黃玉剛，褚曰環(huán)，何明輝，曾兆華，楊建文

(1.廣州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院化學(xué)教研室，廣東廣州 510183;2.中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院//聚合物復(fù)合材料及功能材料教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州 510275）

生物礦物質(zhì)精確和高超的結(jié)構(gòu)與功能都反映了生物大分子，尤其是蛋白質(zhì)對(duì)其形貌、尺寸及晶體取向的控制作用。蛋白質(zhì)與礦物質(zhì)相互作用，扮演結(jié)構(gòu)指導(dǎo)劑的角色。Addadi和 Morse［1－2］發(fā)現(xiàn)，軟體動(dòng)物的可溶性殼蛋白對(duì)構(gòu)成其外殼的CaCO3的晶型與取向起決定性作用。大自然這種神奇的功能激發(fā)了科學(xué)家們利用合成化合物來(lái)模擬生物大分子結(jié)構(gòu)和功能的興趣。CaCO3是自然界最為廣泛存在的礦物質(zhì)之一，它對(duì)生物有機(jī)體起著重要的作用。因此，利用合成材料來(lái)模擬CaCO3的生物礦化過(guò)程是目前的研究重點(diǎn)之一。CaCO3的生物礦化過(guò)程可用聚合物來(lái)模擬，例如明膠、己內(nèi)酯－丙烯酸嵌段共聚物等［3－4］。盡管這些材料對(duì) CaCO3晶體的取向或晶型等起到一定的調(diào)控作用，但是它們的本身結(jié)構(gòu)卻與蛋白質(zhì)完全不同?；诙嚯牡那抖喂簿畚锸歉鼮槔硐氲牟牧?，因?yàn)槎嚯暮偷鞍踪|(zhì)一樣具有α－螺旋或 β－折疊的二級(jí)結(jié)構(gòu)，分子組成也近似。Yu和Cofen［5－7］利用基于多肽的嵌段共聚物或共聚多肽來(lái)控制CaCO3在DMF相中的礦化，成績(jī)卓著。不過(guò)這些多肽結(jié)構(gòu)比較簡(jiǎn)單，側(cè)鏈的羧基含量也比較少，而且CaCO3在水相環(huán)境下的生物礦化更有意義。

本文中，結(jié)合N－羧基－環(huán)內(nèi)酸酐開(kāi)環(huán)聚合和“巰－炔”光點(diǎn)擊反應(yīng) (Thiol－Yne)制備了側(cè)鏈富含羧基的多肽基雙親水雜化共聚物，利用它來(lái)指導(dǎo)CaCO3在水溶液中的生物礦化，并探討多肽的濃度、構(gòu)象如何對(duì)CaCO3的形貌、尺寸和晶型產(chǎn)生影響。多肽嵌段共聚物的制備過(guò)程如示意圖1所示，其中端氨基的聚乙二醇單甲醚 (PEO－NH2)為引發(fā)劑，γ－炔丙基－L－谷氨酸酯 (PLG－NCA)為開(kāi)環(huán)單體，得到的聚合物記為PEO－b－PPLG;多肽側(cè)鏈的炔基在紫外光條件下用3－巰基丙酸 (MPA)改性，目標(biāo)產(chǎn)物記為 PEO－b－PPLG－g－MPA。

圖1 PEO－b－PPLG－g－MPA 的合成路線Fig.1 A route for synthesis of polypeptide－based polymer of PEO－b－PPLG－g－MPA containing rich carboxyl groups

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 原料

3－巰基丙酸 (MPA)(w＞97%)和 ω－氨基 －聚乙二醇單甲醚 (PEO－NH2，Mn=5000 g/mol)購(gòu)自Sigma－Aldrich，沒(méi)有進(jìn)一步純化。透析袋 (相對(duì)分子質(zhì)量為4000)使用前用熱水浸泡。N，N－二甲基甲酰胺 (DMF)加入氫化鈣過(guò)夜，蒸餾，加入0.4 nm分子篩保存?zhèn)溆?。光引發(fā)劑UV651(2，2－二甲氧基－1，2－二苯乙酮)為工業(yè)級(jí)，用甲醇重結(jié)晶。紫外光光源采用中壓汞燈點(diǎn)光源，光照強(qiáng)度為20 mW/cm2。

1.2 樣品合成

1.2.1 PLG－NCA、PEO－b－PPLG 和 PEO－b－PPLG－g－MPA 的合成 PLG－NCA 根據(jù)文獻(xiàn)方法合成［8］。PEO－b－PPLG的合成是在反應(yīng)瓶中將 PLG－NCA(0.8 g，3.70 ×10－3mol)用 4 mL DMF 溶解，N2鼓泡 20 min。再將溶有 0.2 g PEO－NH2的 2 mL DMF溶液用注射器注入。磁力攪拌下整個(gè)體系持續(xù)地通入N2，室溫條件反應(yīng)3 d，整個(gè)過(guò)程用干燥裝置保護(hù)。反應(yīng)結(jié)束后將溶液緩慢滴加到60 mL乙醚中沉淀出產(chǎn)物 PEO－b－PPLG，然后分別用乙醚、甲醇和水洗滌，減壓干燥。

將0.1 g PEO－b－PPLG 溶于1.5 mL DMF 中，然后按炔基和MPA比例為1∶4加入適量MPA。待聚合物完全溶解后再添加φ=5%的UV－651，室溫下用20 mW/cm2紫外光照射30 min。透析法提純產(chǎn)物，最終得到產(chǎn)物 PEO－b－PPLG－g－MPA。

1.3 測(cè)試和表征

1H NMR由Varian 300核磁共振儀采集，室溫下以DMSO－d6、CDCl3或 D2O為溶劑;GPC曲線由Waters高效凝膠色譜系統(tǒng)采集，PS柱子為固定相;CD采用JASCO－810圓二色譜儀在室溫條件下測(cè)定，首先將聚合物溶解在pH為12的水溶液中，然后稀釋至0.1 mg/mL，50 nm/min中速掃描，響應(yīng)時(shí)間為1 ms，光徑為1 cm;由JSM－6330F冷場(chǎng)發(fā)射SEM觀察CaCO3形貌，將含有CaCO3顆粒的水滴在載玻片上，多余的水用濾紙吸干，然后放在干燥器內(nèi)自然揮發(fā)，樣品測(cè)試前不經(jīng)熱處理。XRD采用Rigaku D－MAX 2200 VPC粉末X射線衍射儀在室溫下收集，掃描速率8(°)/min。Cu Kα1激發(fā)，波長(zhǎng)0.15406 nm，范圍20°～70°。CaCO3的尺寸由 Nano Measurer 1.2.5軟件統(tǒng)計(jì)。

1.4 CaCO3在水溶液中的生物礦化的模擬

在實(shí)驗(yàn)室利用Na2CO3水溶液和CaCl2水溶混合的方法來(lái)模擬CaCO3的生物礦化過(guò)程，本實(shí)驗(yàn)采用兩種方法，與Colfen［5］采用的方法類(lèi)似。具體可分為雙注射法和單注射法，雙注射法具體過(guò)程為:先配制一系列濃度不同的5 mL聚合物水溶液，pH調(diào)整到10或12;然后向聚合物溶液中同時(shí)注入0.16 mL、0.5 mol/L的Na2CO3水溶液和同等體積、濃度的CaCl2水溶液，流速均為0.03 mL/min。注入完畢，在室溫下保持CaCO3結(jié)晶，定時(shí)取樣進(jìn)行形貌分析;單注射法具體過(guò)程為:先配制一系列濃度不同的5 mL聚合物水溶液，pH調(diào)整到10或12;向聚合物溶液中注入0.16 mL、0.5 mol/L的CaCl2水溶液，室溫靜置12 h。此時(shí)再以0.03 ml/min的速度注入同等體積、濃度的Na2CO3水溶液，定時(shí)取樣進(jìn)行形貌分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 多肽基雙親水雜化共聚物的合成、表征及構(gòu)象性質(zhì)

圖2 PPLG 和 PEO－b－PPLG－g-MPA 的核磁圖Fig.2 1H NMR spectra of PEO－b－PPLG and PEO－b－PPLG－g-MPA

圖3 PEO 和 PEO－b－PPLG 的 GPC曲線Fig.3 GPC chromatograms of PEO and PEO－b－PPLG determined in DMF at 50 and in the presence of 0.1 mol/L LiBr

PEO－b－PPLG 采用 PLG－NCA 單體的開(kāi)環(huán)聚合法，以數(shù)均相對(duì)分子質(zhì)量為5000的PEO－NH2為大分子引發(fā)劑。MPA與側(cè)鏈炔基之間的Thiol－Yne點(diǎn)擊反應(yīng)在365 nm的紫外光照射下，添加光引發(fā)劑UV－651輔助進(jìn)行，目標(biāo)產(chǎn)物記為 PEO－b－PPLG－g－MPA。一個(gè)炔基可以和兩個(gè)巰基分子發(fā)生反應(yīng)，因此與傳統(tǒng)的聚谷氨酸基嵌段共聚物相比，明顯地增加了羧基含量。PEO－b－PPLG 和 PEO－b－PPLG－g－MPA的1H NMR見(jiàn)圖2所示，其中包含反應(yīng)前后各個(gè)質(zhì)子峰的位置。在圖3中PEO和PEO－b－PPLG的GPC曲線中后者為一單峰，表明成功合成了目標(biāo)聚合物，Thiol－Yne點(diǎn)擊產(chǎn)物的具體表征見(jiàn)本課題組前期報(bào)導(dǎo)［8］。本方法具有“點(diǎn)擊”反應(yīng)的特征，無(wú)須基團(tuán)保護(hù)，提純簡(jiǎn)單，效率高，最大的優(yōu)勢(shì)是Thiol－Yne點(diǎn)擊反應(yīng)無(wú)需使用銅鹽做催化劑，避免了銅鹽的生物細(xì)胞毒性。多肽鏈段的長(zhǎng)度可以通過(guò)PEO－NH2和 PLG－NCA的質(zhì)量比例來(lái)控制，當(dāng)m(PEO－NH2)∶m(PLG－NCA)分別為 1∶200 和1∶250時(shí)，根據(jù)圖2中質(zhì)子峰a和e的面積比，得到多肽組分的聚合度分別為170和224，因此經(jīng)MPA 改性后的產(chǎn)物 PEO－b－PPLG－g－MPA 簡(jiǎn)寫(xiě)為 P170和 P224。PEO－b－PPLG 及 PEO－b－PPLG－g－MPA 的相對(duì)分子質(zhì)量及其分布、Thiol－Yne效率等參數(shù)列于表1。Thiol－Yne反應(yīng)非常高效，輻照10 min內(nèi)，炔基的轉(zhuǎn)化率 (或巰基的接枝效率)即可超過(guò)92%［8］。PEO－b－PPLG 可以在 CHCl3、THF、DMF、DMSO 等溶劑中溶解。PEO－b－PPLG－g－MPA 在大部分常見(jiàn)溶劑中都不能夠溶解，不過(guò)在堿性水溶液中可溶，在DMSO中可以有限溶解。溶解度低的原因是多肽的螺旋構(gòu)象導(dǎo)致其分子鏈非常僵硬，而且側(cè)鏈引入了的大量羧基，側(cè)鏈之間強(qiáng)烈的相互作用降低了其溶解性，這也從側(cè)面證明了Thiol－Yne反應(yīng)的高效性。

表1 多肽基雜化共聚物的表征參數(shù)Table 1 Parameters for characterization of polypeptide－based hybrid copolymers

PEO－b－PPLG－g－MPA 中多肽鏈段的二級(jí)結(jié)構(gòu)可由CD測(cè)定，其結(jié)果如圖4所示。不同pH條件下P170中的多肽鏈段采取的構(gòu)象不一樣。當(dāng)pH低于4.9時(shí)，酸性條件下出現(xiàn)的以222和208 nm為中心的兩個(gè)負(fù)Contton效應(yīng)峰是多肽α－螺旋構(gòu)象的特征峰，它們分別由n1－π*和π0－π*平行極化的激子躍遷所導(dǎo)致［9］。而當(dāng)pH高于6.9時(shí)，以218 nm為中心的正的Contton效應(yīng)峰是多肽呈無(wú)規(guī)線團(tuán)的特征峰，說(shuō)明此時(shí)多肽呈現(xiàn)無(wú)規(guī)線團(tuán)二級(jí)構(gòu)象。因此，CD光譜分析表明，pH低于4.9時(shí)，多肽采取α－螺旋構(gòu)象，當(dāng)水溶液pH繼續(xù)升高時(shí)，側(cè)鏈帶負(fù)電荷，側(cè)鏈間的靜電排斥導(dǎo)致螺旋構(gòu)象解體，pH誘導(dǎo)多肽發(fā)生了構(gòu)象轉(zhuǎn)變，慢慢轉(zhuǎn)變成無(wú)規(guī)線團(tuán)狀，轉(zhuǎn)變區(qū)間是 4.9～6.9。由此可見(jiàn)，當(dāng)用PEO－b－PPLG－g－MPA 做為蛋白質(zhì)模板指導(dǎo) CaCO3的生物礦化時(shí)，因CaCO3只能在堿性條件下存在，故多肽只能采取無(wú)規(guī)線團(tuán)的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

圖4 不同pH條件下P170在水溶液中的CD曲線Fig.4 CD spectra of P170in aqueous solution with concentration of 0.1 mg/mL

2.2 CaCO3在水溶液中的形貌分析及其調(diào)控

2.2.1 肉眼觀察CaCO3的生物礦化過(guò)程 可以直接從表觀上觀察多肽對(duì)CaCO3礦化過(guò)程的影響。圖5給出了采用雙注射法時(shí)該混合體系的外觀。圖5(a，b，c)顯示，當(dāng)1 min時(shí)，含有P170的水相體系呈現(xiàn)出稍許淡藍(lán)色，并無(wú)肉眼可見(jiàn)的顆粒出現(xiàn)(圖中白色物為攪拌子);3 min時(shí)該體系淡藍(lán)色比較明顯，不過(guò)仍無(wú)肉眼可見(jiàn)的固體顆粒出現(xiàn)，淡藍(lán)色暗示了顆粒的尺度在1000 nm以?xún)?nèi);5 min后CaCl2溶液和 Na2CO3溶液同時(shí)滴加完畢，此時(shí)保持體系不再被攪動(dòng)，60 min時(shí)有肉眼可見(jiàn)固體顆粒出現(xiàn)，底部有固體顆粒沉積，不過(guò)體系上層仍保持渾濁狀。而圖5(d，e，f)顯示，如若無(wú)P170，1 min時(shí)體系即出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)顆粒，也沒(méi)有淡藍(lán)色;3 min時(shí)體系中已有大量固體顆粒;5 min后同樣保持體系不再被攪動(dòng)，60 min時(shí)發(fā)現(xiàn)底部有大量固體顆粒沉積，體系上層澄清。這些直觀的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象說(shuō)明，多肽基雜化雙親水共聚物中的多肽組分的確對(duì)CaCO3晶核的形成和晶體生長(zhǎng)有所影響，它延遲了晶核的形成和晶體的生長(zhǎng)，至少在尺度上起到了指導(dǎo)作用。

2.2.2 CaCO3生物礦化過(guò)程中多肽濃度的影響

圖5 采用雙注射法肉眼觀察P170在水溶液中對(duì)CaCO3結(jié)晶形成的控制Fig.5 Visual inspection of biomineralization of CaCO3in aqueous solution in the presence or absence of P170，double－jet method

多肽作為CaCO3的礦化指導(dǎo)劑，其濃度可能會(huì)對(duì)CaCO3晶體的形貌有所影響，利用SEM可觀測(cè)各種多肽濃度條件下CaCO3的形貌。圖6(a，b，c，d)顯示了在pH為10時(shí)，改變多肽濃度，36 h后CaCO3晶體的形貌。在濃度為0～0.05 mg/mL區(qū)間，多肽失去了對(duì)CaCO3形貌的控制，因?yàn)閺膱D6(c)和6(d)中看出，0.008 mg/mL時(shí)，CaCO3晶體是典型的六面體，與不加多肽時(shí) (0 mg/mL)的形貌一樣，六面體的尺度也都在1～8 μm之間。當(dāng)濃度增加到0.05 mg/mL時(shí)，可以觀察到除了有六面體晶體，還有少量尺寸為1～2 μm的CaCO3微球出現(xiàn)，此時(shí)六面體的尺度也在1～2 μm之間(圖6(b))，比多肽濃度為0.008 mg/mL時(shí)的尺寸小了很多，這表明在該濃度下多肽已經(jīng)對(duì)CaCO3的形貌、晶核的形成及生長(zhǎng)有了一定程度的控制作用。而當(dāng)濃度增加到1 mg/mL時(shí)，可以明顯觀察到一定數(shù)量的尺度在1.5～3.5 μm之間的 CaCO3微球，此時(shí)還有很多尺寸為幾百納米CaCO3顆粒，它們的邊緣鈍化成弧形。這說(shuō)明多肽對(duì)CaCO3的形貌已經(jīng)有較好的控制，也可以指導(dǎo)晶核的形成及其生長(zhǎng)速度。有意思的是，濃度為1 mg/mL的條件下，結(jié)晶18 h時(shí)取樣觀察可看到有橄欖形的CaCO3出現(xiàn)，它們的長(zhǎng)軸尺寸平均為 1.5 ～3.0 μm之間，平均約1.7 μm，與圖6(a)中的微球尺寸一致，這說(shuō)明在0～36 h之內(nèi)CaCO3并不是直接轉(zhuǎn)變成微球，而是從橄欖形過(guò)渡到球形。假若礦化過(guò)程時(shí)間足夠長(zhǎng)，圖6(a)和6(f)中邊緣鈍化成弧形的CaCO3晶體小顆粒幾乎全部生長(zhǎng)成微球狀，這將在下面論述。圖6(d)和6(e)分別是不含多肽的情況下結(jié)晶36 h和30 min后CaCO3的形貌，它們彼此之間并無(wú)差別，說(shuō)明若無(wú)多肽，CaCO3的形貌始終為典型的六面體形，其尺寸也相近，故可知礦化過(guò)程無(wú)法得到調(diào)控。PEO－b－PPLG－g－MPA 由兩部分組成，PPLG－g－MPA可與礦物相互作用，PEO不與礦物相互作用，這種結(jié)構(gòu)對(duì)CaCO3晶體的生長(zhǎng)起模板作用。多肽側(cè)鏈的羧基陰離子對(duì)Ca2+有高度的親合性，為Ca2+提供結(jié)合點(diǎn)，使Ca2+濃度局部過(guò)飽和，加快成核過(guò)程出現(xiàn)。晶核形成后，PPLG－g－MPA鏈段與納米晶體的表面相互作用，選擇性地吸附在晶粒表面，而不同的PEO鏈段彼此纏繞，這樣的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定納米晶粒并控制其生長(zhǎng)［10］。多個(gè)納米晶體也可以形成無(wú)序或有序的聚集體，最終呈現(xiàn)出特定的形貌。不過(guò)聚合物模板形成并發(fā)揮調(diào)控作用的機(jī)理十分復(fù)雜，目前并無(wú)確定的結(jié)論。

圖6 采用雙注射法用SEM觀察可變條件下CaCO3的形貌Fig.6 SEM morphologies of CaCO3in variable conditions in pH=10 aqueous solution，double－jet method

2.2.3 CaCO3形貌的調(diào)控 大自然中由生物蛋白所控制的CaCO3形貌具有多樣性，因此本研究進(jìn)一步探討我們所得到的多肽基雙親水雜化共聚物PEO－b－PPLG－g－MPA 對(duì) CaCO3形貌的調(diào)控作用。圖7是可變條件下CaCO3的SEM照片。CaCO3形貌的調(diào)節(jié)可以通過(guò)改變雙親水雜化共聚物中多肽嵌段的長(zhǎng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)。在 pH為10、聚合物濃度為1.0 mg/mL的條件下，當(dāng)多肽嵌段的長(zhǎng)度為224個(gè)重復(fù)單元時(shí)，CaCO3呈棒狀，其長(zhǎng)短不一，但橫截面尺寸平均為520 nm，如圖7(a)所示;同等條件下，降低多肽的長(zhǎng)度至170個(gè)重復(fù)單元，CaCO3為表面光滑的微球，尺寸在1.0～3.7 μm 之間，平均約2.4 μm，結(jié)果如圖7(b)所示。改變體系的pH值，也可以調(diào)節(jié)CaCO3的形貌。如圖7(c)所示，保持多肽長(zhǎng)度為170個(gè)重復(fù)單元，濃度同樣為1.0 mg/mL，當(dāng)pH上升到12，CaCO3為超結(jié)構(gòu)微球，其表面不再光滑，堆滿(mǎn)了片狀的CaCO3小顆粒。

圖7 在7 d后采用雙注射法觀察可變條件下后CaCO3的形貌Fig.7 Morphologies in CaCO3under variable conditions after 7 days，double－jet method

甚至改變CaCO3礦化過(guò)程的操作方法，也可以得到形貌多樣的CaCO3晶體。以上都是采用雙注射法，圖8展示了采用單注射法得到的CaCO3的形貌。如圖8(a)所示，當(dāng)pH為10時(shí)，在P170濃度為1.0 mg/mL的條件下，24 h后單注射法得到的CaCO3呈“花瓣?duì)睢?，該“花瓣?duì)睢本奂w由多根CaCO3納米棒聚集而成，而同等條件下雙注射法得到的CaCO3為表面光滑的微球 (圖8(b))。在pH為12、P224濃度為1.0 mg/mL的條件下，單注射法得到的CaCO3也是表面堆滿(mǎn)了小顆粒的超結(jié)構(gòu)微球，這與圖7(c)中CaCO3的形貌一樣。由此可見(jiàn)，在pH較高的條件下，多肽鏈段的長(zhǎng)度、結(jié)晶時(shí)間甚至注射方法式都不是影響CaCO3的主要因素，pH高，則多肽側(cè)鏈的羧基陰離子就較多，這個(gè)條件下可能對(duì)CaCO3形貌的控制作用就比較穩(wěn)定，而其他影響因素則得到抑制。

圖8 在24 h后采用單注射法觀察可變條件下CaCO3的形貌Fig.8 Morphologies of CaCO3in variable conditions using single－jet method after 24 h

2.2.3 CaCO3的晶型 用XRD研究了所得到的CaCO3的晶型。CaCO3主要有三種晶型:方解石(calcite)、文石 (aragonite)和球霰石 (vaterite)，其中前兩者是最常見(jiàn)的穩(wěn)定晶型，第三種是熱動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定晶型，在自然界中比較少見(jiàn)［1，11］。XRD(圖9)結(jié)果顯示，在實(shí)驗(yàn)條件下所有的CaCO3都為方解石晶型，其最穩(wěn)定的晶型。林嘉平等［12］用聚 (N－異丙基丙烯酰胺)－b－聚谷氨酸嵌段共聚物來(lái)調(diào)控CaCO3的生物礦化，可以得到不穩(wěn)定的球霰石，其中聚合物膠束對(duì)CaCO3的晶型有重要影響。這里，我們制備的多肽基共聚物是雙親水的，堿性條件下并不形成膠束，因此CaCO3結(jié)晶過(guò)程主要受羧酸陰離子的控制，多肽的構(gòu)象也可能調(diào)控晶核的生長(zhǎng)［12］。

圖9 在7 d后CaCO3的XRD曲線Fig.9 XRD patterns of CaCO3after 7 days

3 結(jié)論

結(jié)合N－羧基－環(huán)內(nèi)酸酐開(kāi)環(huán)聚合和“巰－炔”點(diǎn)擊反應(yīng)制備了側(cè)鏈富含羧基的多肽基雙親水雜化共聚物 (PEO－b－PPLG－g－MPA)。該多肽基共聚物可以模擬蛋白質(zhì)指導(dǎo)CaCO3在水溶液中的形貌和尺寸。多肽可以有效地調(diào)控CaCO3的生物礦化，不過(guò)此時(shí)其為無(wú)規(guī)線團(tuán)構(gòu)象，而不是其更為有序的α－螺旋或β－折疊構(gòu)象。CaCO3形貌是可控的，可以通過(guò)調(diào)整體系pH值、多肽長(zhǎng)度等手段實(shí)現(xiàn)，其形貌可以是表面光滑微球、超結(jié)構(gòu)微球、納米棒或呈“花瓣?duì)睢本奂募{米棒。

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