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        ERIC—PCR指紋圖譜及電鏡技術在納豆生產(chǎn)菌鑒定中的應用

        2014-11-22 20:04:29宋凱凱等
        江蘇農(nóng)業(yè)科學 2014年10期

        宋凱凱等

        摘要:納豆是一種傳統(tǒng)的日本食品,由納豆菌在一定溫度濕度條件下發(fā)酵大豆而來,新鮮納豆表面金黃色,風味獨特營養(yǎng)豐富。納豆的主要發(fā)酵菌為納豆菌,屬芽孢桿菌屬,稱為納豆枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis var. natto),是好氧的革蘭氏陽性菌。利用掃描電子顯微鏡和ERIC-PCR指紋圖譜技術對4株納豆菌(高橋納豆、MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭)進行了親緣關系鑒定。結果顯示,MIZKAM無臭與壽納豆的親緣關系較近,而高橋納豆與其他品種親緣關系較遠。

        關鍵詞:納豆菌;形態(tài)學;ERIC-PCR;聚類分析;電鏡

        中圖分類號: Q934;Q933文獻標志碼: A文章編號:1002-1302(2014)10-0300-03

        收稿日期:2013-12-12

        基金項目:山東省科學技術廳省良種工程項目(編號:2011LZ006)。

        作者簡介:宋凱凱(1988—),女,山東濰坊人,碩士研究生,主要從事食藥用菌分子遺傳育種。E-mail:skk1003@126.com。

        通信作者:郭立忠,教授,主要從事食藥用菌的品種改良。E-mail:glz119@126.com。納豆(natto)是日本傳統(tǒng)大豆發(fā)酵食品。納豆的主要發(fā)酵菌為納豆菌,屬芽孢桿菌屬,是好氧的革蘭氏陽性菌[1]。納豆菌能分解蛋白質(zhì)、碳水化合物、脂肪等大分子物質(zhì),使發(fā)酵產(chǎn)品中富含氨基酸、有機酸、寡聚糖等多種易被人體吸收的成分,還能分泌各種酶和維生素,從而可促進小腸黏膜細胞的增殖,保證小腸功能正常[2-6]。納豆還能有效預防和輔助治療心腦血管疾病。納豆防治心腦血管疾病的藥用價值主要源自納豆激酶[7]。自1987年納豆中發(fā)現(xiàn)強力溶栓激酶——納豆激酶以來,納豆引起了全世界的廣泛關注[8]。該酶不僅有顯著的溶栓作用,還可以激活靜脈內(nèi)皮細胞的纖維蛋白酶原[9-10]。此外,納豆菌發(fā)酵液中含有多達17種氨基酸,其中包括人體必需的8種氨基酸[11],因此納豆具有“超級健康食品”的美譽。然而,由于當今市場納豆產(chǎn)品種類繁多,都有各自的菌種命名,因此本試驗利用掃描電子顯微鏡和ERIC-PCR(enterobacterial repetitive intergenic consensus PCR)指紋圖譜技術[12]對4個納豆菌生產(chǎn)種進行鑒定分析,旨在鑒定其個體形態(tài)的差別及親緣關系的遠近。

        1材料與方法

        1.1供試菌株

        4個納豆菌株(高橋納豆、MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM 無臭),由青島農(nóng)業(yè)大學農(nóng)業(yè)應用真菌研究室提供。

        1.2方法

        1.2.1單菌落培養(yǎng) 將4種納豆菌株接種到LB液體培養(yǎng)基(成分為 10 g/L 蛋白胨、5 g/L酵母粉、5 g/L NaCl)中,放入搖床37 ℃、180 r/min條件下過夜培養(yǎng),將過夜培養(yǎng)的菌液稀釋100倍后取50 μL均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基(成分為10 g/L蛋白胨、5 g/L酵母粉、5 g/L NaCl、20 g/L瓊脂)上,放入 37 ℃ 恒溫箱中過夜培養(yǎng),分別挑取菌落做四區(qū)劃線放入 37 ℃ 恒溫箱中培養(yǎng)5 h,挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。

        1.2.2菌種的形態(tài)學分析——制作納豆菌的電鏡樣品(1)將浸泡在75%乙醇中的潔凈蓋玻片取出在酒精燈火焰上燒一下,待蓋玻片冷卻后將其放到平板培養(yǎng)的菌落上輕壓一下粘取菌落;然后用PBS(pH值為7.4,將2.9 g NaH2PO4·2H2O與29 g Na2HPO4·12H2O用去離子水定容到500 mL)處理3次,每次10 min;用戊二醛固定液(配制比例為戊二醛 ∶PBS ∶去離子水體積比1 ∶8 ∶1)固定2 d,中間換1次固定液。(2)固定2 d后用PBS洗3次,每次10 min。(3)分別用30%、50%、70%、90%、100%乙醇洗樣品1 h,使其逐步脫水,再用100%乙醇洗樣品30 min。(4)用乙醇 ∶叔丁醇=1 ∶1 的混合液洗樣品30 min,再用100%叔丁醇洗樣品2次,每次30 min,用叔丁醇逐漸將乙醇從樣本中替換出來。(5)將樣本抽真空,把蓋玻片壓碎,將有菌的碎片用導電膠粘附到觀察臺上噴涂導電材料,然后在電子顯微鏡下觀察。

        1.2.3細菌基因組DNA的提取(CTAB/NaCl法)(1)將活化好的菌株轉接到5 mL LB液體培養(yǎng)基中,培養(yǎng)至飽和狀態(tài),取1.5 mL培養(yǎng)物10 000 r/min離心3 min。(2)沉淀物加入600 μL的TE緩沖液,用吸管反復吹打使之重懸,加入少量溶菌酶,37 ℃溫浴30 min,加入30 μL 10%的SDS和3 μL 20 mg/mL 的蛋白酶K,混勻,于37 ℃溫浴1 h。(3)加入 100 μL 5 mol/L的NaCl,充分混勻,再加入80 μL CTAB/NaCl溶液,混勻,于65 ℃溫浴15 min。(4)加入等體積的三氯甲烷、異戊醇,混勻,12 000 r/min離心10 min,將上清液轉到一個新管中,如果難以移出上請,先用牙簽去除界面物質(zhì)。(5)加入等體積的酚、三氯甲烷、異戊醇,混勻,12 000 r/min離心10 min,將上清液轉入另一支新管中。(6)加入1倍體積無水乙醇,輕輕混合直到DNA沉淀下來,放入-20 ℃冰箱沉淀 30 min,取出后12 000 r/min離心10 min,將沉淀轉移到 1 mL 70%乙醇中洗滌。(7)12 000 r/min離心15 min,棄上清,用超凈工作臺稍加干燥,重溶于50 μL的TE緩沖液。(8)取 2 μL 上述提取的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

        1.2.4基因組DNA純度檢測用0.8%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測,如果DNA條帶清晰、整齊、明亮且無拖尾,則表明DNA完整性好且純度較高,可用作PCR反應。

        1.2.5ERIC-PCR擴增ERIC-PCR擴增應用的引物ERIC1(5′-ggggTACCTTgCgACTAACAAATATgCT-3′)、ERIC2(5′-TgCTCTAgACTCTATTCCCTACCATCATgTTC-3′)均由上海生工生物工程有限公司合成。ERIC-PCR反應體系為50 μL,由25 μL Dream Taq PCR Master Mix(2×)、2 μL引物ERIC1(20 μmol/L)、2 μL引物ERIC2(20 μmol/L)、3 μL 基因組DNA、18 μL去離子水組成。ERIC-PCR反應條件為95 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s,52 ℃退火1 min,65 ℃ 延伸5 min,35個循環(huán);最后65 ℃延伸 16 min,4 ℃ 結束擴增。

        2結果與分析

        2.1形態(tài)學分析

        由圖1、圖2、圖3、圖4的電鏡照片可以看出,MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭的菌體呈單桿狀,而高橋納豆的菌體呈長桿狀,因此MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭3個菌株的親緣關系較近,而高橋納豆與其他3個菌株的親緣關系較遠。

        2.2DNA提取結果

        4個納豆菌株的基因組DNA 0.8%瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖5,圖中1~4號泳道分別為高橋納豆、MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭的DNA條帶。從圖5可以發(fā)現(xiàn), DNA條帶

        清晰、整齊、明亮且無拖尾,表明DNA完整性好且純度較高,可用作PCR反應。

        2.3基因組DNA的ERIC-PCR及聚類分析

        圖6為4個納豆菌株的ERIC-PCR 1.4%瓊脂糖凝膠電泳圖譜,圖中M泳道為marker,1~4號泳道分別為高橋納豆、MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭的ERIC-PCR電泳圖譜。

        使用NTSYS 2.10e軟件對4個菌株的相似性進行聚類分析,結果見圖7。

        由圖7可知,當以相似性系數(shù)0.64為閾值時,4個菌株聚成2組:第1組為MIZKAM無臭、壽納豆、 MIZKAM 1, 第2

        組為高橋納豆;當以相似性系數(shù)0.75為閾值時,4個菌株聚成3組,MIZKAM無臭和壽納豆聚為一組,MIZKAM 1和高橋納豆各為一組。因此MIZKAM無臭與壽納豆的親緣關系較近。

        3討論

        本試驗通過掃描電子顯微鏡及ERIC-PCR指紋圖譜技術對4個納豆生產(chǎn)菌株進行了親緣關系鑒定。通過ERIC-PCR指紋圖譜的聚類分析與電鏡2種技術,最終都得到MIZKAM無臭與壽納豆的親緣關系較近,而高橋納豆則與其他品種親緣關系較遠的結論,同時也證明了這2種技術對納豆菌種鑒定的準確性與可靠性。

        參考文獻:

        [1]鐘青萍,余世望,梁勝媛. 納豆菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 食品研究與開發(fā),2001,22(4):16-18.

        [2]陳麗花,陳有容,齊鳳蘭. 功能性食品——納豆的研制[J]. 上海水產(chǎn)大學學報,2001,10(2):187-189.

        [3]Sumi H,Hamada H,Tsushima H,et al. A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto:a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J]. Experientia,1987,43(10):1110-1111.

        [4]Esaki H.,Onozaki H.,Osawa T.Antioxidative activity of fermented soybean products[J]. ACS Sym Ser,1994,546:353-360.

        [5]鐘青萍,石木標,王斌. 多功能保健食品——納豆[J]. 食品研究與開發(fā),2003,24(4):81-83.

        [6]Sumi H. Antibacterial activity of bacillus natto-growth inhibition against Escherichia coli O157[J]. Bioindustry,1997,14:47.

        [7]奚曉琦,王加啟,卜登攀,等. 納豆芽孢桿菌的分離鑒定及納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報,2009,40(11):69-75.

        [8]蔣立文,周傳云,黃香華. 納豆菌的研究現(xiàn)狀和應用進展[J]. 中國食物與營養(yǎng),2007(6):24-26.

        [9]Kumada K. Isolation of Bacillus sbtilis natto which shows high fibrinolytic activity[J]. Igakutu Seibutsug Aku,1993,126(6):299-303.

        [10]平谷一,中西晃一朗,須見洋行. 血栓溶解劑:日本,日本公開特許89180834[P]. 1989-05-20.

        [11]陳有容,齊鳳蘭,陳麗花.納豆芽孢桿菌發(fā)酵液生理功能及活性成分[J]. 食品工業(yè),2003(4):42-44.

        [12]張輝,楊振泉,趙雋,等. 大腸桿菌ERIC-PCR分子分型方法的建立及其初步應用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報,2010,26(5):1098-1103.

        1.2.5ERIC-PCR擴增ERIC-PCR擴增應用的引物ERIC1(5′-ggggTACCTTgCgACTAACAAATATgCT-3′)、ERIC2(5′-TgCTCTAgACTCTATTCCCTACCATCATgTTC-3′)均由上海生工生物工程有限公司合成。ERIC-PCR反應體系為50 μL,由25 μL Dream Taq PCR Master Mix(2×)、2 μL引物ERIC1(20 μmol/L)、2 μL引物ERIC2(20 μmol/L)、3 μL 基因組DNA、18 μL去離子水組成。ERIC-PCR反應條件為95 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s,52 ℃退火1 min,65 ℃ 延伸5 min,35個循環(huán);最后65 ℃延伸 16 min,4 ℃ 結束擴增。

        2結果與分析

        2.1形態(tài)學分析

        由圖1、圖2、圖3、圖4的電鏡照片可以看出,MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭的菌體呈單桿狀,而高橋納豆的菌體呈長桿狀,因此MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭3個菌株的親緣關系較近,而高橋納豆與其他3個菌株的親緣關系較遠。

        2.2DNA提取結果

        4個納豆菌株的基因組DNA 0.8%瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖5,圖中1~4號泳道分別為高橋納豆、MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭的DNA條帶。從圖5可以發(fā)現(xiàn), DNA條帶

        清晰、整齊、明亮且無拖尾,表明DNA完整性好且純度較高,可用作PCR反應。

        2.3基因組DNA的ERIC-PCR及聚類分析

        圖6為4個納豆菌株的ERIC-PCR 1.4%瓊脂糖凝膠電泳圖譜,圖中M泳道為marker,1~4號泳道分別為高橋納豆、MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭的ERIC-PCR電泳圖譜。

        使用NTSYS 2.10e軟件對4個菌株的相似性進行聚類分析,結果見圖7。

        由圖7可知,當以相似性系數(shù)0.64為閾值時,4個菌株聚成2組:第1組為MIZKAM無臭、壽納豆、 MIZKAM 1, 第2

        組為高橋納豆;當以相似性系數(shù)0.75為閾值時,4個菌株聚成3組,MIZKAM無臭和壽納豆聚為一組,MIZKAM 1和高橋納豆各為一組。因此MIZKAM無臭與壽納豆的親緣關系較近。

        3討論

        本試驗通過掃描電子顯微鏡及ERIC-PCR指紋圖譜技術對4個納豆生產(chǎn)菌株進行了親緣關系鑒定。通過ERIC-PCR指紋圖譜的聚類分析與電鏡2種技術,最終都得到MIZKAM無臭與壽納豆的親緣關系較近,而高橋納豆則與其他品種親緣關系較遠的結論,同時也證明了這2種技術對納豆菌種鑒定的準確性與可靠性。

        參考文獻:

        [1]鐘青萍,余世望,梁勝媛. 納豆菌產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的培養(yǎng)條件的優(yōu)化[J]. 食品研究與開發(fā),2001,22(4):16-18.

        [2]陳麗花,陳有容,齊鳳蘭. 功能性食品——納豆的研制[J]. 上海水產(chǎn)大學學報,2001,10(2):187-189.

        [3]Sumi H,Hamada H,Tsushima H,et al. A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto:a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J]. Experientia,1987,43(10):1110-1111.

        [4]Esaki H.,Onozaki H.,Osawa T.Antioxidative activity of fermented soybean products[J]. ACS Sym Ser,1994,546:353-360.

        [5]鐘青萍,石木標,王斌. 多功能保健食品——納豆[J]. 食品研究與開發(fā),2003,24(4):81-83.

        [6]Sumi H. Antibacterial activity of bacillus natto-growth inhibition against Escherichia coli O157[J]. Bioindustry,1997,14:47.

        [7]奚曉琦,王加啟,卜登攀,等. 納豆芽孢桿菌的分離鑒定及納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報,2009,40(11):69-75.

        [8]蔣立文,周傳云,黃香華. 納豆菌的研究現(xiàn)狀和應用進展[J]. 中國食物與營養(yǎng),2007(6):24-26.

        [9]Kumada K. Isolation of Bacillus sbtilis natto which shows high fibrinolytic activity[J]. Igakutu Seibutsug Aku,1993,126(6):299-303.

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        [12]張輝,楊振泉,趙雋,等. 大腸桿菌ERIC-PCR分子分型方法的建立及其初步應用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報,2010,26(5):1098-1103.

        1.2.5ERIC-PCR擴增ERIC-PCR擴增應用的引物ERIC1(5′-ggggTACCTTgCgACTAACAAATATgCT-3′)、ERIC2(5′-TgCTCTAgACTCTATTCCCTACCATCATgTTC-3′)均由上海生工生物工程有限公司合成。ERIC-PCR反應體系為50 μL,由25 μL Dream Taq PCR Master Mix(2×)、2 μL引物ERIC1(20 μmol/L)、2 μL引物ERIC2(20 μmol/L)、3 μL 基因組DNA、18 μL去離子水組成。ERIC-PCR反應條件為95 ℃預變性5 min;94 ℃變性45 s,52 ℃退火1 min,65 ℃ 延伸5 min,35個循環(huán);最后65 ℃延伸 16 min,4 ℃ 結束擴增。

        2結果與分析

        2.1形態(tài)學分析

        由圖1、圖2、圖3、圖4的電鏡照片可以看出,MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭的菌體呈單桿狀,而高橋納豆的菌體呈長桿狀,因此MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭3個菌株的親緣關系較近,而高橋納豆與其他3個菌株的親緣關系較遠。

        2.2DNA提取結果

        4個納豆菌株的基因組DNA 0.8%瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖5,圖中1~4號泳道分別為高橋納豆、MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭的DNA條帶。從圖5可以發(fā)現(xiàn), DNA條帶

        清晰、整齊、明亮且無拖尾,表明DNA完整性好且純度較高,可用作PCR反應。

        2.3基因組DNA的ERIC-PCR及聚類分析

        圖6為4個納豆菌株的ERIC-PCR 1.4%瓊脂糖凝膠電泳圖譜,圖中M泳道為marker,1~4號泳道分別為高橋納豆、MIZKAM 1、壽納豆、MIZKAM無臭的ERIC-PCR電泳圖譜。

        使用NTSYS 2.10e軟件對4個菌株的相似性進行聚類分析,結果見圖7。

        由圖7可知,當以相似性系數(shù)0.64為閾值時,4個菌株聚成2組:第1組為MIZKAM無臭、壽納豆、 MIZKAM 1, 第2

        組為高橋納豆;當以相似性系數(shù)0.75為閾值時,4個菌株聚成3組,MIZKAM無臭和壽納豆聚為一組,MIZKAM 1和高橋納豆各為一組。因此MIZKAM無臭與壽納豆的親緣關系較近。

        3討論

        本試驗通過掃描電子顯微鏡及ERIC-PCR指紋圖譜技術對4個納豆生產(chǎn)菌株進行了親緣關系鑒定。通過ERIC-PCR指紋圖譜的聚類分析與電鏡2種技術,最終都得到MIZKAM無臭與壽納豆的親緣關系較近,而高橋納豆則與其他品種親緣關系較遠的結論,同時也證明了這2種技術對納豆菌種鑒定的準確性與可靠性。

        參考文獻:

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        [2]陳麗花,陳有容,齊鳳蘭. 功能性食品——納豆的研制[J]. 上海水產(chǎn)大學學報,2001,10(2):187-189.

        [3]Sumi H,Hamada H,Tsushima H,et al. A novel fibrinolytic enzyme (nattokinase) in the vegetable cheese natto:a typical and popular soybean food in the Japanese diet[J]. Experientia,1987,43(10):1110-1111.

        [4]Esaki H.,Onozaki H.,Osawa T.Antioxidative activity of fermented soybean products[J]. ACS Sym Ser,1994,546:353-360.

        [5]鐘青萍,石木標,王斌. 多功能保健食品——納豆[J]. 食品研究與開發(fā),2003,24(4):81-83.

        [6]Sumi H. Antibacterial activity of bacillus natto-growth inhibition against Escherichia coli O157[J]. Bioindustry,1997,14:47.

        [7]奚曉琦,王加啟,卜登攀,等. 納豆芽孢桿菌的分離鑒定及納豆激酶高產(chǎn)菌株的篩選[J]. 東北農(nóng)業(yè)大學學報,2009,40(11):69-75.

        [8]蔣立文,周傳云,黃香華. 納豆菌的研究現(xiàn)狀和應用進展[J]. 中國食物與營養(yǎng),2007(6):24-26.

        [9]Kumada K. Isolation of Bacillus sbtilis natto which shows high fibrinolytic activity[J]. Igakutu Seibutsug Aku,1993,126(6):299-303.

        [10]平谷一,中西晃一朗,須見洋行. 血栓溶解劑:日本,日本公開特許89180834[P]. 1989-05-20.

        [11]陳有容,齊鳳蘭,陳麗花.納豆芽孢桿菌發(fā)酵液生理功能及活性成分[J]. 食品工業(yè),2003(4):42-44.

        [12]張輝,楊振泉,趙雋,等. 大腸桿菌ERIC-PCR分子分型方法的建立及其初步應用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學報,2010,26(5):1098-1103.

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