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        雞α干擾素在巴斯德畢赤酵母中的分泌表達(dá)及抗病毒功能初探

        2014-11-22 12:18:43韋琴等
        江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年10期
        關(guān)鍵詞:免疫原性干擾素

        韋琴等

        摘要:為了研究雞α干擾素(ChIFNα)基因的特性和功能,將雞α干擾素的DNA序列克隆到巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)分泌表達(dá)載體pPIC9K中,并轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母GS115菌株,用PCR技術(shù)鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。重組菌株GS115/pPIC9K-IFNα用1%甲醇誘導(dǎo)后,分泌表達(dá)重組蛋白,斑點(diǎn)雜交(dot-blot)檢測(cè)IFNα具有免疫原性。細(xì)胞病變抑制法表明,表達(dá)產(chǎn)物有明顯的抗雞H9N2亞型禽流感病毒活性。

        關(guān)鍵詞:雞α干擾素;巴斯德畢赤酵母;免疫原性;細(xì)胞病變抑制法

        中圖分類號(hào): S852.65+7文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A文章編號(hào):1002-1302(2014)10-0049-03

        收稿日期:2013-12-24

        作者簡(jiǎn)介:韋琴(1981—),女,湖北天門人,碩士,講師,主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)方向的研究。E-mail:53471348@qq.com。干擾素(interferon,IFN)是一類具有廣譜抗病毒活性的細(xì)胞因子,能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)[1]。α干擾素是由能在脊椎動(dòng)物各種類型的細(xì)胞中增殖的病毒誘導(dǎo)白細(xì)胞產(chǎn)生的[2],其主要活性是抗病毒。Sekellick等于1994年克隆表達(dá)了雞的α干擾素 (ChIFNα)基因[3],其后的文獻(xiàn)也報(bào)道了紅色原雞中命名為IFNA1、IFNA2和IFNA3的干擾素基因序列[4-5]。到目前為止,已知ChIFNα的抗病毒能力較強(qiáng),比ChIFNβ強(qiáng)20倍左右。對(duì)于巴斯德畢赤酵母(Pichia pastoris)的研究起始于1970年左右。巴斯德畢赤酵母是甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母中的一類能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源,大量合成外源蛋白質(zhì)的酵母菌,因此,該酵母引起了人們的興趣和關(guān)注,得到了廣泛的研究和應(yīng)用。目前有關(guān)細(xì)胞因子在巴斯德畢赤酵母中獲得表達(dá)的報(bào)道屢見(jiàn)不鮮[6-9]。

        我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)經(jīng)過(guò)近30年的持續(xù)穩(wěn)步增長(zhǎng),已成為世界上最大的養(yǎng)禽國(guó)之一。禽病大規(guī)模暴發(fā)會(huì)給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失,因此,利用干擾素基因結(jié)合基因工程手段生產(chǎn)生物制劑,來(lái)預(yù)防和治療禽類的各種病毒傳染病具有重要意義。本研究以質(zhì)粒pPIC9K為骨架,成功構(gòu)建了巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-IFNα,在巴斯德畢赤酵母菌GS115中獲得了分泌表達(dá)的重組干擾素,并進(jìn)一步探討了其抗病毒活性。

        1材料與方法

        1.1材料

        1.1.1質(zhì)粒和菌株pET28a-IFNα質(zhì)粒:大小約489 bp的去信號(hào)肽ChIFNα基因序列,由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[10]。酵母表達(dá)載體及酵母受體菌GS115購(gòu)自Invitrogen公司。

        1.1.2試劑和培養(yǎng)基常用工具酶、DNA marker均購(gòu)自TaKaRa公司;酵母氨基(yeast nitrogen base withour amino acids,YNB)、生物素購(gòu)自Pifco公司。

        1.1.3血清和酶標(biāo)抗體辣根過(guò)氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購(gòu)自華美公司;兔抗雞α干擾素多抗由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備和提供。

        1.1.4雞胚和病毒雞H9N2亞型禽流感病毒由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供,SPF(specific pathogen free)雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)中心。

        1.2重組質(zhì)粒pPIC9K-IFNα的構(gòu)建

        pET28a-IFNα經(jīng)EcoRⅠ與NotⅠ雙酶切,用T4 DNA連接酶將回收產(chǎn)物IFNα基因片斷與經(jīng)相同酶切的pPIC9K質(zhì)粒連接,并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,平板涂布后挑取單菌落。提取的重組質(zhì)粒pPIC9K-IFNα由酶切鑒定。

        1.3重組質(zhì)粒pPIC9K-IFNα的轉(zhuǎn)化及鑒定

        1.3.1pPIC9K-IFNα的轉(zhuǎn)化將提純的pPIC9K-IFNα質(zhì)粒用SalⅠ酶切線性化,電泳回收后置于-20 ℃?zhèn)溆?。?0.1 mol/L 的LiCl制備GS115酵母感受態(tài)。將線性化的表達(dá)質(zhì)粒在LiCl、50% PEG與2 mg/mL ssDNA的輔助下轉(zhuǎn)化至GS115酵母感受態(tài)細(xì)胞中,涂布于MD(minimal dextrose)固體平皿上,置28 ℃溫箱培養(yǎng)3~4 d。

        1.5重組雞α干擾素抗病毒活性的初步檢測(cè)

        用細(xì)胞病變抑制法探討重組干擾素抗病毒的能力[12-16]:雞胚成纖維細(xì)胞于96孔滅菌細(xì)胞培養(yǎng)板中,飽和二氧化碳水汽培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng),長(zhǎng)成單層。每列各100 μL/孔加入10倍系列稀釋的干擾素表達(dá)產(chǎn)物,同時(shí)設(shè)細(xì)胞空白對(duì)照(只加維持液,不加病毒和干擾素)和病毒對(duì)照(只加病毒,不加干擾素);1 d后,每孔加入稀釋的H9N2禽流感病毒(100倍TCID50溶液濃度)。1 d后,開(kāi)始觀察細(xì)胞病變。

        2結(jié)果與分析

        2.1重組質(zhì)粒pPIC9K-IFNα的構(gòu)建

        回收產(chǎn)物IFNα基因片段與pPIC9K載體連接后,轉(zhuǎn)化DH5α,挑白色菌落,小量提取重組質(zhì)粒,用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶消化,得到500 bp的小片段和9 kb的大片段,2個(gè)條帶與預(yù)期結(jié)果一致(圖1)。表明目的片段已成功克隆到載體中,命名為pPIC9K-IFNα。

        2.2重組酵母染色體陽(yáng)性克隆子pPIC9K-IFNα的PCR鑒定

        隨機(jī)挑取在MD平皿中的GS115/pPIC9K-IFNα酵母單菌落,經(jīng)酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基(yeast extract peptone dextrose,YPD)培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,提取酵母DNA作為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。分別以2對(duì)引物作2組PCR鑒定(圖2)。結(jié)果表明,2對(duì)引物均擴(kuò)增出1條特異性很高的目的片段,長(zhǎng)度分別是500 bp和695 bp,與預(yù)期片段大小相符,表明重組質(zhì)粒pPIC9K-IFNα已成功整合到GS115 菌株染色體中。

        2.3重組酵母菌的表達(dá)和dot-blot分析

        經(jīng)dot-blot分析確證,重組酵母菌誘導(dǎo)表達(dá)的上清液檢測(cè)出顏色較深的斑點(diǎn),而空白菌沒(méi)有(圖3)。結(jié)果表明,GS115/pPIC9KIFNα表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性。

        2.4重組雞α干擾素表達(dá)產(chǎn)物抗病毒活性初步檢測(cè)

        在雞胚成纖維細(xì)胞上分析重組干擾素表達(dá)產(chǎn)物抗病毒的能力。結(jié)果顯示,空白對(duì)照孔細(xì)胞生長(zhǎng)良好,陽(yáng)性對(duì)照孔細(xì)胞皺褶,病變嚴(yán)重(90%病變);加入102、103、104倍稀釋后的表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞孔中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)與空白對(duì)照孔一致,基本無(wú)病變;表達(dá)產(chǎn)物105倍稀釋后,所加的細(xì)胞孔中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)仍然良好,有15%的病變,表明105倍稀釋后的干擾素依然有抗病毒的活性;106倍稀釋后所加的細(xì)胞孔中細(xì)胞有40%病變,107、108倍稀釋后所加的細(xì)胞孔中細(xì)胞發(fā)生90%的病變(圖4)。以上結(jié)果表明重組雞α干擾素能夠抑制H9N2禽流感病毒的復(fù)制。

        3討論與結(jié)論

        巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近十年發(fā)展起來(lái)的具有高效分泌表達(dá)的一種真核表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)能進(jìn)行真核轉(zhuǎn)錄后修飾,如糖基化、二硫鍵的形成和蛋白水解處理,在表達(dá)產(chǎn)物的加工、外分泌等方面優(yōu)勢(shì)明顯[17]。本研究選用的載體pPIC9K是一種分泌表達(dá)載體,不僅能夠?qū)崿F(xiàn)翻譯后糖基化修飾和正確折疊,而且有利于表達(dá)產(chǎn)物的純化。

        在本試驗(yàn)中,重組菌GS115/pPIC9K-IFNα的誘導(dǎo)上清經(jīng)dot-blot分析,發(fā)現(xiàn)其能分泌表達(dá)出IFNα,證實(shí)重組蛋白IFNα分泌到巴斯德畢赤酵母細(xì)胞外,且有一定的抗雞H9N2亞型禽流感病毒的活性。本試驗(yàn)為重組雞干擾素作為疫苗佐劑的研究和推廣應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

        參考文獻(xiàn):

        [1]Janeway C A,Traver P,Walport M,et al. Immunobiology[M]. New York:Garland Publishing,2004:81-90.

        [2]陸承平. 獸醫(yī)微生物學(xué)[M]. 3版. 北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2001:452.

        [3]Sekellick M J,F(xiàn)errandino A F,Hopkins D A,et al. Chicken interferon gene:cloning,expression,and analysis[J]. Journal of Interferon Research,1994,14(2):71-79.

        [4]Ben-Nun A,Mendel I,Bakimer R,et al. The autoimmune reactivity to myelin oligodendrocyte glycoprotein (MOG) in multiple sclerosis is potentially pathogenic:effect of copolymer 1 on MOGinduced disease[J]. Journal of Neurology,1996,243(1):14-22.

        [5]Hohlfeld R. Biotechnological agents for the immunotherapy of multiple sclerosis:Principles,problems and perspectives[J]. Brain:a Journal of Neurology,1997,120(Pt 5):865-916.

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        [10]韋琴,彭貴青,金梅林,等. 雞α干擾素基因的克隆、原核表達(dá)及抗病毒效果研究[J]. 生物工程學(xué)報(bào),2006,22(5):737-743.

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        [12]孫為民,王惠琴. 細(xì)胞因子研究方法學(xué)[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社,1999:433-458.

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        [14]Armstrong J A. Semi-micro,dye-binding assay for rabbit interferon[J]. Applied Microbiology,1971,21(4):723-725.

        [15]Green J A,Stanton G J,Goode J,et al. Vesicular stomatitis virus plaque production in monolayer cultures with liquid overlay medium:description and adaptation to a one-day,human interferon-plaque[J]. Journal of Clinical Microbiology,1976,4(6):479-485.

        [16]費(fèi)崢崢,關(guān)怡新,姚善涇. 重組人γ干擾素復(fù)性過(guò)程中體外活性檢測(cè)方法研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2004,31(3):65-69.

        [17]Cereghino J L,Cregg J M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J]. FEMS Microbiology Reviews,2000,24(1):45-66.

        2.3重組酵母菌的表達(dá)和dot-blot分析

        經(jīng)dot-blot分析確證,重組酵母菌誘導(dǎo)表達(dá)的上清液檢測(cè)出顏色較深的斑點(diǎn),而空白菌沒(méi)有(圖3)。結(jié)果表明,GS115/pPIC9KIFNα表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性。

        2.4重組雞α干擾素表達(dá)產(chǎn)物抗病毒活性初步檢測(cè)

        在雞胚成纖維細(xì)胞上分析重組干擾素表達(dá)產(chǎn)物抗病毒的能力。結(jié)果顯示,空白對(duì)照孔細(xì)胞生長(zhǎng)良好,陽(yáng)性對(duì)照孔細(xì)胞皺褶,病變嚴(yán)重(90%病變);加入102、103、104倍稀釋后的表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞孔中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)與空白對(duì)照孔一致,基本無(wú)病變;表達(dá)產(chǎn)物105倍稀釋后,所加的細(xì)胞孔中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)仍然良好,有15%的病變,表明105倍稀釋后的干擾素依然有抗病毒的活性;106倍稀釋后所加的細(xì)胞孔中細(xì)胞有40%病變,107、108倍稀釋后所加的細(xì)胞孔中細(xì)胞發(fā)生90%的病變(圖4)。以上結(jié)果表明重組雞α干擾素能夠抑制H9N2禽流感病毒的復(fù)制。

        3討論與結(jié)論

        巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近十年發(fā)展起來(lái)的具有高效分泌表達(dá)的一種真核表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)能進(jìn)行真核轉(zhuǎn)錄后修飾,如糖基化、二硫鍵的形成和蛋白水解處理,在表達(dá)產(chǎn)物的加工、外分泌等方面優(yōu)勢(shì)明顯[17]。本研究選用的載體pPIC9K是一種分泌表達(dá)載體,不僅能夠?qū)崿F(xiàn)翻譯后糖基化修飾和正確折疊,而且有利于表達(dá)產(chǎn)物的純化。

        在本試驗(yàn)中,重組菌GS115/pPIC9K-IFNα的誘導(dǎo)上清經(jīng)dot-blot分析,發(fā)現(xiàn)其能分泌表達(dá)出IFNα,證實(shí)重組蛋白IFNα分泌到巴斯德畢赤酵母細(xì)胞外,且有一定的抗雞H9N2亞型禽流感病毒的活性。本試驗(yàn)為重組雞干擾素作為疫苗佐劑的研究和推廣應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

        參考文獻(xiàn):

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        [10]韋琴,彭貴青,金梅林,等. 雞α干擾素基因的克隆、原核表達(dá)及抗病毒效果研究[J]. 生物工程學(xué)報(bào),2006,22(5):737-743.

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        [12]孫為民,王惠琴. 細(xì)胞因子研究方法學(xué)[M]. 北京:人民衛(wèi)生出版社,1999:433-458.

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        [16]費(fèi)崢崢,關(guān)怡新,姚善涇. 重組人γ干擾素復(fù)性過(guò)程中體外活性檢測(cè)方法研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào),2004,31(3):65-69.

        [17]Cereghino J L,Cregg J M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J]. FEMS Microbiology Reviews,2000,24(1):45-66.

        2.3重組酵母菌的表達(dá)和dot-blot分析

        經(jīng)dot-blot分析確證,重組酵母菌誘導(dǎo)表達(dá)的上清液檢測(cè)出顏色較深的斑點(diǎn),而空白菌沒(méi)有(圖3)。結(jié)果表明,GS115/pPIC9KIFNα表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性。

        2.4重組雞α干擾素表達(dá)產(chǎn)物抗病毒活性初步檢測(cè)

        在雞胚成纖維細(xì)胞上分析重組干擾素表達(dá)產(chǎn)物抗病毒的能力。結(jié)果顯示,空白對(duì)照孔細(xì)胞生長(zhǎng)良好,陽(yáng)性對(duì)照孔細(xì)胞皺褶,病變嚴(yán)重(90%病變);加入102、103、104倍稀釋后的表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞孔中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)與空白對(duì)照孔一致,基本無(wú)病變;表達(dá)產(chǎn)物105倍稀釋后,所加的細(xì)胞孔中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)仍然良好,有15%的病變,表明105倍稀釋后的干擾素依然有抗病毒的活性;106倍稀釋后所加的細(xì)胞孔中細(xì)胞有40%病變,107、108倍稀釋后所加的細(xì)胞孔中細(xì)胞發(fā)生90%的病變(圖4)。以上結(jié)果表明重組雞α干擾素能夠抑制H9N2禽流感病毒的復(fù)制。

        3討論與結(jié)論

        巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近十年發(fā)展起來(lái)的具有高效分泌表達(dá)的一種真核表達(dá)系統(tǒng),該系統(tǒng)能進(jìn)行真核轉(zhuǎn)錄后修飾,如糖基化、二硫鍵的形成和蛋白水解處理,在表達(dá)產(chǎn)物的加工、外分泌等方面優(yōu)勢(shì)明顯[17]。本研究選用的載體pPIC9K是一種分泌表達(dá)載體,不僅能夠?qū)崿F(xiàn)翻譯后糖基化修飾和正確折疊,而且有利于表達(dá)產(chǎn)物的純化。

        在本試驗(yàn)中,重組菌GS115/pPIC9K-IFNα的誘導(dǎo)上清經(jīng)dot-blot分析,發(fā)現(xiàn)其能分泌表達(dá)出IFNα,證實(shí)重組蛋白IFNα分泌到巴斯德畢赤酵母細(xì)胞外,且有一定的抗雞H9N2亞型禽流感病毒的活性。本試驗(yàn)為重組雞干擾素作為疫苗佐劑的研究和推廣應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

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