趙莎莎++丁麗軍

摘要：采用顯微和超微技術(shù)對胡子鲇外周血細(xì)胞的組成及組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。在血涂片上可辨別出紅細(xì)胞和各種白細(xì)胞，電鏡觀察可確認(rèn)這些細(xì)胞類型。血涂片上還觀察到各個時期的紅細(xì)胞。白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞數(shù)量最多，約占白細(xì)胞總數(shù)的48.70%，嗜中性粒細(xì)胞占24.76%，單核細(xì)胞占17.03%，血栓細(xì)胞少，約為9.51%。組織結(jié)構(gòu)顯示，紅細(xì)胞為長橢圓形，胞質(zhì)中未見細(xì)胞器。淋巴細(xì)胞以大的核質(zhì)比、短的偽足和較多的胞質(zhì)液泡為特征。單核細(xì)胞特征為可見有少量的偽足、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、胞質(zhì)液泡以及偏位核。而有粒白細(xì)胞根據(jù)胞質(zhì)內(nèi)顆粒形態(tài)，將其分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型顆粒細(xì)胞3種類型，Ⅱ型類似于其他魚類的嗜中性粒細(xì)胞，Ⅲ型類似于草魚中功能衰退的嗜中性粒細(xì)胞，Ⅰ型類似于鱖魚Ⅰ型粒細(xì)胞，屬于哪種類型尚待進(jìn)一步研究。

關(guān)鍵詞：胡子鲇；血細(xì)胞；血細(xì)胞分類計數(shù)；顯微結(jié)構(gòu)；超微結(jié)構(gòu)

中圖分類號： S917.4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0220-04

收稿日期：2014-04-14

作者簡介：趙莎莎（1979—），女，江蘇徐州人，實驗師，主要從事實驗室教學(xué)工作。E-mail：157568300@qq.com。一種魚類完整的血液學(xué)資料可以反映機(jī)體的生理狀態(tài)和健康情況，對魚病的預(yù)防和診斷具有一定意義[1]。血液學(xué)檢查再結(jié)合其他常規(guī)診斷方法，常用于確定和評估魚體產(chǎn)生應(yīng)激進(jìn)而致病的環(huán)境條件[2]。作為魚類有形成分的血細(xì)胞既是魚類機(jī)體的組成部分，也是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的重要組成部分，在魚類疾病的預(yù)防過程中發(fā)揮著重要作用。目前，國內(nèi)外有關(guān)魚類外周血細(xì)胞的研究，已有較多報道，主要集中在鯉魚、鲇魚、斑點叉尾、淡水石斑魚、鯽魚、黃顙魚、長吻和軍曹魚[3-10]上。

胡子鲇（Claris fuscus Lacepede）屬于硬骨魚綱（Osteichthyes）鲇形目（Siuriformes）胡子鲇科（Clariide），廣泛分布于我國長江以南各水體，其肉質(zhì)細(xì)嫩，營養(yǎng)豐富，適應(yīng)能力強(qiáng)，經(jīng)濟(jì)價值及養(yǎng)殖效益較高，是我國重要的淡水養(yǎng)殖魚類。有關(guān)胡子鲇的研究已有相關(guān)報道[11-12]，有關(guān)血細(xì)胞方面的研究報道較少[13]。本研究以胡子鲇外周血液為材料，利用光鏡和電鏡技術(shù)對其血細(xì)胞的組成及其顯微與超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究，以期為胡子鲇外周血細(xì)胞研究提供基礎(chǔ)資料，并為其養(yǎng)殖和病害防治提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗材料

20尾體表無傷痕、健康、成熟的胡子鲇購自水產(chǎn)市場，平均體質(zhì)量1.45 kg，雌雄各占50%。暫養(yǎng)于水族箱里。

1.2試驗方法

用盛有抗凝劑的5 mL注射器從魚尾靜脈采血。部分制成血涂片（4張/尾）。經(jīng)甲醇固定后用Wrights液染色。光鏡下觀察，進(jìn)行分類描述，并對80張血涂片上的8 000個白細(xì)胞進(jìn)行分類計數(shù)。部分用于血細(xì)胞指標(biāo)的測定。紅細(xì)胞數(shù)（RBC）：用0.9%NaCl溶液將血液稀釋100倍，用血細(xì)胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)。白細(xì)胞數(shù)（WBC）：用2%醋酸將血液稀釋10倍，用血細(xì)胞計數(shù)板在顯微鏡下計數(shù)。部分血液作電鏡觀察。在加有抗凝劑的1.5 mL離心管中加入1 mL血液，1 000 r/min，離心10 min。除去血清，加入冷的（4 ℃）2%的戊二醛，4 ℃固定1 h。然后將其切成1 mm3的小塊，用 0.1 mol/L 的PBS（pH值7.2）液漂洗4次，再用1%鋨酸進(jìn)行固定，漂洗過夜，丙酮逐級脫水，Epon812包埋，LKB 5型超薄切片機(jī)切片（厚度約600×10-10 m），醋酸雙氧鈾-檸檬酸鉛雙重染色，PHILIPS TECNAI 10型透視電鏡觀察并拍照。2結(jié)果與分析

2.1血細(xì)胞計數(shù)和各類血細(xì)胞大小

3討論

3.1血細(xì)胞的組成與大小

胡子鲇白細(xì)胞比例中淋巴細(xì)胞數(shù)量最多，與日本白鯽、成年草魚[14-15]相同；與鱖魚[16]、黃顙魚[8]、南方鲇[17]等以血栓細(xì)胞為最多的魚類明顯不同 。各類白細(xì)胞所占比例，相關(guān)報道并不一致，主要表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞（9%～74%）和血栓細(xì)胞（5%～72%）所占比例，其他白細(xì)胞則因數(shù)量較少而所占比例沒有大的差異[16]。造成淋巴細(xì)胞和血栓細(xì)胞比例有差異的主要原因有3個方面：（1）相關(guān)學(xué)者在計數(shù)時沒有把血栓細(xì)胞算在內(nèi)，因而淋巴細(xì)胞比例顯著提高；（2）血涂片上血栓細(xì)胞易與淋巴細(xì)胞混淆，所以計數(shù)時可能造成誤差；（3）淋巴細(xì)胞對外部環(huán)境變化比較敏感，采血時魚體所處狀態(tài)不同，造成種間或個體間差異[16]。有關(guān)各類細(xì)胞大小相關(guān)報道基本一致，即血栓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞較小，單核細(xì)胞和粒細(xì)胞較大。

3.2血細(xì)胞形態(tài)

魚類外周血紅細(xì)胞與哺乳動物的相比，體積大，數(shù)量少，具有細(xì)胞核，胞質(zhì)中還有少量細(xì)胞器[18]，表明其代謝比較活躍。然而在胡子鲇紅細(xì)胞胞質(zhì)中未見到任何細(xì)胞器，這可能是由于在制作電鏡樣品時使用鋨酸和戊二醛的雙重固定使血紅蛋白保存比較完整而掩蓋了其他細(xì)胞器[19]。胡子鲇外周血中所見到的較幼稚和正在分裂的紅細(xì)胞，在某些魚類[18]也有報道，表明魚類紅細(xì)胞除了在造血器官中產(chǎn)生外，還可在外周血中通過直接分裂而產(chǎn)生。

在大多數(shù)硬骨魚類中淋巴細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)基本相似，但不同魚類其細(xì)胞器卻存在較大差異。本研究進(jìn)一步證實該結(jié)論的正確性。胡子鲇淋巴細(xì)胞胞質(zhì)的超微結(jié)構(gòu)中看不到細(xì)胞器，而在黃顙魚中有線粒體及大量的游離核糖體[8]，草魚中有溶酶體、核糖體等細(xì)胞器[15]。

單核細(xì)胞存在于所有脊椎動物中，起著比較重要的非特異性免疫的作用。魚類血液中有沒有單核細(xì)胞及其命名問題，早期報道中存在分歧，但被后來的研究[20]所肯定并統(tǒng)一了名稱。胡子鲇的單核細(xì)胞與哺乳動物的相似，也有胞質(zhì)突起，胞質(zhì)中含有較多的液泡和吞噬物，說明胡子鲇也可進(jìn)行活躍的變形運動，具有吞噬功能，這在多種魚類[20-21]得到直接的證實。

血栓細(xì)胞是魚類中具有凝血作用的細(xì)胞，在外周血中一般成群分布。胡子鲇的血栓細(xì)胞也是如此。Rowley等解釋這是由于在制作血涂片時較慢或在此之前血液已有部分凝固導(dǎo)致。胡子鲇的血栓細(xì)胞中所含有的電子致密顆粒，在鯪、鯇、鳙、鰱和星鯊[22-23]中均能見到，均認(rèn)為與哺乳動物血小板中稱為血栓顆粒的功能相當(dāng)。

3.3血細(xì)胞種類

在對有粒白細(xì)胞的研究中，不同學(xué)者對魚類有粒白細(xì)胞的了解也并未統(tǒng)一，主要表現(xiàn)在因分類依據(jù)不同而造成命名各異，即使同種魚類相似的細(xì)胞也會被不同研究者解釋為不同性質(zhì)的細(xì)胞。在光鏡下，一般有粒白細(xì)胞可分為3類：嗜中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。一般情況下，嗜中性粒細(xì)胞存在于所有硬骨魚類中，但是嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞的存在會因魚種類而異。Weinreb在金魚外周血中只見到少量嗜堿性粒細(xì)胞[24]。林光華等在100張革胡子鲇的血涂片上僅發(fā)現(xiàn)一個嗜堿性粒細(xì)胞[25]。南方鲇、花尾胡椒鯛、勒氏笛鯛[26-28]等的外周血中有嗜酸性粒細(xì)胞，但未發(fā)現(xiàn)嗜堿性粒細(xì)胞。而軍曹魚[10]、歐洲鰻鱺[29]等魚類的外周血中嗜酸性、嗜堿性2種粒細(xì)胞均未發(fā)現(xiàn)。即使同一種魚，不同研究者得出的結(jié)果也不一致。Willianmms等在斑點叉尾的血液中發(fā)現(xiàn)了嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞[30]，而Cannon等在斑點叉尾的血液中2種細(xì)胞均未發(fā)現(xiàn)[31]。我們對胡子鲇血涂片有粒白細(xì)胞的觀察也證實嗜中性粒細(xì)胞數(shù)量較少，在80張血涂片中沒有觀察到嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞。這可能是由于這2種細(xì)胞的顆粒易溶于水，導(dǎo)致其被溶解掉。電鏡下胡子鲇粒細(xì)胞根據(jù)其特殊顆粒的結(jié)構(gòu)特征，把其分為Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型。Ⅰ型粒細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)類似于鱖魚Ⅰ型粒細(xì)胞[16]，相同地方是細(xì)胞質(zhì)內(nèi)有基本呈圓形大小不等的電子致密顆粒，但其歸屬還不清楚；Ⅱ型類似于魚類中的嗜中性粒細(xì)胞[15，32]，胞質(zhì)中有2種類型的顆粒：一種為棒形，內(nèi)為勻質(zhì)的基質(zhì)而外部包有1層被膜，另一種為圓形，膜內(nèi)基質(zhì)也較均勻，外包被膜；Ⅲ型粒細(xì)胞類似于林光華提出的功能衰退的嗜中性粒細(xì)胞[15]，圓形顆粒分散解體而呈空泡化，致使胞質(zhì)中形成大量空泡，細(xì)胞器數(shù)量嚴(yán)重減少，細(xì)胞表現(xiàn)出退化趨勢。

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