王 彬，藏玉婷，宋 揚，柴 華，丁國杰

(哈藥集團生物疫苗有限公司研發(fā)中心，哈爾濱150069)

卵黃抗體是禽類對特定抗原在卵黃中所產(chǎn)生的相應特異性抗體［1］。卵黃抗體是一種天然存在、無殘留、無毒副作用的免疫球蛋白，是抗生素的替代品［2］。目前高免卵黃液廣泛應用于一些疾病的緊急預防和治療。

在制備黃抗體時，盡管免疫雞為經(jīng)過挑選、檢查和進行了某些疫病的預防接種的健康產(chǎn)蛋母雞，但仍存在一些蛋媒性的病毒混入卵黃抗體中的可能，從而影響抗體的安全性。目前，國內(nèi)卵黃抗體生產(chǎn)普遍采用甲醛滅活的方法，其他滅活劑的滅活效果還未見報道。為此，本研究選用甲醛和二乙烯亞胺(BEI)作滅活劑，檢測對卵黃抗體中人工加入病毒的滅活效果，從中選擇適合的濃度、滅活時間和滅活溫度等，以期建立對卵黃抗體中外源病毒的有效滅活方法。

1 材料

1.1 卵黃抗體 采用本實驗室設(shè)計的酸化水-辛酸-硫酸銨三步法制備的小鵝瘟精制卵黃抗體，瓊擴效價為1∶64。經(jīng)檢測不含禽腦脊髓炎和傳染性法氏囊病毒抗體。

1.2 指示病毒 禽流感病毒(AIV):H9亞型，自行分離鑒定，EID50≥10-6.5/0.1 mL，血凝價為1∶512;雞新城疫病毒(NDV):Ⅰ系中等毒力株，EID50≥10-7.25/0.1 mL，血凝價為1∶160;禽傳染性法氏囊病病毒(IBDV):B87株，ELD50為10-6.5/0.2 mL;減蛋綜合征病毒(EDSV):EID50為10-6.8/0.1 mL，血凝價≥1:1024，均由哈藥集團生物疫苗有限公司研發(fā)中心保存;禽腦脊髓炎病毒(AEV):Van Roekel株購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，EID50為10-6.2/0.2 mL。

1.3 滅活劑 甲醛溶液，分析純，產(chǎn)地天津;BEI，瑞士進口。

1.4 SPF種蛋 6和11日齡SPF雞蛋購自斯帕法斯SPF雞場;10日齡SPF鴨蛋購自哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中心。

2 方法

2.1 指示病毒的滅活 將AEV和小鵝瘟卵黃抗體以1∶9的比例混合;NDV、AIV和EDSV分別與普通肉湯培養(yǎng)基按1∶9的比例混合;IBDV和卵黃抗體按1∶9的比例混合。將上述的混合液各加入3種不同濃度(0.03%、0.05%和0.08%)的甲醛溶液和BEI，置室溫(25℃)滅活24 h，同時設(shè)未經(jīng)滅活的卵黃抗體混合液作對照。

2.2 卵黃抗體的滅活 將卵黃抗體分別加入3種不同濃度(0.03%、0.05%和0.08%)的甲醛溶液和BEI，置室溫(25℃)滅活24 h。

2.3 滅活效果檢查 雞胚接種:取滅活后的AEV混合液經(jīng)卵黃囊接種6日齡雞胚，每胚0.2 mL，觀察至10 d;NDV、AIV混合液分別經(jīng)尿囊腔接種11日齡雞胚，每胚0.2 mL;IBDV混合液經(jīng)尿囊膜接種11日齡雞胚，每胚0.2 mL，觀察7 d，并記錄雞胚的死亡情況和病理變化。同時設(shè)置病毒陽性對照。

鴨胚接種:取滅活后的EDSV混合液經(jīng)尿囊腔接種10日齡鴨胚，觀察7 d，并記錄鴨胚的死亡情況和病理變化，同時設(shè)置病毒陽性對照。

血凝活性檢查:用不同方法滅活的病毒混合液接種雞胚(或鴨胚)后，在觀察胚體死亡情況的同時，收獲胚液做紅細胞凝集試驗。

2.4 滅活后卵黃抗體的檢測 卵黃抗體效價測定:以瓊擴方法［3］測定抗體效價。蛋白含量測定:以考馬斯亮藍染色法［4］測定抗體中的蛋白量。純度測定:以SDS-PAGE檢查［5］，分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%，電壓120 V，考馬斯亮藍R-250染色。

3 結(jié)果

3.1 滅活效果檢查 5種混有指示病毒的卵黃抗體經(jīng)甲醛和BEI處理后，經(jīng)不同途徑接種雞胚(或鴨胚)，孵育觀察后，發(fā)現(xiàn)0.02%BEI和0.03% 甲醛均不能將指示病毒全部滅活，而0.05% 和0.08%甲醛溶液則均能將指示病毒滅活。結(jié)果見表1。

3.2 血凝價測定結(jié)果 表2結(jié)果表明，0.02%BEI滅活的混合液接種的雞胚(鴨胚)的尿囊液仍有部分血凝性，而甲醛滅活的病毒混合液則沒有血凝性。

表1 不同方法滅活后接種雞胚(或鴨胚)的存活情況

表2 不同方法滅活后血凝價測定結(jié)果

3.3 雞胚的病理變化 AEV接種后10和11日齡陽性對照組各死亡1只雞胚，其余均存活。解剖雞胚，檢查胚胎的病理變化，觀察到陽性對照組雞胚矮小萎縮、腳趾蜷曲、肌肉營養(yǎng)不良等典型的禽腦脊髓炎病理變化，而陰性對照組的雞胚均發(fā)育正常。

3.4 滅活后的卵黃抗體檢測 分別用終濃度為0.02%的BEI，0.03%、0.05%和0.08%甲醛滅活的卵黃抗體作瓊擴效價測定、蛋白含量測定和SDS-PAGE分析，結(jié)果顯示，以上4種方法滅活前后抗體效價均為1∶64，未發(fā)生變化;滅活前后蛋白含量未發(fā)生變化，即以上處理未造成蛋白變性沉淀;滅活后的樣品均未出現(xiàn)雜帶(圖1)，顯示該處理未造成蛋白降解。

圖1 SDS-PAGE電泳圖

4 討論

要保證卵黃抗體制品的安全性，除了對產(chǎn)蛋母雞嚴格選擇，并對蛋媒性傳染病進行檢驗外，在免疫球蛋白提取、純化的過程中進行外源病毒滅活處理，是十分重要的技術(shù)環(huán)節(jié)。目前普遍采用的化學滅活劑為β-丙內(nèi)酯、鹽酸聚六亞甲基胍、BEI和甲醛。徐守振等［6］比較了四種不同滅活劑對新城疫病毒的滅活效果，效果最好的為β-丙內(nèi)酯，其次為鹽酸聚六亞甲基胍和甲醛，滅活效果最差的為BEI。β-丙內(nèi)酯雖然滅活效果好，但價格較高，而甲醛作為普遍使用的滅活劑造價較低，適合廣泛應用。

本研究在提取卵黃抗體的工藝流程中，首先使用辛酸處理，有效地滅活了部分病毒［7］，同時為了提高產(chǎn)品的安全性，在提取時還增加了其他滅活步驟。為更好的推廣卵黃抗體制品，本研究主要測試甲醛及BEI二種滅活劑的滅活效果和合理使用濃度。

BEI是一種毒性弱且可自行分解的烷化劑。這類化合物的化學性質(zhì)活潑，滅活機制是烷化核酸分子中的鳥嘌呤或腺嘌呤，引起單鏈斷裂、雙螺旋鍵交聯(lián)，妨礙RNA的合成，從而抑制細胞分裂。另外，它也可與微生物的酶系統(tǒng)和核酸蛋白起作用，干擾核酸代謝。因此，這類滅活劑能破壞病毒核酸，使其完全喪失感染力，但并不損害病毒表面蛋白，從而保留其抗原性［8］。

甲醛作為滅活劑，主要使微生物的蛋白質(zhì)、核酸變性，導致死亡，但不明顯影響其免疫原性，但過量的甲醛會殘留在制品中對卵黃抗體蛋白和動物機體造成損害。根據(jù)《中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程》相關(guān)規(guī)定［9］，制品中甲醛含量不應超過0.2%。為使卵黃抗體中甲醛殘留量不超過國家標準，同時能夠滿足滅活外源病毒的情況，本實驗采用不同濃度的甲醛終含量對人工混入卵黃抗體中的外源病毒進行滅活試驗。本研究采用0.02%的BEI與0.05%的甲醛作為外源病毒的滅活劑進行研究比對，BEI不能完全滅活，甲醛滅活效果較為明顯。

本研究對5種常見指示病毒滅活效果進行了檢查，旨在對目前卵黃抗體滅活方法提供理論依據(jù)，對其他有關(guān)病毒的滅活效果有待進一步檢測。

［1］孫智鋒.母雞──未來的抗體制造廠［J］.國外畜牧學豬與禽，1994，(3):67-69.

［2］高云英，趙發(fā)苗，張金良，等.雞抗豬大腸桿菌高免卵黃抗體的研制與應用［J］.畜牧獸醫(yī)雜志，2003，1:6-7.

［3］中國標準出版社第一編輯室.動物防疫標準匯編［M］.北京:中國標準出版社，2004:473-478.

［4］宋宏新，李敏感.現(xiàn)代生物化學實驗技術(shù)教程［M］.陜西人民出版社，2002.

［5］楊安綱，毛積芳，藥立波.生物化學及分子生物學實驗技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，2001:248.

［6］徐守振，王 新，伊燕博.四種不同滅活劑對新城疫病毒的滅活效果研究［J］.中國家禽，2011，33(14)15-19.

［7］譚亞軍，張庶民.抗血清制品的病毒去除/滅活［J］.中國生物制品學雜志，2009，22(10):1046-1048.

［8］趙本進，潘饒茴，陳曉清，等.二乙烯亞胺(BEI)滅活豬細小病毒的試驗報告［J］.上海畜牧獸醫(yī)通訊，2004，6:19.

［9］中華人民共和國農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國獸用生物制品規(guī)程二OOO年版［S］.18.