胡亞敏，魯俊良，王興明，楊 歡

(西南科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院化學(xué)系，四川綿陽 621010）

天然酚類化合物是動(dòng)植物體內(nèi)最為豐富的次生代謝產(chǎn)物之一［1］，這些酚類化合物均具有很好的生物活性。酚類化合物由于其螯合特性，被證實(shí)了具有抗炎癥、抗變態(tài)反應(yīng)、抗病毒以及抗癌癥等特性［2－5］。許多酚類或者酚類衍生物都具有很強(qiáng)的抗氧化能力而對人體健康起著非常重要的作用，如葡萄酒、茶、咖啡等等中的酚類化合物。酚類化合物結(jié)構(gòu)中由于含有一個(gè)或者多個(gè)酚性羥基而很強(qiáng)的抗氧化能力以及自由基清除的能力，所以酚類化合物都具有獨(dú)特的藥理活性以及生理功能，對于疾病的預(yù)防與治療都起著非常積極的作用，正是因?yàn)槿绱?，酚類化合物引起了許多研究者的興趣［6－9］。目前，由于DNA以及多酚類化合物及酚類衍生物結(jié)構(gòu)的復(fù)雜多變性，人們對于酚類化合物抗腫瘤細(xì)胞的作用機(jī)制還未完全地建立起比較完整的理論，仍需進(jìn)一步深入研究。4-芐氧基苯酚又叫莫諾苯宗、氫醌芐基醚、對芐氧基苯酚，在工業(yè)及精細(xì)化工中有著重要用途，在橡膠工業(yè)中用作抗氧劑，也是合成選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑 (SERM)阿左昔芬的重要中間體。酚羥基具有較強(qiáng)的自由基清除功能，而如今的研究表明抗腫瘤機(jī)制中也包含了自由基清除作用［10］，本文選擇4-芐氧基苯酚 (PBP)來研究其與鯡魚精DNA的相互作用，以便為篩選新的抗腫瘤藥物提供一定的依據(jù)和參考。4-芐氧基苯酚結(jié)構(gòu)如圖1。

圖1 4-芐氧基苯酚結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of 4-Benzyloxyphenol

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑與儀器

F-4500型熒光光譜儀，日本日立公司;烏式貝德黏度計(jì)，上海市青浦縣前明玻璃儀器廠;pHS-2C型酸度計(jì)，成都方舟科技開發(fā)公司;HH-601超級恒溫水浴，金壇金南儀器廠。

鯡魚精DNA(hsDNA，AR，Sigma公司);溴化乙錠 (EB，AR，Sino-American biotec公司產(chǎn)品);三羥甲基氨基甲烷 (Tris，AR，天津科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心);寡聚核苷酸 (堿基序列為5'-AATCTCTCGG-3'，大連寶生物工程有限公司);其它試劑均為分析純，水為二次蒸餾水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 熒光光譜法 所有樣品均先用配制好的Tris-HCl緩沖液 (pH=7.4)溶解配制成高濃度溶液搖勻并靜置，當(dāng)要使用時(shí)再稀釋成所需濃度。在熒光滴定中精確量取3.00 mL待測定溶液加入到光程為1 cm的石英比色皿中，使用注射針每次加入10 μL溶液，因加入體積很小，故可以忽略體積效應(yīng)對熒光光譜的影響，測定記錄每次滴定后溶液的熒光光譜，在實(shí)驗(yàn)中，發(fā)射光譜的掃描狹縫均為5 nm，掃描間隔均為1 nm，所有實(shí)驗(yàn)的激發(fā)波長均為λex=441 nm。

Scatchard法:配制一系列不同比例的小分子與DNA混合液，其中DNA的濃度是固定的，每次比例為 Rt(Rt= ［小分子］/［DNA］，Rt=0，0.4，0.8，1.2)，使用熒光探針EB分別滴定上述溶液并記錄熒光光譜變化。

1.2.2 黏度法 使用烏氏貝德黏度計(jì)進(jìn)行黏度法測量研究，室溫下，將配制好的DNA溶液加入到干燥好了的黏度計(jì)中，將黏度計(jì)垂直的固定好并浸泡在水溶液以保持溫度的恒定，記錄DNA流下的時(shí)間，保持DNA濃度不變，每次用小分子滴定后，待溶液混合均勻后記錄好溶液流下的時(shí)間，每次平行測量3次，取其平均值，發(fā)現(xiàn)溶液流下時(shí)間均大于180 s。以η/η0為縱坐標(biāo)，小分子濃度為橫坐標(biāo)作黏度變化圖，η為混合溶液相對黏度值，η0為DNA的相對黏度值。

2 結(jié)果討論

2.1 4-芐氧基苯酚與DNA的相互作用

在pH=7.4的模擬生理環(huán)境下，保持PBP濃度不變，向PBP溶液中滴加DNA溶液，記錄PBP的熒光光譜變化，如圖2所示。由圖知，當(dāng)激發(fā)波長為441 nm時(shí)，PBP的特征發(fā)射熒光峰為584 nm，隨著溶液中鯡魚精DNA濃度的不斷增加，584 nm處峰值強(qiáng)度明顯減弱，同時(shí)在553 nm處出現(xiàn)了熒光等色點(diǎn)，等色點(diǎn)的出現(xiàn)說明形成了一種新的復(fù)合物。這些現(xiàn)象說明PBP與DNA發(fā)生了作用，并形成了新的復(fù)合物。一般，當(dāng)小分子與鯡魚精DNA相互作用時(shí)熒光出現(xiàn)明顯猝滅或者紅移現(xiàn)象，則小分子與鯡魚精DNA很有可能存在嵌插作用［11］。為了得知PBP與鯡魚精DNA結(jié)合比例，在584 nm處測定的熒光值變化作摩爾比圖，如圖3，由圖得出PBP與鯡魚精DNA的結(jié)合比為nDNA∶nPBP=1∶2。

圖2 DNA對PBP熒光光譜的影響Fig.2 Fluorescence spectra of PBP with different concentrations of DNA

圖3 PBP對DNA的摩爾比圖Fig.3 Mole ratio plots of DNA-PBP

2.2 PBP與DNA之間相互作用的熱力學(xué)研究

利用熱力學(xué)研究可以了解PBP與鯡魚精DNA之間能否自發(fā)相互作用以及它們之間的作用強(qiáng)度。通過熱力學(xué)研究先計(jì)算出在不同溫度下的結(jié)合常數(shù)K，再計(jì)算得出各種熱力學(xué)函數(shù)值。用鯡魚精DNA滴定PBP溶液，記錄584 nm處的熒光強(qiáng)度變化，以1/(A0－A)為y軸，1/［DNA］為x軸作圖的雙倒數(shù)曲線圖，如圖4。由圖中可以看出，兩條曲線均有良好的線性關(guān)系，根據(jù)公式:

圖4 雙倒數(shù)曲線圖Fig.4 Double reciprocal plots

2.3 EB探針法研究PBP與DNA之間的相互作用

EB是一種常見的陽離子天然熒光染料，它是一個(gè)共軛平面分子，EB能強(qiáng)烈而專一的嵌入到DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的堿基對中并且發(fā)生的經(jīng)典嵌插作用，使得熒光強(qiáng)度增加，所以，EB是一種常用的探測DNA構(gòu)象的熒光探針，廣泛應(yīng)用于篩選抗腫瘤藥物以及小分子與DNA間相互作用的研究［12－14］。若是DNA分子的構(gòu)象發(fā)生變化時(shí)，EB將從DNA分子中游離出來，進(jìn)而引起熒光猝滅。當(dāng)小分子與EB-DNA作用時(shí)，可以觀察EB-DNA的熒光變化可以判別小分子是否與DNA發(fā)生了作用以及它們之間是以何種模式發(fā)生的作用［15］，在溶液環(huán)境不變的條件下，若是熒光值降低了，說明EB被PBP擠出來了，則說明PBP此時(shí)嵌入到了DNA堿基對中。實(shí)驗(yàn)時(shí)，向在EB-DNA體系滴定一定濃度的PBP溶液，記錄觀察EB-DNA熒光光譜變化，熒光光譜變化如圖5所示。隨著PBP的不斷加入，EB-DNA在603 nm處的熒光強(qiáng)度逐漸小幅度下降，這表明有部分PBP嵌入到DNA堿基對，同時(shí)將EB-DNA體系中的部分EB擠出，說明PBP與DNA作用與EB同DNA作用存在競爭關(guān)系，所以我們可以推斷出PBP與DNA之間存在嵌插作用。

圖5 PBP對EB-DNA體系的熒光光譜影響Fig.5 Effects of PBP on fluorescence spectra of DNA-EB

2.4 磷酸鹽與PBP之間相互作用的研究

磷酸鹽與PBP的相互作用研究是為了探究PBP與DNA之間是否存在靜電作用。本文使用Na3PO4溶液來研究磷酸鹽與PBP之間的作用模式，Na3PO4電離出的離子能很好的模擬DNA分子的磷酸骨架，若是PBP與離子發(fā)生作用而致使熒光光譜發(fā)生變化，則PBP肯定將會與DNA分子磷酸骨架發(fā)生作用，而PBP與磷酸骨架只能通過靜電作用模式結(jié)合。在PBP溶液中逐漸滴定一定濃度的Na3PO4溶液，記錄觀察PBP熒光光譜變化如圖6。隨著Na3PO4溶液濃度的不斷增加，熒光光譜顯示在584 nm PBP的特征熒光峰不斷降低，這說明PBP與離子發(fā)生了作用而致使熒光光譜降低，當(dāng)PBP以靜電作用模式與離子發(fā)生作用時(shí)，PBP中的質(zhì)子發(fā)生轉(zhuǎn)移而被束縛，進(jìn)而使得熒光發(fā)射波長強(qiáng)度降低。所以PBP也將與磷酸骨架結(jié)合，這也就是說，PBP與DNA之間存在靜電作用。

圖6 磷酸鹽對PBP熒光光譜的影響Fig.6 Fluorescence spectra of PBP with different concentration of phosphate

2.5 寡聚核苷酸與PBP之間相互作用的研究

為了對PBP與DNA之間作用機(jī)制更進(jìn)一步的了解，本文研究寡聚核苷酸與PBP之間的相互作用，寡聚核苷酸是只有20個(gè)以下堿基的短鏈的核苷酸，因其很容易與它們的互補(bǔ)鏈對結(jié)，所以經(jīng)常用作探針研究DNA結(jié)構(gòu)。因?yàn)楣丫酆塑账嶂挥休^短的堿基鏈而無磷酸骨架以及堿基對，固PBP只能以溝渠作用方式與寡聚核苷酸作用。固定PBP溶液濃度不變，逐漸加入寡聚核苷酸溶液，記錄觀察熒光光譜變化如圖7所示?？梢钥闯?，圖中熒光值幾乎沒有發(fā)生變化，考慮到誤差，認(rèn)為在PBP溶液中加入寡聚核苷酸不會引起PBP的熒光光譜發(fā)生變化，這也就是說，PBP不會寡聚核苷酸發(fā)生作用，所以PBP也不會以溝渠作用模式與DNA發(fā)生作用。

圖7 寡聚核苷酸對PBP熒光光譜的影響Fig.7 Fluorescence spectra of PBP with different concentration of oligodeoxynucleotides

2.6 Scatchard法研究 PBP與 DNA之間的相互作用

通過小分子PBP存在下EB和DNA作用的Scatchard法分析，可以進(jìn)一步判斷證實(shí)小分子與DNA之間的相互作用方式。在EB-DNA體系中滴加PBP溶液，記錄熒光強(qiáng)度變化并作出Scatchard圖，如圖8。

圖8 0.1mol/L與0.5mol/L時(shí)DNA-EB體系的Scatchard圖Fig.8 Scatchard plots of EB-DNA system

在依據(jù) Scatchard方程［16］能夠計(jì)算出 PBP與DNA的作用位點(diǎn)n以及內(nèi)在結(jié)合常數(shù)K，計(jì)算結(jié)果均列于表1中。從不同PBP濃度下的n值和K值得變化情況就可以大體分析得出PBP與DNA之間的作用方式，若n值不變那么小分子與DNA之間是經(jīng)典嵌插模式，若K值不變那么小分子與DNA之間是非嵌插作用模式，若n值和K值都在變化，則小分子與DNA之間是以混合模式作用即既存在嵌插方式又存在著非嵌插作用方式。從表中得知n值和K值都在發(fā)生變化，這說明PBP與DNA之間為混合作用模式。

表1 PBP與DNA相互作用的Scatchard方程Table 1 Scatchard Equation of interaction between PBP and DNA

為了更進(jìn)一步了解是哪種非嵌插作用模式存在于PBP與DNA作用中，不同濃度的強(qiáng)電解質(zhì)NaCl被用于Scatchard分析中而平行進(jìn)行兩次實(shí)驗(yàn)。NaCl中的Na正離子將會在DNA分子周圍形成離子氛而包圍DNA分子，若PBP與DNA之間存在著靜電作用，那么NaCl在DNA周圍形成的離子氛將會削弱PBP與DNA之間的靜電作用力大小，那么溶液中有高濃度NaCl的n值就將比低濃度NaCl的n值低，如若不然則PBP與DNA之間就沒有靜電作用而很可能為溝槽作用。由表中可以看出，當(dāng)NaCl濃度變大時(shí)n值均降低，這說明PBP與DNA之間存在靜電作用。

2.7 黏度法研究PBP與DNA之間的相互作用

一般而言，單獨(dú)的一種技術(shù)所給出的信息量是非常有限的，因此多種技術(shù)手段的聯(lián)用是很有必要的，這樣才能為研究小分子與DNA作用模式以及機(jī)理提供更加可靠的依據(jù)。而黏度測量這種流體力學(xué)的方法也是檢測小分子與DNA作用方式的一種非常簡便有效的方法［17－19］。當(dāng)小分子PBP完全嵌入DNA堿基中發(fā)生嵌插作用時(shí)，DNA的鏈長將增加黏度值也將隨之增加;當(dāng)小分子PBP只以靜電或者溝槽方式與DNA結(jié)合時(shí)，DNA分子結(jié)構(gòu)不會發(fā)生形變則黏度值將幾乎不發(fā)生變化;當(dāng)小分子PBP是以部分嵌入模式與DNA作用時(shí)，DNA分子結(jié)構(gòu)就將發(fā)生扭結(jié)彎曲變形，此時(shí)DNA的黏度將會降低。配制一系列不同比例的DNA-PBP溶液，分別測定并記錄其相對黏度值，結(jié)果如圖9所示。由圖知，隨著DNA-PBP中PBP比例的逐漸增大，此時(shí)黏度值卻逐漸減小，這說明PBP只是部分的嵌入到DNA分子中，致使了DNA分子扭結(jié)變形而分子長度變短所致。這也就說明PBP與DNA之間的嵌插作用是部分嵌插。

圖9 PBP對DNA的黏度影響Fig.9 Influence on DNA viscosity with different concentrations of PBP

3 結(jié)論

在生理環(huán)境下，本文通過光譜以及黏度法研究了PBP與鯡魚精DNA之間的相互作用，研究發(fā)現(xiàn)PBP可以與鯡魚精DNA發(fā)生作用并以摩爾比為2∶1的比例形成了PBP－鯡魚精DNA復(fù)合物。在通過各種手段檢測發(fā)現(xiàn)PBP與鯡魚精DNA之間主要通過部分嵌插以及靜電作用方式發(fā)生作用。

在實(shí)驗(yàn)中還通過熱力學(xué)研究法計(jì)算得出了在不同溫度下PBP與鯡魚精DNA的結(jié)合常數(shù)=2.16×105L/mol，=9.67×104L/mol，說明在低溫時(shí)PBP與鯡魚精DNA的結(jié)合力度更大，這也得到了熱力學(xué)函數(shù)中焓變值得證實(shí)，降低溫度將會有利于反應(yīng)進(jìn)行，通過結(jié)合常數(shù)也計(jì)算出了各種熱力學(xué)函數(shù)= －6.18 ×104J/mol，= －1.05×103J/(mol·K)，= －3.04×104J/mol。熱力學(xué)函數(shù)值說明了PBP與鯡魚精DNA是可以自發(fā)的進(jìn)行反應(yīng)形成PBP－鯡魚精DNA復(fù)合物的，而在這一過程中焓是主要的驅(qū)動(dòng)力。

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