閆志強(qiáng) ，朱兆榮 ，劉 娟 ，劉俊瑋

（西南大學(xué)榮昌校區(qū)動物醫(yī)學(xué)系，重慶 榮 昌 402460）

抵抗感染是免疫的重要功能之一，當(dāng)動物的免疫功能正常時，就可以通過特異或非特異免疫來消滅侵入機(jī)體呼吸道，消化道等的病原微生物，而免疫低下時就會引起機(jī)體感染病原微生物從而發(fā)病。

苦芩是根據(jù)中獸醫(yī)理論和臨床辯證論治的原則，選用由苦參、黃芩、黃芪、金銀花、白頭翁、梔子組成的中藥復(fù)方。前期研究表明，苦芩對動物機(jī)體免疫功能有一定的增強(qiáng)作用[1-4]，但其可能的作用機(jī)理尚不清楚，本試驗(yàn)通過分離提取苦芩中主要活性成分總多糖，并作用于免疫低下小鼠，通過測定與免疫功能相關(guān)的指標(biāo)，以進(jìn)一步探索苦芩總多糖對小鼠免疫功能的影響，為臨床使用苦芩治療免疫方面疾病提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 昆明系小鼠，體重20±2 g，健康無病，雌雄各半，購自西南大學(xué)榮昌校區(qū)實(shí)驗(yàn)動物中心；苦參、黃芩、黃芪、金銀花、白頭翁、梔子，購自桐君閣中藥批發(fā)市場；豚鼠血清補(bǔ)體，購自廣州蕊特生物科技有限公司，批號∶111022；環(huán)磷酰胺，購自山西普德藥業(yè)有限公司，批號∶20120304；黃芪多糖注射液，購自四川廣漢市本草植化有限公司，批號∶20120318；RPMI-1640培養(yǎng)基，購自Gibco公司，批號∶8111185；苦芩和苦芩總多糖均由西南大學(xué)榮昌校區(qū)中藥創(chuàng)新實(shí)驗(yàn)室提供，其藥物濃度均為1 mL中含生藥40 mg；MTT，購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，批號∶LJ0901B8011Z；脂多糖，購自Sigma公司，批號∶2070B67；刀豆蛋白A，購自北京邦定泰克生物技術(shù)公司，批號∶20100413；其他試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)分組處理及模型的建立 將小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性藥物組、苦芩組（20 mg/kg體重）、總多糖高劑量組（40 mg/kg體重）、總多糖中劑量組（20 mg/kg體重）、總多糖低劑量組（10 mg/kg體重），每組小鼠10只。按體重灌胃給藥14 d，1次/d。在首次給藥后，除空白組外，其余各組腹腔注射環(huán)磷酰胺0.2 mL（80 mg/kg體重），建立免疫低下模型，1次/d，連續(xù)5 d?？瞻捉M與模型組給予等量生理鹽水，陽性藥物組灌胃黃芪多糖（30 mg/kg體重）。

1.3 碳粒廓清指數(shù)測定[5]各組小鼠末次給藥1 h后，以0.1 mL/10 g體重的劑量，尾靜脈注射處理后的印度墨汁，注射后2、10 min從小鼠眼眶后靜脈取血20 μL，立即加到2 mL 0.1%Na2CO3溶液中，取正常小鼠血液0.1%的Na2CO3溶液較零，于650 nm測光密度值（OD1和OD2），計算碳粒廓清指數(shù)（K）和吞噬指數(shù)（α）。

K=（lgOD1-lgOD2）/（t2-t1）；α=K1/3×體質(zhì)量/（肝質(zhì)量+脾質(zhì)量）。其中，OD1、OD2分別代表先后2次所采血樣測得的光密度值，t2-t1代表2次采血的時間間隔。

1.4 免疫器官指數(shù)的測定 將小鼠處死后，稱小鼠體質(zhì)量，取脾臟和胸腺，稱其鮮重，按公式計算脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)。脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量/體質(zhì)量；胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.5 血清溶血素的測定（凝集法）[6-7]給藥第7天各組小鼠腹腔注射5%CRBC懸液0.2 mL，免疫7 d，在末次給藥24 h后，取血，室溫放置1 h，2 000 r/min離心10 min。離心后血清用生理鹽水稀釋100倍。取稀釋后血清1 mL與5%CRBC懸液0.5 mL、10%補(bǔ)體0.5 mL，混勻，在37℃恒溫箱中30 min后于0℃冰箱終止反應(yīng)。2 000 r/min離心10 min后取上清液于紫外分光光度計540 nm處測光密度值OD，溶血素值以半數(shù)溶血值HC50表示。HC50=（樣品光密度值/CRBC半數(shù)溶血時光密度值）*稀釋倍數(shù)。

1.6 T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)測定（MTT法）[7-8]在無菌條件下取脾，研磨成漿液，用含10%新生牛血清及2%慶大霉素的RPMI-1640全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，調(diào)整脾細(xì)胞濃度為3×106個/mL，取96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔加制備成脾細(xì)胞懸液200 μL，刀豆蛋白A 15 μL（終濃度為6 mg/L），8復(fù)孔，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。結(jié)束前4 h棄上清，加人MTT液20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL終止反應(yīng)，將96孔板移入平板震蕩器，混勻，使MTT還原產(chǎn)物完全溶解，在630 nm波長處測定每孔光密度值（OD值）；以同樣的方法，把刀豆蛋白換成脂多糖，測定B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化情況。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法 用SPSS統(tǒng)計軟件，對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，并進(jìn)行分析比較，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果

2.1 苦芩總多糖對小鼠吞噬指數(shù)α的影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠吞噬指數(shù)α下降，與空白組相比，差異極顯著（P＜0.01）；苦芩組、總多糖高、中劑量組小鼠吞噬指數(shù)α升高，與模型組相比，差異極顯著（P＜0.01），總多糖低劑量組小鼠碳粒吞噬指數(shù)α升高，差異顯著（P＜0.05），各組間存在一定的量效關(guān)系，詳見表1。

表1 苦芩總多糖對免疫低下小鼠吞噬指數(shù)α影響 （X±S）

2.2 苦芩總多糖對免疫低下免疫器官指數(shù)的影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠免疫器官指數(shù)降低，與空白組相比，差異極顯著（P＜0.01）；苦芩組小鼠胸腺指數(shù)升高，與模型組相比，差異極顯著（P＜0.01），脾臟指數(shù)升高，差異顯著（P＜0.05）；總多糖組小鼠胸腺指數(shù)均升高，其中高、中劑量組小鼠胸腺指數(shù)與模型組相比，差異極顯著（P＜0.01），低劑量組差異顯著（P＜0.05）；總多糖組小鼠脾臟指數(shù)升高，其中高劑量組小鼠胸腺指數(shù)，與模型組相比，差異極顯著（P＜0.01），中劑量組有顯著性差異（P＜0.05），低劑量組差異不顯著，各組間存在一定的量效關(guān)系，見表2。

2.3 苦芩總多糖對免疫低下小鼠血清溶血素的影響 試驗(yàn)結(jié)果表明，模型組小鼠血清HC50降低，與空白組相比，有極顯著差異（P＜0.01），苦芩組、總多糖高劑量組小鼠血清HC50升高，與模型組相比，差異極顯著（P＜0.01）；中劑量組小鼠血清HC50升高，與模型組相比，差異顯著（P＜0.05），低劑量組差異不顯著，各組間存在一定的量效關(guān)系，見表3。

表2 苦芩總多糖對免疫低下小鼠免疫器官指數(shù)影響 （X±S）

表3 苦芩總多糖對免疫低下小鼠血清溶血素影響 （X±S）

2.4 苦芩總多糖對小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響 試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組小鼠T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率降低，與空白對照組比，差異顯著（P＜0.05）；苦芩組能明顯增加T、B淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，特別是對B淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，與模型組比，差異極顯著（P＜0.01）；與模型組相比，總多糖組能明顯增加T、B淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率，詳見表4。

表4 苦芩總多糖對小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖的影響 （X±S）

3 分析與討論

巨噬細(xì)胞的吞噬、殺傷、抗原加工和呈遞、合成和分泌各種活性因子的功能使得巨噬細(xì)胞在免疫方面有著相當(dāng)重要的作用。另外巨噬細(xì)胞還是機(jī)體非特異性免疫的標(biāo)志物之一。碳粒廓清指數(shù)可以很好的反映機(jī)體巨噬細(xì)胞的吞噬功能。本試驗(yàn)中苦芩總多糖對免疫抑制小鼠碳粒廓清水平有增強(qiáng)作用，且隨劑量增加，增強(qiáng)作用越明顯。表明苦芩及其總多糖均對小鼠的吞噬細(xì)胞功能有促進(jìn)作用。

胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)是評價機(jī)體免疫功能狀況的重要指標(biāo)之一，通過免疫器官指數(shù)可以間接了解體內(nèi)淋巴細(xì)胞總體水平[9-10]。淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率是評價細(xì)胞免疫功能的一個重要指標(biāo)[11]。因此免疫器官指數(shù)和T、B淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率都可以直接或者間接來反映機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫狀態(tài)。本試驗(yàn)中苦芩及其總多糖可以提高小鼠脾臟、胸腺指數(shù)，并且T、B淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化率明顯升高。

血清溶血素的測定可以反映機(jī)體的體液免疫狀態(tài)，用藥后溶血素生成增多，表明機(jī)體體液免疫功能增強(qiáng)[12]。本試驗(yàn)中，苦芩及其總多糖均能增強(qiáng)小鼠血清溶血水平，但其中總多糖低劑量對免疫抑制小鼠溶血水平影響無明顯差異，提示苦芩及其總多糖在一定的劑量水平上可增強(qiáng)小鼠血清溶血素。

綜上所述，苦芩及其總多糖可以提高吞噬細(xì)胞吞噬功能，增強(qiáng)體液免疫和細(xì)胞免疫，通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫系統(tǒng)從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能。

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