任平等

摘要：從畜禽動物胃腸道分離具有產(chǎn)酶能力及抑菌活性的芽孢桿菌，對其進(jìn)行耐酸、耐膽鹽、產(chǎn)酶能力及抑菌試驗(yàn)，并結(jié)合其形態(tài)特征進(jìn)行生理生化試驗(yàn)鑒定。結(jié)果表明，J2、J3和J14具有較強(qiáng)的產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的特性，N7和N10產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)，5株芽孢桿菌均有較強(qiáng)的抑菌活性并且能抵抗高濃度胃酸、膽鹽的不良環(huán)境，具有較高的存活數(shù)。初步鑒定J3為地衣芽孢桿菌，J14、J2為蠟樣芽孢桿菌，N7、N10枯草芽抱桿菌。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)酶；益生芽孢桿菌；形態(tài)特征；抑菌；生理生化；產(chǎn)酶能力；低pH值耐受性；高膽鹽耐受性；飼用益生菌

中圖分類號： Q93-331文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0362-03

收稿日期：2013-12-27

基金項(xiàng)目：陜西省西安市科技計劃（編號：NC10013）。

作者簡介：任平（1972—），女，陜西臨潼人，副研究員，主要從事微生物資源的應(yīng)用開發(fā)。E-mail：mysrenping@163.com。芽孢桿菌（Bacillus）是一類重要的微生物資源，因其具有強(qiáng)抗逆性、抗胃酸、抗干燥、耐高溫高壓、易貯存等生物特性而成為近20年發(fā)展起來的新型活菌綠色飼料添加劑，在畜牧業(yè)和飼料行業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用。當(dāng)微生態(tài)制劑所用的芽抱桿菌進(jìn)入動物消化道后，能分泌活性很強(qiáng)的胞外酶（蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶、淀粉酶），僅降解飼料中相應(yīng)的營養(yǎng)成分，提高消化率，降低料肉比[1]，可刺激機(jī)體本身酶的活性，提高動物的生產(chǎn)性能[2]；并且可拮抗病原微生物，維持和調(diào)整腸道微生態(tài)平衡，減少腹瀉，預(yù)防疾病。它具有抗生素和酶的雙重功效，在替代抗生素、防治畜禽疾病和改善環(huán)境等方面的積極作用已經(jīng)得到了公認(rèn)，在綠色畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有廣泛的開發(fā)前景[3]。

微生態(tài)制劑的生命力全賴于其所選菌種及菌種間相互配合是否嚴(yán)格，按微生態(tài)學(xué)規(guī)律精心篩選和制備。由于宿主的正常菌對本宿主（包括人或動物）有其特異性，因此選擇微生態(tài)制劑的菌種要求利用本動物體內(nèi)所分離的菌種，因?yàn)楸緞游锏木N對其宿主腸道有較強(qiáng)的黏附性，對其他宿主則表現(xiàn)出低黏附性或不黏附。益生菌菌株定植的宿主特異性直接影響益生菌制劑的應(yīng)用效果，因而菌種的分離選擇必須注意到宿主特異性問題[4]，從動物胃腸道分離的菌株，由于該菌株經(jīng)過長期的歷史進(jìn)化過程與宿主形成了供體和受體的共生關(guān)系，一定程度上保證了菌株對動物的安全性，而且畜禽解剖構(gòu)造和生理體溫與其他動物不同，從其他（包括人、動物、植物、土壤）處分離的菌種，很難在畜禽體內(nèi)存活，更談不上較強(qiáng)的黏附力，與致病菌爭奪附著點(diǎn)。因此，菌種的選擇對畜禽微生態(tài)制劑的應(yīng)用效果至關(guān)重要，理想的益生素菌種最好來自同源動物的胃腸道。本研究從牛瘤胃及雞盲腸中篩選出對低pH值和高膽鹽有較好的耐受性、產(chǎn)酶能力及抑菌活性較強(qiáng)的芽孢桿菌菌株，為飼用益生菌產(chǎn)品的開發(fā)和應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1樣品來源雞盲腸內(nèi)容物、牛新鮮的瘤胃內(nèi)容物。

1.1.2指示菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大腸桿菌（Escherichia coli）、腸炎沙門氏菌（Salmonella typhimurium），從北微生物研究所購買。

1.1.3培養(yǎng)基（1）肉湯培養(yǎng)基：牛肉膏 5.0 g，蛋白胨 3 g，NaCl 5 g，水 1 L，pH值7.2。（2）分離純化培養(yǎng)基：牛肉膏 50 g，蛋白胨 10 g，NaCl 5 g，瓊脂15 g，水 1 L，pH值7.2。（3）CMC-Na（羧甲基纖維素鈉）培養(yǎng)基：CMC-Na 1%，大豆蛋白胨0.5%，酵母粉0.05%，K2HPO4 0.15%，MgSO4·7H2O 0.02%，NaCl 05%，瓊脂粉0.8%，pH值為7.0。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1芽孢桿菌的預(yù)篩選和增殖培養(yǎng)活雞剖殺，無菌操作刮取盲腸內(nèi)容物約5 g，置于盛有95 mL無菌生理鹽水的帶有玻璃珠的三角瓶中，充分振蕩搖勻；將三角瓶于80 ℃水浴中處理15 min，挑取水浴后的菌液于菌種純化培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，置于37 ℃下培養(yǎng)48 h，挑取單個菌落革蘭氏染色鏡檢，取G+芽孢桿菌繼續(xù)純化培養(yǎng)。取新鮮牛瘤胃內(nèi)容物5 g于95 mL滅菌生理鹽水中，振蕩搖勻，置于80 ℃水浴中 15 min；挑取水浴后的菌液于菌種純化培養(yǎng)基平板上劃線培養(yǎng)，置于培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單個菌落革蘭氏染色鏡檢，取G+芽孢桿菌繼續(xù)純化培養(yǎng)。

1.2.2芽孢桿菌的篩選挑取少量純培養(yǎng)的單菌落均勻涂于玻片上，進(jìn)行結(jié)晶紫簡單染色并鏡檢，將產(chǎn)生芽孢且形態(tài)為桿狀的單菌落轉(zhuǎn)入斜面保存。

1.2.3pH值耐受性取1環(huán)斜面菌株接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min 下培養(yǎng) 36 h；再以5%的接種量接種于pH值為 3.0的肉湯培養(yǎng)液中，于37 ℃、180 r/min 下培養(yǎng)2 h；分別于0、2 h取樣，用無菌移液管取出1 mL進(jìn)行梯度稀釋10-1～10-7；取10-4～10-7梯度0.2 mL涂于平板上進(jìn)行菌落計數(shù)，并計算存活率。

1.2.4豬膽鹽耐受性以5%的接種量將種子液接入含 3 mg/mL 豬膽鹽的營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min 下?lián)u瓶培養(yǎng) 2 h；分別于0、2 h取樣，用無菌移液管取出1 mL進(jìn)行梯度稀釋10-1～10-7；取10-4～10-7梯度0.2 mL涂于平板上進(jìn)行菌落計數(shù)，并計算存活率。

1.2.5產(chǎn)酶特性

1.2.5.1雞源微生物產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶特性挑選對低pH值和豬膽鹽耐受性較好的芽孢桿菌菌株，并用無菌牙簽將這些菌株分別點(diǎn)種于淀粉培養(yǎng)基和酪蛋白培養(yǎng)基中（以點(diǎn)種在營養(yǎng)瓊脂平板作為生長對照），37 ℃培養(yǎng) 24 h后取出平板觀察透明圈大小（淀粉平板放入冰箱 4 ℃冷卻 12 h，再取出觀察透明圈大小）。

1.2.5.2牛源微生物產(chǎn)纖維素酶特性挑選對低 pH 值和豬膽鹽耐受性較好的芽孢桿菌菌株，在CMC-Na平板上以3點(diǎn)種植方法培養(yǎng)48 h，再采用剛果紅染色30 min，依次用蒸餾水和1 mol/L NaCl徹底洗去染液，再用5%醋酸固定顏色，在菌落周圍形成透明的菌落證明芽抱桿菌能產(chǎn)纖維素酶。分別測量透明圈直徑（D）和菌落直徑（d），選擇兩者比值。

1.2.6抑菌試驗(yàn)將3種指示菌分別接種于肉湯液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、180 r/min下?lián)u床培養(yǎng)24 h，活菌計數(shù)，將菌液濃度調(diào)為1億CFU/mL待用。采用瓊脂打孔擴(kuò)散法測定抑菌效果，過程為：在滅菌平皿中加入100 μL的 1億CFU/mL指示菌菌液，然后注入溫?zé)岬娜鉁腆w培養(yǎng)基，混勻，培養(yǎng)基厚度約為5 mm；待培養(yǎng)基冷卻后，用打孔器在培養(yǎng)基上打3～4個直徑為5 mm的孔，將待檢測的芽孢桿菌接種于普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基上，于37 ℃下培養(yǎng)36 h；將菌液加滿于打好的孔中，于37 ℃培養(yǎng)24 h，測定抑菌圈直徑，重復(fù)3次。

1.2.7纖維素酶活性的測定采用DNS法。

2結(jié)果與分析

2.1芽孢桿菌的篩選

利用芽孢的耐熱特性，對樣品進(jìn)行水浴，達(dá)到篩選的目的。通過水浴處理和增殖培養(yǎng)，試驗(yàn)共分離耐熱菌株40株，經(jīng)革蘭氏染色鏡檢，從中篩選出21株芽孢桿菌。

2.2耐受低 pH值芽孢桿菌株的篩選

根據(jù)菌體產(chǎn)酶特性和對病原菌的抑菌效果，J2、J3、J14具有較強(qiáng)的產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的特性，N7和N10產(chǎn)纖維素酶能力較強(qiáng)，5株芽孢桿菌均有抑菌作用。經(jīng)其形態(tài)特征、菌落特征、生理生化特征分析，初步鑒定J3為地衣芽孢桿菌，J14、J2為蠟樣芽孢桿菌，N7、N10枯草芽抱桿菌。

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高效石油降解菌BS-8產(chǎn)生物表面活性劑的性能?；燮?， 楊雪1， 王丁1， 邢文會1， 夏鐵騎2， 張紅1

（1.河南教育學(xué)院生命科學(xué)系，河南鄭州 450046； 2.濮陽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南濮陽457000）摘要：培養(yǎng)6～30 h，隨著菌體數(shù)量的迅速增加，菌株BS-8表面張力從63.2 mN/m快速下降為39.4 mN/m，其表面活性劑產(chǎn)生方式為生長相關(guān)型；以葡萄糖為碳源，對菌株BS-8的培養(yǎng)液經(jīng)離心、沉淀、顯色，顯示其表面活性劑為脂肽類物質(zhì)，從培養(yǎng)液中分離純化得到表面活性劑的產(chǎn)量為0.58 g/L，其臨界膠束濃度（CMC）為90 mg/L；在pH值 4～9、溫度20～70 ℃、NaCl濃度1%～6%的條件下，菌株BS-8產(chǎn)生物表面活性劑的穩(wěn)定性較強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：石油；降解菌BS-8；生物表面活性劑；脂肽類物質(zhì)；穩(wěn)定性

中圖分類號：Q939.9文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0365-03

收稿日期：2014-01-18

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)重點(diǎn)項(xiàng)目（編號：142102110123、122102310350）；河南省教育廳自然科學(xué)研究計劃（編號：12A180008）；河南教育學(xué)院青年課題（編號：20090105）。

作者簡介：?；燮迹?970—），女，河南新鄉(xiāng)人，博士，副教授，主要從事微生物資源開發(fā)與應(yīng)用研究。Tel：（0371）69303781；E-mail： shengwuchp@126.com。

通信作者：張紅，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事分子生物學(xué)與免疫學(xué)研究。Tel：（0371）69303663；E-mail： angela9922@sina.com。生物表面活性劑是利用酶或微生物等，通過生物催化和生物合成等技術(shù)，從微生物、植物或動物上得到的具有表面活性的物質(zhì)，按化學(xué)結(jié)構(gòu)不同分為糖脂類、脂肽和脂蛋白類、磷脂和脂肪酸類、聚合表面活性劑類和微粒表面活性劑等五大類[1]，其類型既與菌株有關(guān)，也與作為底物的碳源有關(guān)。有研究表明，碳源對微生物表面活性劑的產(chǎn)量和結(jié)構(gòu)具有決定性作用，烴類物質(zhì)的存在尤其是烴鏈長度對培養(yǎng)液中表面活性劑的濃度也會有顯著的影響[2]。不同的生物表面活性劑具有不同的分離、提取和濃縮方法，有的生物表面活性劑用乙酸乙酯提取，有的用二氯甲烷或甲醇與三氯甲烷按1 ∶2的比例提取。生物表面活性劑有較強(qiáng)的理化穩(wěn)定性，可被應(yīng)用于極端環(huán)境下，如地衣芽孢桿菌（Baclicus licheniform）產(chǎn)生的脂肽可以在75 ℃條件下耐熱140 h，銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）產(chǎn)生的類蛋白表面活性劑在pH值為 1.7～11.4范圍內(nèi)均非常穩(wěn)定[3]。生物修復(fù)被烴類和原油污染的土壤是生物表面活性劑的一個重要應(yīng)用，同時還可用于受鈾、鉻和鉛等毒性重金屬污染地區(qū)的生物修復(fù)[4]。筆者所在課題組從長期受石油污染的土壤中篩選到1組產(chǎn)生物表面活性劑的菌株，對具有較高表面活性劑產(chǎn)量及活性的菌株BS-8（Bacillus sp.）產(chǎn)生物表面活性劑進(jìn)行提取、純化，并對影響表面活性劑穩(wěn)定性的因素進(jìn)行探討，為生物表面活性劑及其產(chǎn)生菌在石油污染土壤的生物修復(fù)中提供一些理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株

降解菌BS-8從長期受石油污染的土壤中篩選到[5]。

1.2培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、NaCl 10 g/L、瓊脂20 g/L，pH值 7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 20.0 g/L、（NH4）2SO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、KH2PO4 2.0 g/L、Na2HPO4 2.0 g/L、CaCl2·H2O 0.005 g/L，pH值7.0～7.2。

1.3表面張力的測定[6]

采用圓環(huán)法測定表面張力。室溫下，用JYW-200A自動表面張力測定儀測定上清液的表面張力，3次重復(fù)。

1.4菌株BS-8產(chǎn)表面活性劑與菌體生長的動態(tài)關(guān)系

將菌株BS-8以10%的接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30 ℃、160 r/min下振蕩培養(yǎng)，每隔6 h取樣，用紫外分光光度計測定發(fā)酵液的D600 nm，并測定離心后發(fā)酵上清液的表面張力。

1.5菌株BS-8產(chǎn)生物表面活性劑的性能分析

1.5.1生物表面活性劑的定性分析將菌株BS-8活化后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，于30 ℃、160 r/min 下振蕩培養(yǎng)48 h，將培養(yǎng)液于4 ℃、10 000 r/min條件下離心20 min，收集上清液，用6 mol/L HCl將其pH值調(diào)至2～3，置于4 ℃冰箱中過夜，觀察其是否會產(chǎn)生白色沉淀，若出現(xiàn)白色沉淀，則上清液中含脂肽類或脂蛋白類表面活性劑；若沒有白色沉淀，則表明菌株產(chǎn)生了糖脂類表面活性劑[7]。

為進(jìn)一步確定表面活性劑的性質(zhì)，通過顯色反應(yīng)分析表面活性劑的類型。通過雙縮脲、茚三酮顯色反應(yīng)確定上清液中含肽鍵的脂肽、脂蛋白類表面活性劑；通過莫氏試驗(yàn)驗(yàn)證上清液中是否含糖或糖的衍生物。用乙酸乙酯萃取上清液中的表面活性劑，萃取液濃縮作硅膠薄層層析，展開劑為三氯甲烷-甲醇（體積比為9 ∶1），顯色劑為苯酚-硫酸-無水乙醇（比例為3 g ∶10 mL ∶25 mL），糖脂類表面活性劑顯棕色斑點(diǎn)；顯色劑為含 0.5%茚三酮的無水丙酮溶液，脂肽、脂蛋白類表面活性劑顯紅色斑點(diǎn)[8]。

1.5.2生物表面活性劑的提取與純化菌株BS-8活化后接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)72 h，發(fā)酵液于10 000 r/min、4 ℃下離心 20 min ，以去除菌體；上清液用 6 mol/L HCl調(diào)pH值至2.0，4 ℃下靜置12 h，再次離心收集沉淀；用少量稀HCl洗滌沉淀，1 mol/L NaOH將沉淀pH值調(diào)至 7.0，冷凍干燥得到表面活性劑粗品[9]。

將表面活性劑粗品用CH2Cl2萃取，減壓蒸餾后溶于001 mol/L NaOH，濾紙過濾，再次用6 mol/L HCl將濾液pH值調(diào)至2.0，出現(xiàn)沉淀時于10 000 r/min下離心20 min，真空干燥得到純化的生物表面活性劑[10]。

1.5.3表面活性劑的臨界膠束濃度（CMC）的測定臨界膠束濃度指表面活性劑分子在溶劑中形成膠束時的最低濃度，是表面活性劑性能的一個重要指標(biāo)。當(dāng)溶液達(dá)到臨界膠束濃度時，溶液的表面張力降到了最低，此時表面活性劑濃度再增大，溶液的表面張力也不會再下降，而且形成大量的膠團(tuán)。CMC對應(yīng)的溶液表面張力就是表面活性劑能達(dá)到的最小表面張力。

用純化得到的表面活性劑樣品制成0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 mg/L系列濃度的表面活性劑水溶液，在室溫（25±1） ℃下測量各濃度表面活性劑水溶液的表面張力，以表面活性劑濃度為橫坐標(biāo)、溶液表面張力為縱坐標(biāo)繪制曲線，以確定表面活性劑的臨界膠束濃度。

1.6影響生物表面活性劑穩(wěn)定性的因素

取純化的表面活性劑樣品溶于蒸餾水中，配制成濃度為100 mg/L的溶液，研究pH值、溫度、鹽濃度等理化因子對其穩(wěn)定性的影響。

1.6.1溫度對生物表面活性劑穩(wěn)定性的影響分別將 100 mg/L 表面活性劑溶液加熱到20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃，保持2 h，冷卻至室溫后測定溶液的表面張力，觀察其熱穩(wěn)定性。

1.6.2 pH值對生物表面活性劑穩(wěn)定性的影響分別將 100 mg/L 表面活性劑溶液的pH值調(diào)至3、4、5、6、7、8、9、10、11，然后測定其表面張力，考察其對酸堿的耐受度。

1.6.3NaCl濃度對生物表面活性劑的影響分別在 100 mg/L 表面活性劑溶液中加入一定量的NaCl，混勻，使NaCl濃度為1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%，靜置24 h后測其表面張力，考察其對鹽的耐受度。

2結(jié)果與分析

2.1表面活性劑的產(chǎn)生與菌體生長的動態(tài)關(guān)系

菌株BS-8在發(fā)酵培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，定時取樣，測定發(fā)酵液的D600 nm及離心上清液的表面張力，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、發(fā)酵液的表面張力為縱坐標(biāo)繪制BS-8的菌體生長與產(chǎn)表面活性劑的動態(tài)關(guān)系（圖1）。由圖1可知，菌株BS-8在培養(yǎng)6 h后進(jìn)入對數(shù)期，并開始產(chǎn)生表面活性劑，6～30 h間菌體數(shù)量迅速增加，發(fā)酵液的表面張力隨菌體密度的增大而降低，表面張力快速下降（從63.2 mN/m下降為 39.4 mN/m）；30～54 h間細(xì)菌密度較高，并維持在一穩(wěn)定范圍內(nèi)，隨著菌體密度緩慢增長，表面張力持續(xù)下降但降速減慢。發(fā)酵液的表面張力也降至最低（34.1 mN/m）；54～72 h間，菌體數(shù)量有所下降，表面張力有所增加。說明生物表面活性劑的產(chǎn)生與菌體生長過程密切相關(guān)，菌株BS-8的表面活性劑產(chǎn)生方式為生長相關(guān)型。

2.2菌株BS-8產(chǎn)生物表面活性劑的性能分析

以葡萄糖為碳源，將菌株BS-8培養(yǎng)后的離心上清液pH值調(diào)至2～3，4 ℃冰箱中過夜，觀察到有白色沉淀產(chǎn)生，經(jīng)硅膠薄層層析后，含0.5%茚三酮的無水丙酮溶液顯紅色斑點(diǎn)，判斷上清液中含脂肽、脂蛋白類表面活性劑。菌株BS-8振蕩培養(yǎng)72 h，從發(fā)酵離心上清液中提取表面活性劑，測得表面活性劑的含量為0.58 g/L。

將純化后的表面活性劑配制成不同濃度的水溶液，測定菌株 BS-8 產(chǎn)生的表面活性劑的CMC，結(jié)果見圖2。鄭新偉篩選到的菌株所產(chǎn)表面活性劑的CMC為130 mg/L，菌株 BS-8 的表面活性劑CMC為90 mg/L，兩者均比一般的化學(xué)表面活性劑的CMC值低1～2個數(shù)量級，所以在性能上更具優(yōu)越性[10]。圖2表明，表面活性劑的濃度從0增大到30 mg/L時，表面張力快速下降，從68.7 mN/m降到41.8 mN/m；隨著表面活性劑濃度的增大，表面張力下降幅度變小，當(dāng)表面活性劑濃度增大到90 mg/L時，表面張力降到最低（35.6 mg/L），表面活性劑濃度再升高，溶液的表面張力也不再降低。

2.3影響生物表面活性劑穩(wěn)定性的因素

2.3.1表面活性劑在不同溫度下的穩(wěn)定性將100 mg/L表面活性劑溶液分別加熱到不同溫度并保持2 h，室溫時各溶液表面張力的測定結(jié)果如表1所示。由表1可知，20～70 ℃之間，表面活性劑溶液的表面張力隨溫度的變化不大，基本保持在36.2～37.2 mN/m之間；當(dāng)溫度超過70 ℃以后，表面張力有較大提高。說明菌株BS-8在20～70 ℃具有良好的熱穩(wěn)定性。

表1不同溫度下菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑的穩(wěn)定性

溫度（℃）表面張力（mN/m）2036.83036.24036.65036.96036.87037.28038.69039.810040.7

2.3.2表面活性劑在不同pH值下的穩(wěn)定性100 mg/L表面活性劑溶液在不同pH值下保持2 h，各溶液表面張力的測定結(jié)果如表2所示。由表2可知，pH值在4～9之間時，菌株產(chǎn)生的表面活性劑表面張力隨pH值的變化不太明顯，基本穩(wěn)定在36.5～37.5 mN/m；而當(dāng)pH值<4或pH值>9時，表面張力增加，強(qiáng)酸強(qiáng)堿影響表面活性劑的活性。但總的來說，菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑有較寬的酸堿范圍。

表2pH值對菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑的穩(wěn)定性的影響

pH值表面張力（mN/m）338.3436.9536.6636.8736.9836.8937.21038.31139.8

2.3.3表面活性劑在不同NaCl濃度下的穩(wěn)定性將NaCl添加到含100 mg/L表面活性劑溶液中，使其成為一系列NaCl濃度梯度的溶液，保持2 h，測定各溶液的表面張力，結(jié)果如表3所示。表3表明，表面活性劑溶液的NaCl濃度在1%～6%之間，溶液表面張力的變化隨鹽度的變化很小，表面張力基本穩(wěn)定在36.5～37.2 mN/m范圍內(nèi)，說明菌株BS-8產(chǎn)生的生物表面活性劑在NaCl濃度為1%～6%之間有較強(qiáng)的耐鹽性；當(dāng)NaCl濃度>6%時，表面張力增幅較大。

表3 不同鹽度下菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑的穩(wěn)定性

NaCl濃度（%）表面張力（mN/m）136.6236.8336.7436.9536.8637.2738.2838.8940.2

3結(jié)論

菌株BS-8的表面活性劑產(chǎn)生方式為生長相關(guān)型，在培養(yǎng)6～30 h時，隨菌體數(shù)量的迅速增加，表面張力從 63.2 mN/m 快速下降為39.4 mN/m；之后，菌體密度緩慢增長，表面張力持續(xù)下降但降速減慢。以葡萄糖為碳源培養(yǎng)菌株BS-8，培養(yǎng)液中含脂肽、脂蛋白類表面活性劑，從培養(yǎng)液中分離、純化得到表面活性劑的產(chǎn)量為0.58 g/L，表面活性劑的CMC為90 mg/L。表面活性劑在pH值4～9、溫度20～70 ℃、NaCl濃度1%～6%的范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

參考文獻(xiàn)：

[1]Benincasa M，Contiero J，Manresa M A，et al. Rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa LBI growing on soapstock as the sole carbon source[J]. Journal of Food Engineering，2002，54（4）： 283-288.

[2]Kim H S，Jeon J W，Kim B H，et al. Extracellular production of a glycolipid biosurfactant，mannosylerythritol lipid，by Candida sp. SY16 using fed-batch fermentation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2006，70（4）：391-396.

[3]Lu J R，Zhao X B，Yaseen M. Biomimetic amphiphiles： biosurfactants[J]. Current Opinion in Colloid and Interface Seienee，2007，12：60-67.

[4]Meagher R B. Phytoremediation of toxic elemental and organic pollutants[J]. Current Opinion in Plant Biology，2000，3（2）： 153-162.

[5]夏鐵騎，?；燮迹瑥埥ㄇ?產(chǎn)生物表面活性劑石油降解菌的篩選及高效降解菌群的構(gòu)建[J]. 農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究，2013，3（6）：49-51.

[6]曹娟，徐志輝，李凌之，等. 產(chǎn)生物表面活性劑的石油降解菌Acinetobacter BHSN 的研究[J]. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報，2009，25（1）：73-78.

[7]冷凱良，楚曉珉，張輝珍，等. 微生物對石油烴降解代謝產(chǎn)物的分析方法研究[J]. 海洋水產(chǎn)研究，2001，22（2）：57-61.

[8]董曉燕.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：46-47.

[9]Bordoloi N K，Konwar B K. Microbial surfactant-enhanced mineral oil recovery under laboratory conditions[J]. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2008，63（1）： 73-82.

[10]鄭新偉.一株生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分離及其產(chǎn)物性質(zhì)的研究[D]. 西安：西北大學(xué)，2011：31.

以葡萄糖為碳源，將菌株BS-8培養(yǎng)后的離心上清液pH值調(diào)至2～3，4 ℃冰箱中過夜，觀察到有白色沉淀產(chǎn)生，經(jīng)硅膠薄層層析后，含0.5%茚三酮的無水丙酮溶液顯紅色斑點(diǎn)，判斷上清液中含脂肽、脂蛋白類表面活性劑。菌株BS-8振蕩培養(yǎng)72 h，從發(fā)酵離心上清液中提取表面活性劑，測得表面活性劑的含量為0.58 g/L。

將純化后的表面活性劑配制成不同濃度的水溶液，測定菌株 BS-8 產(chǎn)生的表面活性劑的CMC，結(jié)果見圖2。鄭新偉篩選到的菌株所產(chǎn)表面活性劑的CMC為130 mg/L，菌株 BS-8 的表面活性劑CMC為90 mg/L，兩者均比一般的化學(xué)表面活性劑的CMC值低1～2個數(shù)量級，所以在性能上更具優(yōu)越性[10]。圖2表明，表面活性劑的濃度從0增大到30 mg/L時，表面張力快速下降，從68.7 mN/m降到41.8 mN/m；隨著表面活性劑濃度的增大，表面張力下降幅度變小，當(dāng)表面活性劑濃度增大到90 mg/L時，表面張力降到最低（35.6 mg/L），表面活性劑濃度再升高，溶液的表面張力也不再降低。

2.3影響生物表面活性劑穩(wěn)定性的因素

2.3.1表面活性劑在不同溫度下的穩(wěn)定性將100 mg/L表面活性劑溶液分別加熱到不同溫度并保持2 h，室溫時各溶液表面張力的測定結(jié)果如表1所示。由表1可知，20～70 ℃之間，表面活性劑溶液的表面張力隨溫度的變化不大，基本保持在36.2～37.2 mN/m之間；當(dāng)溫度超過70 ℃以后，表面張力有較大提高。說明菌株BS-8在20～70 ℃具有良好的熱穩(wěn)定性。

表1不同溫度下菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑的穩(wěn)定性

溫度（℃）表面張力（mN/m）2036.83036.24036.65036.96036.87037.28038.69039.810040.7

2.3.2表面活性劑在不同pH值下的穩(wěn)定性100 mg/L表面活性劑溶液在不同pH值下保持2 h，各溶液表面張力的測定結(jié)果如表2所示。由表2可知，pH值在4～9之間時，菌株產(chǎn)生的表面活性劑表面張力隨pH值的變化不太明顯，基本穩(wěn)定在36.5～37.5 mN/m；而當(dāng)pH值<4或pH值>9時，表面張力增加，強(qiáng)酸強(qiáng)堿影響表面活性劑的活性。但總的來說，菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑有較寬的酸堿范圍。

表2pH值對菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑的穩(wěn)定性的影響

pH值表面張力（mN/m）338.3436.9536.6636.8736.9836.8937.21038.31139.8

2.3.3表面活性劑在不同NaCl濃度下的穩(wěn)定性將NaCl添加到含100 mg/L表面活性劑溶液中，使其成為一系列NaCl濃度梯度的溶液，保持2 h，測定各溶液的表面張力，結(jié)果如表3所示。表3表明，表面活性劑溶液的NaCl濃度在1%～6%之間，溶液表面張力的變化隨鹽度的變化很小，表面張力基本穩(wěn)定在36.5～37.2 mN/m范圍內(nèi)，說明菌株BS-8產(chǎn)生的生物表面活性劑在NaCl濃度為1%～6%之間有較強(qiáng)的耐鹽性；當(dāng)NaCl濃度>6%時，表面張力增幅較大。

表3 不同鹽度下菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑的穩(wěn)定性

NaCl濃度（%）表面張力（mN/m）136.6236.8336.7436.9536.8637.2738.2838.8940.2

3結(jié)論

菌株BS-8的表面活性劑產(chǎn)生方式為生長相關(guān)型，在培養(yǎng)6～30 h時，隨菌體數(shù)量的迅速增加，表面張力從 63.2 mN/m 快速下降為39.4 mN/m；之后，菌體密度緩慢增長，表面張力持續(xù)下降但降速減慢。以葡萄糖為碳源培養(yǎng)菌株BS-8，培養(yǎng)液中含脂肽、脂蛋白類表面活性劑，從培養(yǎng)液中分離、純化得到表面活性劑的產(chǎn)量為0.58 g/L，表面活性劑的CMC為90 mg/L。表面活性劑在pH值4～9、溫度20～70 ℃、NaCl濃度1%～6%的范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

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[1]Benincasa M，Contiero J，Manresa M A，et al. Rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa LBI growing on soapstock as the sole carbon source[J]. Journal of Food Engineering，2002，54（4）： 283-288.

[2]Kim H S，Jeon J W，Kim B H，et al. Extracellular production of a glycolipid biosurfactant，mannosylerythritol lipid，by Candida sp. SY16 using fed-batch fermentation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2006，70（4）：391-396.

[3]Lu J R，Zhao X B，Yaseen M. Biomimetic amphiphiles： biosurfactants[J]. Current Opinion in Colloid and Interface Seienee，2007，12：60-67.

[4]Meagher R B. Phytoremediation of toxic elemental and organic pollutants[J]. Current Opinion in Plant Biology，2000，3（2）： 153-162.

[5]夏鐵騎，常慧萍，張建清.產(chǎn)生物表面活性劑石油降解菌的篩選及高效降解菌群的構(gòu)建[J]. 農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究，2013，3（6）：49-51.

[6]曹娟，徐志輝，李凌之，等. 產(chǎn)生物表面活性劑的石油降解菌Acinetobacter BHSN 的研究[J]. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報，2009，25（1）：73-78.

[7]冷凱良，楚曉珉，張輝珍，等. 微生物對石油烴降解代謝產(chǎn)物的分析方法研究[J]. 海洋水產(chǎn)研究，2001，22（2）：57-61.

[8]董曉燕.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：46-47.

[9]Bordoloi N K，Konwar B K. Microbial surfactant-enhanced mineral oil recovery under laboratory conditions[J]. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2008，63（1）： 73-82.

[10]鄭新偉.一株生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分離及其產(chǎn)物性質(zhì)的研究[D]. 西安：西北大學(xué)，2011：31.

以葡萄糖為碳源，將菌株BS-8培養(yǎng)后的離心上清液pH值調(diào)至2～3，4 ℃冰箱中過夜，觀察到有白色沉淀產(chǎn)生，經(jīng)硅膠薄層層析后，含0.5%茚三酮的無水丙酮溶液顯紅色斑點(diǎn)，判斷上清液中含脂肽、脂蛋白類表面活性劑。菌株BS-8振蕩培養(yǎng)72 h，從發(fā)酵離心上清液中提取表面活性劑，測得表面活性劑的含量為0.58 g/L。

將純化后的表面活性劑配制成不同濃度的水溶液，測定菌株 BS-8 產(chǎn)生的表面活性劑的CMC，結(jié)果見圖2。鄭新偉篩選到的菌株所產(chǎn)表面活性劑的CMC為130 mg/L，菌株 BS-8 的表面活性劑CMC為90 mg/L，兩者均比一般的化學(xué)表面活性劑的CMC值低1～2個數(shù)量級，所以在性能上更具優(yōu)越性[10]。圖2表明，表面活性劑的濃度從0增大到30 mg/L時，表面張力快速下降，從68.7 mN/m降到41.8 mN/m；隨著表面活性劑濃度的增大，表面張力下降幅度變小，當(dāng)表面活性劑濃度增大到90 mg/L時，表面張力降到最低（35.6 mg/L），表面活性劑濃度再升高，溶液的表面張力也不再降低。

2.3影響生物表面活性劑穩(wěn)定性的因素

2.3.1表面活性劑在不同溫度下的穩(wěn)定性將100 mg/L表面活性劑溶液分別加熱到不同溫度并保持2 h，室溫時各溶液表面張力的測定結(jié)果如表1所示。由表1可知，20～70 ℃之間，表面活性劑溶液的表面張力隨溫度的變化不大，基本保持在36.2～37.2 mN/m之間；當(dāng)溫度超過70 ℃以后，表面張力有較大提高。說明菌株BS-8在20～70 ℃具有良好的熱穩(wěn)定性。

表1不同溫度下菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑的穩(wěn)定性

溫度（℃）表面張力（mN/m）2036.83036.24036.65036.96036.87037.28038.69039.810040.7

2.3.2表面活性劑在不同pH值下的穩(wěn)定性100 mg/L表面活性劑溶液在不同pH值下保持2 h，各溶液表面張力的測定結(jié)果如表2所示。由表2可知，pH值在4～9之間時，菌株產(chǎn)生的表面活性劑表面張力隨pH值的變化不太明顯，基本穩(wěn)定在36.5～37.5 mN/m；而當(dāng)pH值<4或pH值>9時，表面張力增加，強(qiáng)酸強(qiáng)堿影響表面活性劑的活性。但總的來說，菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑有較寬的酸堿范圍。

表2pH值對菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑的穩(wěn)定性的影響

pH值表面張力（mN/m）338.3436.9536.6636.8736.9836.8937.21038.31139.8

2.3.3表面活性劑在不同NaCl濃度下的穩(wěn)定性將NaCl添加到含100 mg/L表面活性劑溶液中，使其成為一系列NaCl濃度梯度的溶液，保持2 h，測定各溶液的表面張力，結(jié)果如表3所示。表3表明，表面活性劑溶液的NaCl濃度在1%～6%之間，溶液表面張力的變化隨鹽度的變化很小，表面張力基本穩(wěn)定在36.5～37.2 mN/m范圍內(nèi)，說明菌株BS-8產(chǎn)生的生物表面活性劑在NaCl濃度為1%～6%之間有較強(qiáng)的耐鹽性；當(dāng)NaCl濃度>6%時，表面張力增幅較大。

表3 不同鹽度下菌株BS-8產(chǎn)生的表面活性劑的穩(wěn)定性

NaCl濃度（%）表面張力（mN/m）136.6236.8336.7436.9536.8637.2738.2838.8940.2

3結(jié)論

菌株BS-8的表面活性劑產(chǎn)生方式為生長相關(guān)型，在培養(yǎng)6～30 h時，隨菌體數(shù)量的迅速增加，表面張力從 63.2 mN/m 快速下降為39.4 mN/m；之后，菌體密度緩慢增長，表面張力持續(xù)下降但降速減慢。以葡萄糖為碳源培養(yǎng)菌株BS-8，培養(yǎng)液中含脂肽、脂蛋白類表面活性劑，從培養(yǎng)液中分離、純化得到表面活性劑的產(chǎn)量為0.58 g/L，表面活性劑的CMC為90 mg/L。表面活性劑在pH值4～9、溫度20～70 ℃、NaCl濃度1%～6%的范圍內(nèi)具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性。

參考文獻(xiàn)：

[1]Benincasa M，Contiero J，Manresa M A，et al. Rhamnolipid production by Pseudomonas aeruginosa LBI growing on soapstock as the sole carbon source[J]. Journal of Food Engineering，2002，54（4）： 283-288.

[2]Kim H S，Jeon J W，Kim B H，et al. Extracellular production of a glycolipid biosurfactant，mannosylerythritol lipid，by Candida sp. SY16 using fed-batch fermentation[J]. Applied Microbiology and Biotechnology，2006，70（4）：391-396.

[3]Lu J R，Zhao X B，Yaseen M. Biomimetic amphiphiles： biosurfactants[J]. Current Opinion in Colloid and Interface Seienee，2007，12：60-67.

[4]Meagher R B. Phytoremediation of toxic elemental and organic pollutants[J]. Current Opinion in Plant Biology，2000，3（2）： 153-162.

[5]夏鐵騎，常慧萍，張建清.產(chǎn)生物表面活性劑石油降解菌的篩選及高效降解菌群的構(gòu)建[J]. 農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究，2013，3（6）：49-51.

[6]曹娟，徐志輝，李凌之，等. 產(chǎn)生物表面活性劑的石油降解菌Acinetobacter BHSN 的研究[J]. 生態(tài)與農(nóng)村環(huán)境學(xué)報，2009，25（1）：73-78.

[7]冷凱良，楚曉珉，張輝珍，等. 微生物對石油烴降解代謝產(chǎn)物的分析方法研究[J]. 海洋水產(chǎn)研究，2001，22（2）：57-61.

[8]董曉燕.生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003：46-47.

[9]Bordoloi N K，Konwar B K. Microbial surfactant-enhanced mineral oil recovery under laboratory conditions[J]. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces，2008，63（1）： 73-82.

[10]鄭新偉.一株生物表面活性劑產(chǎn)生菌的分離及其產(chǎn)物性質(zhì)的研究[D]. 西安：西北大學(xué)，2011：31.