韋琴等

摘要：為了研究雞α干擾素（ChIFNα）基因的特性和功能，將雞α干擾素的DNA序列克隆到巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）分泌表達(dá)載體pPIC9K中，并轉(zhuǎn)化入巴斯德畢赤酵母GS115菌株，用PCR技術(shù)鑒定陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。重組菌株GS115/pPIC9K-IFNα用1%甲醇誘導(dǎo)后，分泌表達(dá)重組蛋白，斑點(diǎn)雜交（dot-blot）檢測(cè)IFNα具有免疫原性。細(xì)胞病變抑制法表明，表達(dá)產(chǎn)物有明顯的抗雞H9N2亞型禽流感病毒活性。

關(guān)鍵詞：雞α干擾素；巴斯德畢赤酵母；免疫原性；細(xì)胞病變抑制法

中圖分類號(hào)： S852.65+7文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）10-0049-03

收稿日期：2013-12-24

作者簡(jiǎn)介：韋琴（1981—），女，湖北天門人，碩士，講師，主要從事生物化學(xué)與分子生物學(xué)方向的研究。E-mail：53471348@qq.com。干擾素（interferon，IFN）是一類具有廣譜抗病毒活性的細(xì)胞因子，能調(diào)節(jié)機(jī)體免疫反應(yīng)[1]。α干擾素是由能在脊椎動(dòng)物各種類型的細(xì)胞中增殖的病毒誘導(dǎo)白細(xì)胞產(chǎn)生的[2]，其主要活性是抗病毒。Sekellick等于1994年克隆表達(dá)了雞的α干擾素 （ChIFNα）基因[3]，其后的文獻(xiàn)也報(bào)道了紅色原雞中命名為IFNA1、IFNA2和IFNA3的干擾素基因序列[4-5]。到目前為止，已知ChIFNα的抗病毒能力較強(qiáng)，比ChIFNβ強(qiáng)20倍左右。對(duì)于巴斯德畢赤酵母（Pichia pastoris）的研究起始于1970年左右。巴斯德畢赤酵母是甲醇營(yíng)養(yǎng)型酵母中的一類能夠利用甲醇作為唯一碳源和能源，大量合成外源蛋白質(zhì)的酵母菌，因此，該酵母引起了人們的興趣和關(guān)注，得到了廣泛的研究和應(yīng)用。目前有關(guān)細(xì)胞因子在巴斯德畢赤酵母中獲得表達(dá)的報(bào)道屢見(jiàn)不鮮[6-9]。

我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)經(jīng)過(guò)近30年的持續(xù)穩(wěn)步增長(zhǎng)，已成為世界上最大的養(yǎng)禽國(guó)之一。禽病大規(guī)模暴發(fā)會(huì)給我國(guó)養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失，因此，利用干擾素基因結(jié)合基因工程手段生產(chǎn)生物制劑，來(lái)預(yù)防和治療禽類的各種病毒傳染病具有重要意義。本研究以質(zhì)粒pPIC9K為骨架，成功構(gòu)建了巴斯德畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9K-IFNα，在巴斯德畢赤酵母菌GS115中獲得了分泌表達(dá)的重組干擾素，并進(jìn)一步探討了其抗病毒活性。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1質(zhì)粒和菌株pET28a-IFNα質(zhì)粒：大小約489 bp的去信號(hào)肽ChIFNα基因序列，由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[10]。酵母表達(dá)載體及酵母受體菌GS115購(gòu)自Invitrogen公司。

1.1.2試劑和培養(yǎng)基常用工具酶、DNA marker均購(gòu)自TaKaRa公司；酵母氨基（yeast nitrogen base withour amino acids，YNB）、生物素購(gòu)自Pifco公司。

1.1.3血清和酶標(biāo)抗體辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購(gòu)自華美公司；兔抗雞α干擾素多抗由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備和提供。

1.1.4雞胚和病毒雞H9N2亞型禽流感病毒由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，SPF（specific pathogen free）雞胚購(gòu)自北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)中心。

1.2重組質(zhì)粒pPIC9K-IFNα的構(gòu)建

pET28a-IFNα經(jīng)EcoRⅠ與NotⅠ雙酶切，用T4 DNA連接酶將回收產(chǎn)物IFNα基因片斷與經(jīng)相同酶切的pPIC9K質(zhì)粒連接，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，平板涂布后挑取單菌落。提取的重組質(zhì)粒pPIC9K-IFNα由酶切鑒定。

1.3重組質(zhì)粒pPIC9K-IFNα的轉(zhuǎn)化及鑒定

1.3.1pPIC9K-IFNα的轉(zhuǎn)化將提純的pPIC9K-IFNα質(zhì)粒用SalⅠ酶切線性化，電泳回收后置于-20 ℃?zhèn)溆?。?0.1 mol/L 的LiCl制備GS115酵母感受態(tài)。將線性化的表達(dá)質(zhì)粒在LiCl、50% PEG與2 mg/mL ssDNA的輔助下轉(zhuǎn)化至GS115酵母感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于MD（minimal dextrose）固體平皿上，置28 ℃溫箱培養(yǎng)3～4 d。

1.5重組雞α干擾素抗病毒活性的初步檢測(cè)

用細(xì)胞病變抑制法探討重組干擾素抗病毒的能力[12-16]：雞胚成纖維細(xì)胞于96孔滅菌細(xì)胞培養(yǎng)板中，飽和二氧化碳水汽培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)，長(zhǎng)成單層。每列各100 μL/孔加入10倍系列稀釋的干擾素表達(dá)產(chǎn)物，同時(shí)設(shè)細(xì)胞空白對(duì)照（只加維持液，不加病毒和干擾素）和病毒對(duì)照（只加病毒，不加干擾素）；1 d后，每孔加入稀釋的H9N2禽流感病毒（100倍TCID50溶液濃度）。1 d后，開(kāi)始觀察細(xì)胞病變。

2結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒pPIC9K-IFNα的構(gòu)建

回收產(chǎn)物IFNα基因片段與pPIC9K載體連接后，轉(zhuǎn)化DH5α，挑白色菌落，小量提取重組質(zhì)粒，用EcoRⅠ和NotⅠ雙酶消化，得到500 bp的小片段和9 kb的大片段，2個(gè)條帶與預(yù)期結(jié)果一致（圖1）。表明目的片段已成功克隆到載體中，命名為pPIC9K-IFNα。

2.2重組酵母染色體陽(yáng)性克隆子pPIC9K-IFNα的PCR鑒定

隨機(jī)挑取在MD平皿中的GS115/pPIC9K-IFNα酵母單菌落，經(jīng)酵母浸出粉胨葡萄糖培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YPD）培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，提取酵母DNA作為模板進(jìn)行PCR檢測(cè)。分別以2對(duì)引物作2組PCR鑒定（圖2）。結(jié)果表明，2對(duì)引物均擴(kuò)增出1條特異性很高的目的片段，長(zhǎng)度分別是500 bp和695 bp，與預(yù)期片段大小相符，表明重組質(zhì)粒pPIC9K-IFNα已成功整合到GS115 菌株染色體中。

2.3重組酵母菌的表達(dá)和dot-blot分析

經(jīng)dot-blot分析確證，重組酵母菌誘導(dǎo)表達(dá)的上清液檢測(cè)出顏色較深的斑點(diǎn)，而空白菌沒(méi)有（圖3）。結(jié)果表明，GS115/pPIC9KIFNα表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性。

2.4重組雞α干擾素表達(dá)產(chǎn)物抗病毒活性初步檢測(cè)

在雞胚成纖維細(xì)胞上分析重組干擾素表達(dá)產(chǎn)物抗病毒的能力。結(jié)果顯示，空白對(duì)照孔細(xì)胞生長(zhǎng)良好，陽(yáng)性對(duì)照孔細(xì)胞皺褶，病變嚴(yán)重（90%病變）；加入102、103、104倍稀釋后的表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞孔中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)與空白對(duì)照孔一致，基本無(wú)病變；表達(dá)產(chǎn)物105倍稀釋后，所加的細(xì)胞孔中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)仍然良好，有15%的病變，表明105倍稀釋后的干擾素依然有抗病毒的活性；106倍稀釋后所加的細(xì)胞孔中細(xì)胞有40%病變，107、108倍稀釋后所加的細(xì)胞孔中細(xì)胞發(fā)生90%的病變（圖4）。以上結(jié)果表明重組雞α干擾素能夠抑制H9N2禽流感病毒的復(fù)制。

3討論與結(jié)論

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近十年發(fā)展起來(lái)的具有高效分泌表達(dá)的一種真核表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能進(jìn)行真核轉(zhuǎn)錄后修飾，如糖基化、二硫鍵的形成和蛋白水解處理，在表達(dá)產(chǎn)物的加工、外分泌等方面優(yōu)勢(shì)明顯[17]。本研究選用的載體pPIC9K是一種分泌表達(dá)載體，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)翻譯后糖基化修飾和正確折疊，而且有利于表達(dá)產(chǎn)物的純化。

在本試驗(yàn)中，重組菌GS115/pPIC9K-IFNα的誘導(dǎo)上清經(jīng)dot-blot分析，發(fā)現(xiàn)其能分泌表達(dá)出IFNα，證實(shí)重組蛋白IFNα分泌到巴斯德畢赤酵母細(xì)胞外，且有一定的抗雞H9N2亞型禽流感病毒的活性。本試驗(yàn)為重組雞干擾素作為疫苗佐劑的研究和推廣應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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2.3重組酵母菌的表達(dá)和dot-blot分析

經(jīng)dot-blot分析確證，重組酵母菌誘導(dǎo)表達(dá)的上清液檢測(cè)出顏色較深的斑點(diǎn)，而空白菌沒(méi)有（圖3）。結(jié)果表明，GS115/pPIC9KIFNα表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性。

2.4重組雞α干擾素表達(dá)產(chǎn)物抗病毒活性初步檢測(cè)

在雞胚成纖維細(xì)胞上分析重組干擾素表達(dá)產(chǎn)物抗病毒的能力。結(jié)果顯示，空白對(duì)照孔細(xì)胞生長(zhǎng)良好，陽(yáng)性對(duì)照孔細(xì)胞皺褶，病變嚴(yán)重（90%病變）；加入102、103、104倍稀釋后的表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞孔中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)與空白對(duì)照孔一致，基本無(wú)病變；表達(dá)產(chǎn)物105倍稀釋后，所加的細(xì)胞孔中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)仍然良好，有15%的病變，表明105倍稀釋后的干擾素依然有抗病毒的活性；106倍稀釋后所加的細(xì)胞孔中細(xì)胞有40%病變，107、108倍稀釋后所加的細(xì)胞孔中細(xì)胞發(fā)生90%的病變（圖4）。以上結(jié)果表明重組雞α干擾素能夠抑制H9N2禽流感病毒的復(fù)制。

3討論與結(jié)論

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近十年發(fā)展起來(lái)的具有高效分泌表達(dá)的一種真核表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能進(jìn)行真核轉(zhuǎn)錄后修飾，如糖基化、二硫鍵的形成和蛋白水解處理，在表達(dá)產(chǎn)物的加工、外分泌等方面優(yōu)勢(shì)明顯[17]。本研究選用的載體pPIC9K是一種分泌表達(dá)載體，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)翻譯后糖基化修飾和正確折疊，而且有利于表達(dá)產(chǎn)物的純化。

在本試驗(yàn)中，重組菌GS115/pPIC9K-IFNα的誘導(dǎo)上清經(jīng)dot-blot分析，發(fā)現(xiàn)其能分泌表達(dá)出IFNα，證實(shí)重組蛋白IFNα分泌到巴斯德畢赤酵母細(xì)胞外，且有一定的抗雞H9N2亞型禽流感病毒的活性。本試驗(yàn)為重組雞干擾素作為疫苗佐劑的研究和推廣應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

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[16]費(fèi)崢崢，關(guān)怡新，姚善涇. 重組人γ干擾素復(fù)性過(guò)程中體外活性檢測(cè)方法研究[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2004，31（3）：65-69.

[17]Cereghino J L，Cregg J M. Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[J]. FEMS Microbiology Reviews，2000，24（1）：45-66.

2.3重組酵母菌的表達(dá)和dot-blot分析

經(jīng)dot-blot分析確證，重組酵母菌誘導(dǎo)表達(dá)的上清液檢測(cè)出顏色較深的斑點(diǎn)，而空白菌沒(méi)有（圖3）。結(jié)果表明，GS115/pPIC9KIFNα表達(dá)產(chǎn)物具有良好的免疫原性。

2.4重組雞α干擾素表達(dá)產(chǎn)物抗病毒活性初步檢測(cè)

在雞胚成纖維細(xì)胞上分析重組干擾素表達(dá)產(chǎn)物抗病毒的能力。結(jié)果顯示，空白對(duì)照孔細(xì)胞生長(zhǎng)良好，陽(yáng)性對(duì)照孔細(xì)胞皺褶，病變嚴(yán)重（90%病變）；加入102、103、104倍稀釋后的表達(dá)產(chǎn)物的細(xì)胞孔中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)與空白對(duì)照孔一致，基本無(wú)病變；表達(dá)產(chǎn)物105倍稀釋后，所加的細(xì)胞孔中細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)仍然良好，有15%的病變，表明105倍稀釋后的干擾素依然有抗病毒的活性；106倍稀釋后所加的細(xì)胞孔中細(xì)胞有40%病變，107、108倍稀釋后所加的細(xì)胞孔中細(xì)胞發(fā)生90%的病變（圖4）。以上結(jié)果表明重組雞α干擾素能夠抑制H9N2禽流感病毒的復(fù)制。

3討論與結(jié)論

巴斯德畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是近十年發(fā)展起來(lái)的具有高效分泌表達(dá)的一種真核表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)能進(jìn)行真核轉(zhuǎn)錄后修飾，如糖基化、二硫鍵的形成和蛋白水解處理，在表達(dá)產(chǎn)物的加工、外分泌等方面優(yōu)勢(shì)明顯[17]。本研究選用的載體pPIC9K是一種分泌表達(dá)載體，不僅能夠?qū)崿F(xiàn)翻譯后糖基化修飾和正確折疊，而且有利于表達(dá)產(chǎn)物的純化。

在本試驗(yàn)中，重組菌GS115/pPIC9K-IFNα的誘導(dǎo)上清經(jīng)dot-blot分析，發(fā)現(xiàn)其能分泌表達(dá)出IFNα，證實(shí)重組蛋白IFNα分泌到巴斯德畢赤酵母細(xì)胞外，且有一定的抗雞H9N2亞型禽流感病毒的活性。本試驗(yàn)為重組雞干擾素作為疫苗佐劑的研究和推廣應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

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