學(xué)物質(zhì)可能直接作用于該軸，影響下游IGF-Ⅰ等因子的表達(dá)，從而影響魚類的生長發(fā)育［17］。

Acosta等［21］首先研究了重組 GH在金魚中的促攝食作用，向飽食的金魚腹腔注射重組GH(0.2 μg)2 h后食量顯著增加。同時(shí)向金魚腹腔注射重組GH及其受體拮抗物后發(fā)現(xiàn)重組GH的促攝食作用受到抑制。隨后Zhang等［22］的研究也表明重組GH具有促進(jìn)金魚攝食的作用。本試驗(yàn)結(jié)果也表明，重組GH對(duì)斜帶石斑魚的攝食量有提高作用，且以4 mg/kg效果最佳。

本試驗(yàn)表明，添加4 mg/kg重組斜帶石斑魚GH的飼料，斜帶石斑魚幼魚的餌料轉(zhuǎn)化效率有所提高，餌料系數(shù)從對(duì)照組的1.21降低到1.14。由此推斷，重組GH的促生長效應(yīng)一部分是通過提高餌料轉(zhuǎn)化效率來實(shí)現(xiàn)的。此結(jié)果在其它魚上也得到證實(shí)。Liu等［23］發(fā)現(xiàn)，用牙鲆GH的轉(zhuǎn)基因集胞藻(Synechocystis)投喂牙鲆，其生長速度顯著提高，且餌料系數(shù)從2.0降低到1.2;Liu等［23］的研究結(jié)果也表明，用牙鲆GH的轉(zhuǎn)基因小球藻投喂牙鲆，除了生長速度顯著提高外，其餌料轉(zhuǎn)化效率也從對(duì)照組的0.53升高到高劑量組的0.72。在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中，餌料系數(shù)的降低意味著養(yǎng)殖成本的降低，對(duì)養(yǎng)殖業(yè)會(huì)帶來較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，使養(yǎng)殖戶在市場(chǎng)中更有競(jìng)爭(zhēng)力。此外，餌料轉(zhuǎn)化效率的提高意味著合成代謝的增加和分解代謝的減少，對(duì)養(yǎng)殖環(huán)境的改善也有很大幫助，尤其是在高密度養(yǎng)殖環(huán)境下可以減少水產(chǎn)病害的發(fā)生。

3.2 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚形態(tài)學(xué)和體成分的影響

本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)飼料中添加生長激素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4 mg/kg時(shí)，全魚粗蛋白含量顯著提高，且肌肉脂肪含量顯著降低。此結(jié)果和Li等［24］的結(jié)果不盡相同。王常安等［25］發(fā)現(xiàn)，用含有鮭魚 (Oncorhynchus keta)GH的酵母投喂牙鲆，其肌肉中的總蛋白和總脂肪都有明顯的上升。盡管影響魚體組成的因素有很多種，但是我們推測(cè)，上述研究結(jié)果不一致的原因很有可能是研究中基礎(chǔ)餌料的不一致以及魚自身代謝具有種屬特異性。

3.3 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚生化指標(biāo)的影響

魚類血液與機(jī)體的代謝、營養(yǎng)狀況及疾病有著密切的關(guān)系，當(dāng)魚體受到外界因子的影響而發(fā)生生理或病理變化時(shí)，必定會(huì)在血液指標(biāo)中反映出來。因此，血液成分的變化被廣泛地用來評(píng)價(jià)魚類的健康狀況、營養(yǎng)狀況以及對(duì)環(huán)境的適應(yīng)狀況，也是重要的生理、病理和毒理學(xué)指標(biāo)［20］。魚的血脂含量受營養(yǎng)狀況、季節(jié)、運(yùn)動(dòng)狀況和咸淡水等多種因素影響，一般在咸水中飼養(yǎng)的魚類比在淡水中飼養(yǎng)的魚類血脂含量低［28］。另外，攝食情況、生長和身體狀況也是影響蛋白含量的重要因素。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)組的膽固醇、低密度脂蛋白和甘油三酯均低于對(duì)照組，且2 mg/kg和4 mg/kg試驗(yàn)組的低密度脂蛋白顯著低于對(duì)照組 (p＜0.05)，說明飼料中添加生長激素基因重組蛋白能顯著降低斜帶石斑魚的血脂水平，這與王常安等［25］研究結(jié)果一致，說明外源生長激素可以調(diào)控斜帶石斑魚的生理代謝;試驗(yàn)組的高密度脂蛋白均高于對(duì)照組，且4 mg/kg試驗(yàn)組最高，高出對(duì)照組80%。這可能是由于添加的重組蛋白影響了下游相關(guān)酶的代謝，從而促進(jìn)了脂肪的利用和高密度脂蛋白的合成。總之，在飼料中添加斜帶石斑魚生長激素基因重組蛋白降低了其血脂水平，更加有利于市場(chǎng)推廣。

3.4 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚消化酶活性的影響

消化酶主要指由消化腺和消化系統(tǒng)分泌的具有營養(yǎng)消化作用的酶類，魚類的消化酶主要分為:蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶。魚類對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消化能力取決于消化酶的活力，消化酶活性是反映魚類消化機(jī)能的重要指標(biāo)，其高低直接關(guān)系到魚類對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和利用，影響斜帶石斑魚消化酶活性的因素較多，如營養(yǎng)、鹽度、溫度、生長、年齡等［27，29］，在本試驗(yàn)中，主要考慮生長激素基因重組蛋白對(duì)斜帶石斑魚消化酶活性的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，肝臟的胰蛋白酶活性在所有消化酶活性中是最高的，可見胰蛋白酶是斜帶石斑魚主要的消化酶，同時(shí)也是蛋白質(zhì)最重要的消化酶。試驗(yàn)組脂肪酶和淀粉酶的活力均高于對(duì)照組，說明重組GH能夠促進(jìn)斜帶石斑魚對(duì)飼料淀粉和脂肪的消化，這與林建斌等［29］的報(bào)道一致，雖然魚類消化酶的研究取得了很多成果，但在其研究過程中還有很多問題和不足，魚類消化酶的進(jìn)一步研究，將越來越受到人們的重視。

3.5 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚組織抗氧化指標(biāo)的影響

魚類自身存在特定的抗氧化防御機(jī)制以應(yīng)對(duì)氧化壓力，它能消除體內(nèi)自由基，增強(qiáng)吞噬細(xì)胞防御能力和機(jī)體免疫功能，維持細(xì)胞內(nèi)的動(dòng)態(tài)平衡。魚類在進(jìn)行生理活動(dòng)的過程中會(huì)產(chǎn)生氧自由基，如分解氧以提供能量的電子傳遞鏈過程、吞噬細(xì)胞的吞噬過程以及外源物質(zhì)的分解過程等［30］?？寡趸到y(tǒng)主要由抗氧化酶和非酶類復(fù)合物構(gòu)成。其中，超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶 (CAT)等是構(gòu)成抗氧化酶系統(tǒng)的主要成分，在清除活性氧自由基中起著決定作用［31］。MDA是一種脂質(zhì)過氧化過程中衍生的代謝產(chǎn)物，同時(shí)MDA也是不飽和脂肪酸過氧化終產(chǎn)物之一，被作為一種細(xì)胞膜氧化損傷的指示物［33］它的高低也間接反映了機(jī)體細(xì)胞受損的程度。正常情況下，氧自由基的產(chǎn)生和清除過程處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，但當(dāng)受到饑餓、擁擠、溫度和鹽度等外界因素的刺激時(shí)，魚體內(nèi)的自由基水平會(huì)超過機(jī)體清除能力，就會(huì)產(chǎn)生氧化壓力，嚴(yán)重時(shí)會(huì)對(duì)魚體造成氧化損傷［32］魚類具有清除自身自基及氧化中間產(chǎn)物的抗氧化防御機(jī)制，其中抗氧化系統(tǒng)對(duì)氧化脅迫的清除起著決定性作用。

本試驗(yàn)中MDA的活性隨著重組GH的添加質(zhì)量濃度增加而降低，說明外源的生長激素重組蛋白對(duì)斜帶石斑魚的細(xì)胞有一定的保護(hù)作用。這與Zaccaron［33］的研究相一致。SOD是一種特異性消除超氧自由基的循環(huán)酶，主要負(fù)責(zé)過氧化和噬菌作用造成的組織損傷的防御保護(hù)作用。SOD含量越高，說明有待清除的超氧自由基越多［36］。本試驗(yàn)SOD的變化并不顯著，說明基因重組蛋白造成的機(jī)體細(xì)胞損傷能及時(shí)的清除。過氧化氫酶 (CAT)催化H2O2分解為H2O，保護(hù)機(jī)體穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境及細(xì)胞的正常生活。本實(shí)驗(yàn)中過氧化氫酶的活性隨著添加濃度的增加而升高，說明添加基因重組生長激素蛋白對(duì)于斜帶石斑魚的抗氧化性有一定的提高。這可能是由于本次體外表達(dá)的載體是畢赤酵母，有關(guān)研究表明［34］，酵母表達(dá)產(chǎn)物有利于增加機(jī)體的抗氧化能力。本試驗(yàn)結(jié)果還顯示，試驗(yàn)組斜帶石斑魚的總抗氧化能力均高于對(duì)照組，且4mg/kg試驗(yàn)組顯著高于對(duì)照組，說明體外噴涂斜帶石斑魚生長激素基因重組蛋白可以增強(qiáng)其抗氧化能力，這可能是由于重組GH在促進(jìn)生長的同時(shí)，又增強(qiáng)了機(jī)體的免疫力。

3.6 飼料中添加重組GH對(duì)斜帶石斑魚組織磷酸酶活性的影響

ACP和AKP是巨噬細(xì)胞溶酶體的標(biāo)志酶，在體內(nèi)直接參與磷酸集團(tuán)的轉(zhuǎn)移與代謝，是參與動(dòng)物體內(nèi)免疫活動(dòng)重要的水解酶類［35］。本研究發(fā)現(xiàn)，在飼料中添加一定量的重組生長激素能明顯的提高斜帶石斑魚肝臟磷酸酶的活性，且當(dāng)添加量為4 mg/kg的重組生長激素時(shí)，斜帶石斑魚的肝臟和血液表現(xiàn)出的磷酸酶活性最高。GH作為一種促生長激素，國內(nèi)外許多學(xué)者都已證實(shí)GH能夠影響水生動(dòng)物的免疫功能［1］，適量的補(bǔ)充外源的GH能夠提高水生生物的體液免疫因子。李晶等［6］研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)投喂含有重組GH的飼料能顯著提高鮭魚體內(nèi)的ACP和AKP的活性，黃新春等［12］研究表明，適當(dāng)?shù)难a(bǔ)充GH能顯著提高異育銀鯽血清中AKP的活性。

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，在飼料中添加4 mg/kg的生長激素基因重組蛋白對(duì)于斜帶石斑魚的生長具有明顯的促進(jìn)作用且能提高飼料利用率。重組GH產(chǎn)生這種促生長效果的同時(shí)增加了魚體粗蛋白的含量，減少了粗脂肪的含量，對(duì)于其它形態(tài)學(xué)指標(biāo)影響不大，且沒有致死或者致畸的現(xiàn)象發(fā)生。另外重組GH的添加不僅降低了斜帶石斑魚的血脂水平，改善了其消化能力和抗氧化能力，提高了體液免疫因子的活性，對(duì)于當(dāng)今大眾對(duì)低脂肪，高蛋白食物的需求有重要的現(xiàn)實(shí)意義。因此我們認(rèn)為含有斜帶石斑魚生長激素的酵母上清是一種綠色環(huán)保，且效果顯著的餌料添加劑，值得大規(guī)模的推廣和應(yīng)用。

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