林鋒等

摘要：膠體金免疫層析技術(shù)、RT-PCR、RT-LAMP 采用的抗體和特異性引物均針對羅氏沼蝦野田村病毒的衣殼蛋白和編碼基因RNA2。采用這3種方法分別檢測羅氏沼蝦野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus，MrNV），結(jié)果表明，免疫膠體金檢測試紙能快速檢測感染羅氏沼蝦野田村病毒的幼蝦，但靈敏度較低，能用來檢測具有疑似病癥的樣品；RT-PCR和RT-LAMP檢測靈敏度都優(yōu)于免疫膠體金檢測試紙，但RT-PCR方法操作步驟繁瑣，所耗時間較長，而RT-LAMP方法操作簡便、用時短、不需要特殊儀器，在產(chǎn)物中加入核酸染料后檢測結(jié)果可用肉眼直接判定。因此，RT-LAMP方法更適合基層和現(xiàn)場檢測，其相關(guān)試劑盒的研發(fā)更具有應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞：羅氏沼蝦野田村病毒；免疫膠體金技術(shù)；RT-PCR；RT-LAMP；檢測

中圖分類號： S945.4+19文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0214-03

收稿日期：2013-12-19

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（編號：201103034）；浙江省湖州市科技項(xiàng)目（編號：2012GN08、2011ZD2005）；浙江省淡水養(yǎng)殖科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)（編號：2012R10026-11）。

作者簡介：林鋒（1980—），男，碩士，助理研究員，主要從事水產(chǎn)病原微生物研究。E-mail：wwlinfeng@163.com。

通信作者：劉莉，副研究員，從事水產(chǎn)動物病害防治研究。E-mail：liuli6655@hotmail.com。羅氏沼蝦（Macrobrachium rosenbergii）是一種生長快、病害較少、易養(yǎng)殖的淡水養(yǎng)殖蝦，目前已經(jīng)成為我國淡水養(yǎng)殖的主要品種之一，江浙一帶是主要產(chǎn)地。羅氏沼蝦野田村病毒（Macrobrachium rosenbergii Nodavirus，MrNV）是危害羅氏沼蝦淡化苗的主要病毒，會導(dǎo)致病蝦肌肉出現(xiàn)白斑、白濁或全身發(fā)白，通常被稱為羅氏沼蝦白尾病（white tail disease，WTD），嚴(yán)重時死亡率高達(dá)90%以上[1]，對羅氏沼蝦養(yǎng)殖業(yè)造成極大的危害，已被列為OIE申報(bào)疫病和我國水生動物二類疫病。2011年至今，廣東、浙江、江蘇、上海等地連續(xù)幾年在羅氏沼蝦幼苗抽檢中均檢測到該病毒，對該病毒的防控工作還有待加強(qiáng)。目前，羅氏沼蝦野田村病毒的檢測方法有電鏡法、病毒核酸鑒定法、RT-PCR檢測法、TAS-ELISA檢測法等[2-6]，其中，RT-PCR是現(xiàn)今最為常用、也是最為經(jīng)典的檢測方法。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法（loop-mediated isothermal amplication，LAMP）是近年發(fā)展起來的一種新穎的核酸擴(kuò)增技術(shù)，在恒溫條件下高效擴(kuò)增核酸，具有高特異性、快速靈敏、高效、操作簡便等特點(diǎn)[7]，已被廣泛用于人、動植物病毒和細(xì)菌檢測。本試驗(yàn)在前人研究基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)際應(yīng)用需要，采用膠體金免疫層析技術(shù)、RT-PCR、RT-LAMP 3種方法分別檢測人工感染MrNV的羅氏沼蝦幼苗和成蝦，對3種檢測方法的優(yōu)劣進(jìn)行比較和分析，以期為羅氏沼蝦病毒病的實(shí)際診斷提供必要的技術(shù)支持。

1材料與方法

1.1材料

MrNV病樣由浙江省淡水水產(chǎn)研究所實(shí)驗(yàn)室人工攻毒制備，MrNV單克隆和多克隆抗體自行制備[8]；RNA提取試劑盒（viral RNA mini kit）購自Qiagen公司；Taq DNA聚合酶、M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL2000 Marker、100 bp DNA Ladder Marker購自TaKaRa公司；Bst DNA 聚合酶大片段購自New England BIPolabs公司；AMV酶、dNTP購自Promega公司；甜菜堿、硫酸鎂等購自Sigma公司。

1.2引物和探針的設(shè)計(jì)與合成

RT-PCR引物采用世界動物衛(wèi)生組織（OIE）推薦的MrNV特異性引物[9]；RT-LAMP反應(yīng)所用引物和探針根據(jù)GenBank公布的MrNV編碼衣殼蛋白基因RNA2序列，由在線軟件PrimerExplorer V4（http：//primerexplorer.jp/e/）設(shè)計(jì)和手工修改后獲得，利用不同引物的反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行篩選，從中選出特異性和靈敏度較佳的2對引物，其中包括2條外引物（F3、B3）和2條內(nèi)引物（FIP、BIP）（表1）。引物由上海生工生物公司合成。

1.3MrNV膠體金診斷方法的建立

1.3.1MrNV膠體金檢測試紙的制備在實(shí)驗(yàn)室自行制備鼠抗MrNV單抗和兔抗MrNV多抗的基礎(chǔ)上，與杭州某生物公司合作，以兔抗MrNV的多抗作為第一抗體吸附在結(jié)合墊上，再用鼠抗MrNV單抗與膠體金顆粒標(biāo)記，制成MrNV病毒測定膠體金試紙條（圖1）。

1.3.2MrNV膠體金檢測試紙的應(yīng)用稱取50 mg羅氏沼蝦幼苗或成蝦肌肉組織置于離心管中，加入200 μL PBS緩沖液，研磨勻漿，5 000 r/min離心2 min；用吸管吸取上清液，滴1～3滴到圖1所示樣品S孔中，等待2～5 min觀察結(jié)果。如分別在C（質(zhì)控線）和T（檢測線）處出現(xiàn)沉淀線，表明樣品為MrNV陽性；如僅有C線出現(xiàn)沉淀線，表明樣品為MrNV陰性；如沒有條帶出現(xiàn)，表明該膠體金檢測試紙條為不合格品。

1.4RT-PCR和RT-LAMP反應(yīng)

1.4.1病毒RNA的提取稱取病毒樣本50～100 mg，用Qiagen公司的RNA提取試劑盒（viral RNA mini kit）提取樣本病毒RNA，操作步驟參照說明書進(jìn)行，提取單個樣品RNA約10 min。提取的總RNA溶于50 μL雙蒸水中，利用超微量分光光度計(jì)（NanoDrop2000，USA）對核酸濃度進(jìn)行定量分析。-80 ℃保存?zhèn)溆谩?

1.4.2RT-PCR反應(yīng)體系取4 μL RNA模板，利用 M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒得到cDNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性40 s、55 ℃退火40 s、72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)后72 ℃ 15 min；1%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果。

1.4.3RT-LAMP反應(yīng)體系1.6 mmol/L MrNV-FIP和MrNV-BIP、0.2 mmol/L MrNV-F3和MrNV-B3、0.05 μmol/L MrNV-PROBE、20 mmol/L Tris-HCl （pH值80）、10 mmol/L氯化鉀、15 mmol/L硫酸銨、8 mmol/L硫酸鎂、0.1% Triton X-100、0.6 mol/L甜菜堿、1.4 mmol/L dNTP、1 U 逆轉(zhuǎn)錄酶AMV、8 U Bst DNA 聚合酶大片段，終體積為25 μL；模板4 μL。反應(yīng)條件為：63 ℃反應(yīng)45 min，85 ℃保溫5 min終止反應(yīng)。反應(yīng)前，將封存于反應(yīng)管蓋的核酸染料快速振蕩，與反應(yīng)產(chǎn)物混合均勻，靜置5 min后，通過顏色變化判定結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1MrNV膠體金檢測試紙條的制備與應(yīng)用

將陽性蝦組織勻漿液上清進(jìn)行10-1～10-8梯度稀釋，利用MrNV膠體金檢測試紙條進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，膠體金檢測試紙條僅能檢測到10-2倍稀釋度時的樣品（圖2）。整個檢測過程在10 min內(nèi)可以完成。

2.2MrNV RT-PCR檢測

將提取的MrNV RNA進(jìn)行10-1～10-8梯度稀釋，經(jīng)過RT-PCR反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，對于稀釋度大于10-5的樣品無法檢出（圖3）。整個檢測過程大概需4～5 h。

2.3MrNV RT-LAMP檢測

以10-1～10-8逐步梯度稀釋MrNV RNA為模板，進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，產(chǎn)物同時用瓊脂糖凝膠電泳和核酸染料染色，結(jié)果表明，凝膠電泳1～5號泳道能清楚觀察到階梯狀條帶，泳道6和泳道7能勉強(qiáng)看到條帶（圖4）；核酸染料染色法檢測，1～5號管為綠色，7和8號管為橙紅色，而6號管處于2種顏色的過渡階段，其中，綠色為陽性，橙紅色為陰性（圖5）。

3討論

羅氏沼蝦野田村病毒是引起羅氏沼蝦幼體產(chǎn)生白體病的病原， 發(fā)病高峰期死亡率高達(dá)100%。自2004年該病毒從羅氏沼蝦白體病樣品中被分離出來，其檢測方法不斷更新發(fā)展，

從電鏡觀察發(fā)展到分子生物學(xué)方法檢測，使得羅氏沼蝦白體病得到有效控制。但是，近年來，通過在廣東、廣西、浙江、江蘇、上海等地苗場和養(yǎng)殖場抽樣調(diào)查和采集病樣，發(fā)現(xiàn)MrNV有死灰復(fù)燃跡象，加強(qiáng)該病的檢測與預(yù)防顯得十分重要。

本試驗(yàn)在實(shí)驗(yàn)室原有研究的基礎(chǔ)上，選取了目前比較流行的3種病原檢測方法對MrNV進(jìn)行檢測比較分析。膠體金檢測技術(shù)已經(jīng)被廣泛用于醫(yī)學(xué)、動植物病原和食品安全監(jiān)督等各領(lǐng)域[10]，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)自2000年開發(fā)以來，已被用于細(xì)菌、病毒、寄生蟲和胚胎性別鑒定等檢測[11-18]。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，膠體金試紙條檢測法速度快捷、操作方便，但靈敏度相對于PCR方法較低；RT-PCR檢測法作為比較經(jīng)典的檢測方法，靈敏度遠(yuǎn)高于膠體金檢測法，但整個操作過程耗時比較長，比較繁瑣；RT-LAMP檢測法相對于膠體金檢測法而言，整個過程要長一些，全程大約要45～60 min，但靈敏度上有顯著優(yōu)勢，是RT-PCR的100倍左右。3種方法相比較，各有優(yōu)缺點(diǎn)。

在實(shí)際檢測過程中，可以根據(jù)需要作適當(dāng)選擇，比如，針對已具有肌肉白濁特征的蝦樣，完全可以用膠體金檢測法進(jìn)行病原診斷；對一些抽檢樣品，時間和空間上允許的話，可以采用RT-PCR法；從操作簡便、快捷且靈敏度高的角度出發(fā)，RT-LAMP 是三者中最好的選擇，特別是近年來RT-LAMP反應(yīng)產(chǎn)物檢測方法的不斷發(fā)展，由最初的比濁法到現(xiàn)在的比色法，減少了瓊脂糖電泳的過程，而且檢測結(jié)果的靈敏度也近似，這大大節(jié)約了時間，降低了成本。因此，相對而言，RT-LAMP方法在水生病原檢測工作中更具有應(yīng)用前景，特別是反應(yīng)產(chǎn)物檢測方法的發(fā)展，LAMP技術(shù)得到進(jìn)一步完善，更有利于相關(guān)檢測試劑盒的開發(fā)和應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

[1]錢冬，楊國梁，劉問，等. 羅氏沼蝦苗肌肉白濁病病原的初步研究[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2002，26（5）：472-476.

[2]Sri Widada J，Durand S，Cambournac I，et al. Genome-based detection methods of Macrobrachium rosenbergii nodavirus，a pathogen of the giant freshwater prawn，Macrobrachium rosenbergii dot-blot，in situ hybridization and RT-PCR[J]. Journal of Fish Diseases，2003，26（10）：583-590.

[3]錢冬，劉問，潘曉藝，等. 羅氏沼蝦諾達(dá)病毒TAS-ELISA檢測法的建立及應(yīng)用研究[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào)：農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版，2006，32（4）：377-382.

[4]Sri Widada J，Richard V，Shi Zhengli，et al. Dot-blot hybridization and RT-PCR detection of extra small virus （XSV） associated with white tail disease of prawn Macrobrachium rosenbergii[J]. Diseases of Aquatic Organisms，2004，58（1）：83-87.

[5]Romestand B，Bonami J R. A sandwich enzyme linked immunosorbent assay（S-ELISA）for detection of MrNV in the giant freshwater prawn，Macrobrachium rosenbergii（de Man）[J]. Journal of Fish Diseases，2003，26（2）：71-75.

[6]曾地剛，雷愛瑩.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測羅氏沼蝦諾達(dá)病毒[J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，37（6）：735-737.

[7]Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification[J]. Japanese Journal of Clinical Medicine，2007，65（5）：957-961.

[8]劉問，錢冬，吳建翔，等. 羅氏沼蝦諾達(dá)病毒單克隆抗體的制備及應(yīng)用[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2005，29（4）：529-533.

[9]Sahul H A S，Yoganandhan K，Sri Widada J，et al. Experimental transmission and tissue tropism of Macrobrachium rosenbergii nodavirus（MrNV）and its associated extra small virus（XSV）[J]. Dis Aquat Org，2004，62（3）：191-196.

[10]方瑩. 免疫膠體金技術(shù)及其在微生物檢測中的應(yīng)用[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006，16（11）：1399-1401.

[11]Aoi Y，Hosogai M，Tsuneda S. Real-time quantitative LAMP （loop-mediated isothermal amplification of DNA） as a simple method for monitoring ammonia-oxidizing bacteria[J]. Journal of Biotechnology，2006，125（4）：484-491.

[12]張毅，王愛華，王貴春.EMA-LAMP方法快速檢測食源性副溶血弧菌活細(xì)胞[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（10）：290-292.

[13]Cai T，Lou G Q，Yang J，et al. Development and evaluation of real-time loop-mediated isothermal amplification for hepatitis B virus DNA quantification：a new tool for HBV management[J]. Journal of Clinical Virology，2008，41（4）：270-276.

[14]張毅，胡定金，付云潔，等. PMA-LAMP法對克氏螯蝦樣品中沙門氏菌的快速檢測[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（23）：5854-5857.

[15]Ikadai H，Tanaka H，Shibahara N，et al. Molecular evidence of infections with Babesia gibsoni parasites in Japan and evaluation of the diagnostic potential of a loop-mediated isothermal amplification method[J]. Journal of Clinical Microbiology，2004，42（6）：2465-2469.

[16]劉宇卓，韓凱凱，李銀，等. 雞傳染性支氣管炎病毒RT-LAMP檢測方法的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（4）：818-821.

[17]Hirayama H，Kageyama S，Moriyasu S，et al. Rapid sexing of bovine preimplantation embryos using loop-mediated isothermal amplification[J]. Theriogenology，2004，62（5）：887-896.

[18]張雪寒，何孔旺，葉青，等. 快速檢測志賀毒素2基因的LAMP方法的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（2）：455-457.

[5]Romestand B，Bonami J R. A sandwich enzyme linked immunosorbent assay（S-ELISA）for detection of MrNV in the giant freshwater prawn，Macrobrachium rosenbergii（de Man）[J]. Journal of Fish Diseases，2003，26（2）：71-75.

[6]曾地剛，雷愛瑩.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測羅氏沼蝦諾達(dá)病毒[J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，37（6）：735-737.

[7]Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification[J]. Japanese Journal of Clinical Medicine，2007，65（5）：957-961.

[8]劉問，錢冬，吳建翔，等. 羅氏沼蝦諾達(dá)病毒單克隆抗體的制備及應(yīng)用[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2005，29（4）：529-533.

[9]Sahul H A S，Yoganandhan K，Sri Widada J，et al. Experimental transmission and tissue tropism of Macrobrachium rosenbergii nodavirus（MrNV）and its associated extra small virus（XSV）[J]. Dis Aquat Org，2004，62（3）：191-196.

[10]方瑩. 免疫膠體金技術(shù)及其在微生物檢測中的應(yīng)用[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006，16（11）：1399-1401.

[11]Aoi Y，Hosogai M，Tsuneda S. Real-time quantitative LAMP （loop-mediated isothermal amplification of DNA） as a simple method for monitoring ammonia-oxidizing bacteria[J]. Journal of Biotechnology，2006，125（4）：484-491.

[12]張毅，王愛華，王貴春.EMA-LAMP方法快速檢測食源性副溶血弧菌活細(xì)胞[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（10）：290-292.

[13]Cai T，Lou G Q，Yang J，et al. Development and evaluation of real-time loop-mediated isothermal amplification for hepatitis B virus DNA quantification：a new tool for HBV management[J]. Journal of Clinical Virology，2008，41（4）：270-276.

[14]張毅，胡定金，付云潔，等. PMA-LAMP法對克氏螯蝦樣品中沙門氏菌的快速檢測[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（23）：5854-5857.

[15]Ikadai H，Tanaka H，Shibahara N，et al. Molecular evidence of infections with Babesia gibsoni parasites in Japan and evaluation of the diagnostic potential of a loop-mediated isothermal amplification method[J]. Journal of Clinical Microbiology，2004，42（6）：2465-2469.

[16]劉宇卓，韓凱凱，李銀，等. 雞傳染性支氣管炎病毒RT-LAMP檢測方法的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（4）：818-821.

[17]Hirayama H，Kageyama S，Moriyasu S，et al. Rapid sexing of bovine preimplantation embryos using loop-mediated isothermal amplification[J]. Theriogenology，2004，62（5）：887-896.

[18]張雪寒，何孔旺，葉青，等. 快速檢測志賀毒素2基因的LAMP方法的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（2）：455-457.

[5]Romestand B，Bonami J R. A sandwich enzyme linked immunosorbent assay（S-ELISA）for detection of MrNV in the giant freshwater prawn，Macrobrachium rosenbergii（de Man）[J]. Journal of Fish Diseases，2003，26（2）：71-75.

[6]曾地剛，雷愛瑩.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）檢測羅氏沼蝦諾達(dá)病毒[J]. 廣西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，37（6）：735-737.

[7]Notomi T. Loop-mediated isothermal amplification[J]. Japanese Journal of Clinical Medicine，2007，65（5）：957-961.

[8]劉問，錢冬，吳建翔，等. 羅氏沼蝦諾達(dá)病毒單克隆抗體的制備及應(yīng)用[J]. 水產(chǎn)學(xué)報(bào)，2005，29（4）：529-533.

[9]Sahul H A S，Yoganandhan K，Sri Widada J，et al. Experimental transmission and tissue tropism of Macrobrachium rosenbergii nodavirus（MrNV）and its associated extra small virus（XSV）[J]. Dis Aquat Org，2004，62（3）：191-196.

[10]方瑩. 免疫膠體金技術(shù)及其在微生物檢測中的應(yīng)用[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2006，16（11）：1399-1401.

[11]Aoi Y，Hosogai M，Tsuneda S. Real-time quantitative LAMP （loop-mediated isothermal amplification of DNA） as a simple method for monitoring ammonia-oxidizing bacteria[J]. Journal of Biotechnology，2006，125（4）：484-491.

[12]張毅，王愛華，王貴春.EMA-LAMP方法快速檢測食源性副溶血弧菌活細(xì)胞[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（10）：290-292.

[13]Cai T，Lou G Q，Yang J，et al. Development and evaluation of real-time loop-mediated isothermal amplification for hepatitis B virus DNA quantification：a new tool for HBV management[J]. Journal of Clinical Virology，2008，41（4）：270-276.

[14]張毅，胡定金，付云潔，等. PMA-LAMP法對克氏螯蝦樣品中沙門氏菌的快速檢測[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，52（23）：5854-5857.

[15]Ikadai H，Tanaka H，Shibahara N，et al. Molecular evidence of infections with Babesia gibsoni parasites in Japan and evaluation of the diagnostic potential of a loop-mediated isothermal amplification method[J]. Journal of Clinical Microbiology，2004，42（6）：2465-2469.

[16]劉宇卓，韓凱凱，李銀，等. 雞傳染性支氣管炎病毒RT-LAMP檢測方法的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（4）：818-821.

[17]Hirayama H，Kageyama S，Moriyasu S，et al. Rapid sexing of bovine preimplantation embryos using loop-mediated isothermal amplification[J]. Theriogenology，2004，62（5）：887-896.

[18]張雪寒，何孔旺，葉青，等. 快速檢測志賀毒素2基因的LAMP方法的建立[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2013，29（2）：455-457.