摘要：將22頭35日齡健康長白仔豬分為試驗組和空白對照組，試驗組20頭，空白對照組2頭。按免疫時間和免疫劑量設計不同的免疫程序并免疫試驗組仔豬。采集免疫前和首次免疫1個月后試驗仔豬前腔靜脈血液制備血清，采用豬偽狂犬病膠乳凝集試劑盒檢測各試驗豬豬偽狂犬病毒抗體效價，比較不同免疫程序對豬偽狂犬病毒抗體效價的影響。結果表明，試驗仔豬免疫前后豬偽狂犬病毒抗體效價差異極顯著（P<0.01），免疫后偽狂犬病毒抗體效價在試驗仔豬各個體間差異極顯著（P<0.01）；免疫劑量組A1與A2、A3差異顯著（P<0.05）；免疫時間組B1與B2、B3差異顯著（P<0.05）；采用非配對雙樣本均值分析，試驗組與空白對照組的抗體效價差異極顯著（P<0.01）。

關鍵詞：免疫程序；豬偽狂犬病毒；抗體效價；影響；分析

中圖分類號： S858.285.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0209-02

收稿日期：2013-12-24

作者簡介：楊加瓊（1970—），女，四川犍為人，副教授，研究方向為畜牧獸醫(yī)和水產。E-mail：yjq5360409@163.com。豬偽狂犬病是由豬偽狂犬病毒引起的豬及其他家畜和野生動物的一種傳染病，以發(fā)熱、奇癢（豬除外）及腦脊髓炎為其主要特征，豬是該病毒的貯存畜主和傳染源[1]。中國自20世紀70年代發(fā)現該病以來，已擴至全國三十多個省市的豬場，其感染引起的母豬流產、弱胎、死胎等對養(yǎng)豬業(yè)造成嚴重的經濟損失[2]。接種疫苗是該病的主要防控措施，但疫苗的安全性及該病毒極易與其野生型毒株重組導致疫苗效果不佳多有報道[3]；豬場對經濟效益的考慮以及該病毒對母豬繁殖率及仔豬存活率的影響，為該病的高免血清提供了市場空間。各種豬偽狂犬病疫苗的科學使用相關學者已有研究[4]，但針對制備該病的高免血清免疫程序及相關研究報道甚少[5]，本研究通過查閱資料及參照臨床經驗，設計系列免疫程序，探討其制備豬偽狂犬病高免血清的科學免疫程序，為研制豬偽狂犬病高免血清提供技術支持，也為臨床防控該病進行免疫提供借鑒。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1主要儀器和設備高壓滅菌鍋；恒溫培養(yǎng)箱；4 ℃冰箱；超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司產品）；96孔V型血凝板；離心機；10 mL一次性注射器；微量移液器等。

1.1.2主要藥品和試劑豬偽狂犬病活疫苗，湖南亞華種業(yè)股份有限公司生物制藥廠生產；豬偽狂犬病活疫苗稀釋液，湖南亞華種業(yè)股份有限公司生物制藥廠生產；偽狂犬病乳膠凝集試驗試劑盒，武漢科前動物生物制品責任有限公司生產。

1.1.3豬偽狂犬病待檢血清樣品22頭試驗仔豬按照免疫程序免疫豬偽狂犬病毒疫苗后所制備的22份待檢血清樣品及免疫前所制備的22份血清樣品，共44份待檢血清樣品。

1.2試驗豬場及試驗動物

試驗豬場為眉山市東坡區(qū)一個體養(yǎng)豬場；試驗動物為該養(yǎng)豬場飼養(yǎng)的2窩22頭（其中，一窩12頭，另一窩10頭）35日齡斷乳閹割的長白仔豬，且母豬和仔豬均未免疫過豬偽狂犬病毒疫苗。

1.3試驗時間

20012年12月10日至2013年2月10日。

1.4試驗方法

1.4.1試驗分組及免疫參考查閱的資料，將22頭試驗仔豬分為試驗組和對照組，試驗組20頭，包括免疫時間和免疫劑量2個大組?？瞻讓φ战M仔豬2頭。根據試驗分組及設計的免疫程序，采用頸部肌肉注射途徑免疫各組試驗仔豬。具體分組及免疫程序見表1。

表1試驗分組及免疫程序的設計

組別處理試驗

頭數免疫程序（頭份）首免二免三免四免 免疫劑量A14112A23221A33310免疫時間B141 2B2312B3312對照組2注：首免與二免、二免與三免、三免與四免間隔時間均為1周。

1.4.2血樣的采集及血清制備采取前腔靜脈采血法。對所有試驗仔豬于免疫前及免疫結束后按1頭5 mL用10 mL規(guī)格一次注射器采集血液，其中，免疫前直接采集，免疫后按免疫程序免疫結束后1周時從前腔靜脈采集血液。于4 ℃冰箱自然沉析，取上清液，低速離心，用移液管吸取上清液置15 mL離心管中，貼標簽編號，制備出免疫前及免疫后各試驗仔豬的待檢血清樣品，-20 ℃冷藏備用。

1.4.3免疫前及免疫結束后試驗仔豬偽狂犬病毒抗體效價的測定采用豬偽狂犬病膠乳凝集試驗試劑盒對免疫前及免疫后各試驗仔豬的44份血清樣品進行豬偽狂犬病毒血清效價的檢測。根據試劑盒說明書，先將制備的被測血清樣品在微量反應板上用稀釋液作2倍系列稀釋，各取1滴（約20 μL）依次滴加于玻片上，同時設陰性血清和陽性血清對照，隨后各加膠乳抗原1滴，混勻，攪拌并搖動1～2 min，在3～5 min內觀察。達到陽性凝集反應的血清最高稀釋倍數，即為血清的抗體效價。陽性對照：將陽性血清進行2倍系列稀釋，取20 μL與等量膠乳抗原進行膠乳凝集試驗，膠乳抗原與1 ∶64稀釋的陽性血清應出現“++”凝集反應。陰性對照：陰性血清加抗原后，應不發(fā)生凝集反應。

2結果

2.1免疫前及免疫后各試驗仔豬豬偽狂犬病毒抗體效價

對采集的免疫前及免疫后各44份待檢血清樣品用豬偽狂犬病膠乳凝集試劑盒進行檢測，測得各試驗仔豬免疫前后的豬偽狂犬病毒血清抗體效價（表2）。結果表明，試驗前各仔豬均未檢測出抗體效價，個體間差異不顯著；免疫后，試驗個體間豬偽狂犬病毒抗體效價差異極顯著（P<0.01）；免疫前與免疫后相比，抗體效價差異極顯著（P<0.01）。

2.2豬偽狂犬病不同免疫劑量抗體效價的差異性

免疫劑量組A1與A2、A3差異顯著（P<0.05），A2與A3組差異不顯著，且A1組的抗體效價最高。

2.3豬偽狂犬病不同免疫時間抗體效價的差異性

免疫時間組B1與B2、B3差異顯著（P<0.05），B2與B3組差異不顯著，且B2、B3組抗體效價較高。

2.4對照組和試驗組豬偽狂犬病抗體效價的差異性

采用非配對雙樣本均值分析，試驗組與對照組仔豬的抗體效價差異極顯著（P<0.01）。試驗組豬偽狂犬病毒的抗體效價明顯高于未免疫的對照組。

3討論

供試仔豬因母豬和仔豬均未注射過豬偽狂犬疫苗，且最近并未發(fā)生過豬偽狂犬病，在檢測中也未檢測出豬偽狂犬病毒抗體效價，表明供試豬無母源抗體影響，適用于本試驗要求；在免疫后，除對照組外，其余試驗豬抗體效價均有不同程度的升高，表明所作免疫是成功的。

在免疫劑量3個處理組中，A1組的4頭試驗仔豬的抗體效價均達到了1 ∶64以上的水平，表現出了較高的抗體水平，而A2、A3組的試驗豬抗體效價雖比免疫前有了較大提高，但與A1組相比至少低1個梯度。因A1組試驗豬在最后一次免疫時劑量加倍，且在1周后就采血，是否說明經多次免疫后，在最后一次免疫加大劑量對抗體效價提升有很大影響將進一步驗證。

在免疫時間組的3個處理中，B2、B3組的試驗豬抗體水平均較B1組高，說明本次試驗B2、B3組的免疫程序效果較好。

試驗仔豬在免疫后與免疫前，無論是免疫劑量組還是免疫時間組其豬偽狂犬病毒的抗體水平差異極顯著，但是免疫劑量組抗體平均水平與免疫時間組抗體水平相比，免疫劑量組抗體水平明顯高于免疫時間組的平均水平。因免疫劑量組做了3次免疫，而免疫時間組只做了2次免疫，這是否說明免疫次數增多會提高抗體效價，或者制作高免血清至少要進行多少次免疫才行，對豬偽狂犬高免血清的制作是一個很好的思考，這方面有待進一步驗證。但至少說明，仔豬只進行1次免疫，其效果很不理想，平均抗體效價水平較低，起不到保護作用，所以必須進行加強免疫，達到免疫保護目的。

由于免疫時間組和免疫劑量組的試驗是分開來做的，而且是不同窩的仔豬，并不能很明確地說明本次試驗的最佳免疫劑量程序和最佳免疫時間程序的簡單疊加就是最好的免疫程序，但為以后的相關研究提供了一個很好的基礎。

豬偽狂犬疫苗有弱毒苗、滅活苗、基因缺失疫苗、亞單位疫苗等多種類型，而本次試驗采用的是豬偽狂犬病活疫苗，究竟哪種類型的疫苗進行免疫后能得到更高的抗體水平，本試驗沒有研究，但這也是制作高免血清和提升臨床免疫抗體效價的一個重要影響因素。由于本次采用的是豬偽狂犬病毒膠乳凝集試驗檢測試劑盒進行抗體檢測，判定結果時不一定十分精確，而且究竟什么樣的抗體水平才達到了高免血清的用血要求，并沒有具體參考文獻，只是表明本次試驗的部分試驗豬抗體效價較高，有待采用ELISA檢測方法檢測，并參考相關資料文獻和具體試驗，判定是否為合格的臨床使用高免血清。

參考文獻：

[1]蔡寶祥. 家畜傳染病學[M]. 4版.北京：中國農業(yè)出版社，2001：207-209.

[2]趙東升，劉有昌，安福生. 近年來我國豬偽狂犬病的流行狀況和分析[J]. 今日養(yǎng)豬業(yè)，2008（6）：26-28.

[3]蘆惟本，黃川. 進口偽狂犬弱毒疫苗引發(fā)偽狂犬病流行的報道[J]. 今日養(yǎng)豬業(yè)，2009（4）：15-16.

[4]曾智勇，湯德元，郭萬柱. 偽狂犬病疫苗的研究[J]. 世界農業(yè)，2007（10）：66-69.

[5]孔令達，符芳，于輝，等. 豬偽狂犬病高免血清的制作與初步應用[J]. 中國預防獸醫(yī)學報，2004，26（5）：359-362.

2.3豬偽狂犬病不同免疫時間抗體效價的差異性

免疫時間組B1與B2、B3差異顯著（P<0.05），B2與B3組差異不顯著，且B2、B3組抗體效價較高。

2.4對照組和試驗組豬偽狂犬病抗體效價的差異性

采用非配對雙樣本均值分析，試驗組與對照組仔豬的抗體效價差異極顯著（P<0.01）。試驗組豬偽狂犬病毒的抗體效價明顯高于未免疫的對照組。

3討論

供試仔豬因母豬和仔豬均未注射過豬偽狂犬疫苗，且最近并未發(fā)生過豬偽狂犬病，在檢測中也未檢測出豬偽狂犬病毒抗體效價，表明供試豬無母源抗體影響，適用于本試驗要求；在免疫后，除對照組外，其余試驗豬抗體效價均有不同程度的升高，表明所作免疫是成功的。

在免疫劑量3個處理組中，A1組的4頭試驗仔豬的抗體效價均達到了1 ∶64以上的水平，表現出了較高的抗體水平，而A2、A3組的試驗豬抗體效價雖比免疫前有了較大提高，但與A1組相比至少低1個梯度。因A1組試驗豬在最后一次免疫時劑量加倍，且在1周后就采血，是否說明經多次免疫后，在最后一次免疫加大劑量對抗體效價提升有很大影響將進一步驗證。

在免疫時間組的3個處理中，B2、B3組的試驗豬抗體水平均較B1組高，說明本次試驗B2、B3組的免疫程序效果較好。

試驗仔豬在免疫后與免疫前，無論是免疫劑量組還是免疫時間組其豬偽狂犬病毒的抗體水平差異極顯著，但是免疫劑量組抗體平均水平與免疫時間組抗體水平相比，免疫劑量組抗體水平明顯高于免疫時間組的平均水平。因免疫劑量組做了3次免疫，而免疫時間組只做了2次免疫，這是否說明免疫次數增多會提高抗體效價，或者制作高免血清至少要進行多少次免疫才行，對豬偽狂犬高免血清的制作是一個很好的思考，這方面有待進一步驗證。但至少說明，仔豬只進行1次免疫，其效果很不理想，平均抗體效價水平較低，起不到保護作用，所以必須進行加強免疫，達到免疫保護目的。

由于免疫時間組和免疫劑量組的試驗是分開來做的，而且是不同窩的仔豬，并不能很明確地說明本次試驗的最佳免疫劑量程序和最佳免疫時間程序的簡單疊加就是最好的免疫程序，但為以后的相關研究提供了一個很好的基礎。

豬偽狂犬疫苗有弱毒苗、滅活苗、基因缺失疫苗、亞單位疫苗等多種類型，而本次試驗采用的是豬偽狂犬病活疫苗，究竟哪種類型的疫苗進行免疫后能得到更高的抗體水平，本試驗沒有研究，但這也是制作高免血清和提升臨床免疫抗體效價的一個重要影響因素。由于本次采用的是豬偽狂犬病毒膠乳凝集試驗檢測試劑盒進行抗體檢測，判定結果時不一定十分精確，而且究竟什么樣的抗體水平才達到了高免血清的用血要求，并沒有具體參考文獻，只是表明本次試驗的部分試驗豬抗體效價較高，有待采用ELISA檢測方法檢測，并參考相關資料文獻和具體試驗，判定是否為合格的臨床使用高免血清。

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[5]孔令達，符芳，于輝，等. 豬偽狂犬病高免血清的制作與初步應用[J]. 中國預防獸醫(yī)學報，2004，26（5）：359-362.

2.3豬偽狂犬病不同免疫時間抗體效價的差異性

免疫時間組B1與B2、B3差異顯著（P<0.05），B2與B3組差異不顯著，且B2、B3組抗體效價較高。

2.4對照組和試驗組豬偽狂犬病抗體效價的差異性

采用非配對雙樣本均值分析，試驗組與對照組仔豬的抗體效價差異極顯著（P<0.01）。試驗組豬偽狂犬病毒的抗體效價明顯高于未免疫的對照組。

3討論

供試仔豬因母豬和仔豬均未注射過豬偽狂犬疫苗，且最近并未發(fā)生過豬偽狂犬病，在檢測中也未檢測出豬偽狂犬病毒抗體效價，表明供試豬無母源抗體影響，適用于本試驗要求；在免疫后，除對照組外，其余試驗豬抗體效價均有不同程度的升高，表明所作免疫是成功的。

在免疫劑量3個處理組中，A1組的4頭試驗仔豬的抗體效價均達到了1 ∶64以上的水平，表現出了較高的抗體水平，而A2、A3組的試驗豬抗體效價雖比免疫前有了較大提高，但與A1組相比至少低1個梯度。因A1組試驗豬在最后一次免疫時劑量加倍，且在1周后就采血，是否說明經多次免疫后，在最后一次免疫加大劑量對抗體效價提升有很大影響將進一步驗證。

在免疫時間組的3個處理中，B2、B3組的試驗豬抗體水平均較B1組高，說明本次試驗B2、B3組的免疫程序效果較好。

試驗仔豬在免疫后與免疫前，無論是免疫劑量組還是免疫時間組其豬偽狂犬病毒的抗體水平差異極顯著，但是免疫劑量組抗體平均水平與免疫時間組抗體水平相比，免疫劑量組抗體水平明顯高于免疫時間組的平均水平。因免疫劑量組做了3次免疫，而免疫時間組只做了2次免疫，這是否說明免疫次數增多會提高抗體效價，或者制作高免血清至少要進行多少次免疫才行，對豬偽狂犬高免血清的制作是一個很好的思考，這方面有待進一步驗證。但至少說明，仔豬只進行1次免疫，其效果很不理想，平均抗體效價水平較低，起不到保護作用，所以必須進行加強免疫，達到免疫保護目的。

由于免疫時間組和免疫劑量組的試驗是分開來做的，而且是不同窩的仔豬，并不能很明確地說明本次試驗的最佳免疫劑量程序和最佳免疫時間程序的簡單疊加就是最好的免疫程序，但為以后的相關研究提供了一個很好的基礎。

豬偽狂犬疫苗有弱毒苗、滅活苗、基因缺失疫苗、亞單位疫苗等多種類型，而本次試驗采用的是豬偽狂犬病活疫苗，究竟哪種類型的疫苗進行免疫后能得到更高的抗體水平，本試驗沒有研究，但這也是制作高免血清和提升臨床免疫抗體效價的一個重要影響因素。由于本次采用的是豬偽狂犬病毒膠乳凝集試驗檢測試劑盒進行抗體檢測，判定結果時不一定十分精確，而且究竟什么樣的抗體水平才達到了高免血清的用血要求，并沒有具體參考文獻，只是表明本次試驗的部分試驗豬抗體效價較高，有待采用ELISA檢測方法檢測，并參考相關資料文獻和具體試驗，判定是否為合格的臨床使用高免血清。

參考文獻：

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[4]曾智勇，湯德元，郭萬柱. 偽狂犬病疫苗的研究[J]. 世界農業(yè)，2007（10）：66-69.

[5]孔令達，符芳，于輝，等. 豬偽狂犬病高免血清的制作與初步應用[J]. 中國預防獸醫(yī)學報，2004，26（5）：359-362.