侯新遠(yuǎn)等

摘要：利用相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性SRAP分子標(biāo)記對(duì) 3個(gè)河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）自然群體[安徽省當(dāng)涂（DT）群體、浙江省余姚 （YY）群體、江蘇省太湖東西山（DXS）群體]進(jìn)行了遺傳多樣性分析。從196對(duì)引物組合中篩選出 11 對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、穩(wěn)定的引物組合對(duì)3個(gè)群體進(jìn)行擴(kuò)增，共獲得71個(gè)位點(diǎn)；3個(gè)群體內(nèi)多態(tài)位點(diǎn)占比為690%～24.14%，其中DT群體多態(tài)位點(diǎn)占比為6.90%，YY群體多態(tài)位點(diǎn)占比為24.14%、DXS群體多態(tài)位點(diǎn)占比為24.14%；群體的Neis 基因多樣性指數(shù)（H）為0.033 0～0.093 9[DT（0033 0）

關(guān)鍵詞：河川沙塘鱧；相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性；遺傳多樣性；多樣性指數(shù)

中圖分類號(hào)： S917文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）10-0037-03

收稿日期：2014-01-20

基金資助：國(guó)家星火計(jì)劃（編號(hào)：2013GA690166）；江蘇省科技支撐計(jì)劃（農(nóng)業(yè)）項(xiàng)目（編號(hào)：BE2013441）；“江蘇省六大人才高峰”高層次人才項(xiàng)目（編號(hào)：NY-032）；江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金[編號(hào)：CX（11）1037]；南京師范大學(xué)科技成果轉(zhuǎn)化基金（編號(hào)：2013-02）；江蘇省揚(yáng)州市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)計(jì)劃（編號(hào)：2012074）；。

作者簡(jiǎn)介：侯新遠(yuǎn) （1988—），女，山西陽(yáng)泉人，碩士研究生，從事魚(yú)類種質(zhì)資源與遺傳育種研究。E-mail：houxinyuan1988@126.com。

通信作者：尹紹武，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事魚(yú)類種質(zhì)資源與遺傳育種研究。E-mail：yinshaowu@163.com。河川沙塘鱧（Odontobutis potamophila）屬鱸形目（Perciformes）蝦虎魚(yú)亞目（Gobioidei）沙塘鱧科（Odontobutidae）沙塘鱧屬（Odontobutis），廣泛分布在我國(guó)長(zhǎng)江中下游（湖北荊州至上海江段 ）及其沿江各支流、錢(qián)塘江水系、閩江水系，為我國(guó)小型淡水底棲肉食性魚(yú)類[1-2]。河川沙塘鱧營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，深受人們喜愛(ài)，是一種很有開(kāi)發(fā)前景的小型經(jīng)濟(jì)魚(yú)類。在2012年世界自然保護(hù)聯(lián)盟（IUCN）紅色名錄中，河川沙塘鱧被評(píng)級(jí)為信息缺乏物種。近年來(lái)，由于過(guò)度捕撈、環(huán)境破壞及人類其他活動(dòng)，導(dǎo)致其自然資源受到極大的破壞，從而對(duì)其種群遺傳結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定影響。國(guó)內(nèi)外關(guān)于河川沙塘鱧的報(bào)道多集中在其人工繁殖、生物學(xué)特性、病害防治等方面[3-13]，關(guān)于其種質(zhì)資源利用和資源保護(hù)等方面的報(bào)道較少，僅有Hou等采用線粒體DNA（D-loop）序列對(duì)河川沙塘鱧的群體進(jìn)行遺傳多樣性研究[14]，李妍等采用ISSR分子標(biāo)記對(duì)江蘇常熟河川沙塘鱧個(gè)體大小不一的2個(gè)群體遺傳差異性進(jìn)行研究[15]。相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism，SRAP）是一種新型的旨在擴(kuò)增開(kāi)放閱讀框（ORFs）的分子標(biāo)記技術(shù)[16]，該分子標(biāo)記具有簡(jiǎn)單、高效、穩(wěn)定、重復(fù)性高、產(chǎn)率高和多態(tài)性較豐富等特點(diǎn)，目前廣泛應(yīng)用于植物種質(zhì)鑒定、基因定位、遺傳多樣性分析和圖譜構(gòu)建[17-20]。目前在水產(chǎn)研究中已用于羅氏沼蝦[21]、海南沼蝦[22]、草魚(yú)[23]、暗紋東方鲀[24]、團(tuán)頭魴[25]、彩鯉[26]、烏蘇里擬鲿[27]、文蛤[28]的遺傳多樣性研究。本研究采用SRAP分子標(biāo)記對(duì)3個(gè)群體的河川沙塘鱧遺傳多樣性進(jìn)行分析，以期了解河川沙塘鱧種質(zhì)資源現(xiàn)狀及其種群間的遺傳分化情況，為河川沙塘鱧種質(zhì)資源保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供參考資料。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用樣品分別采自安徽省當(dāng)涂縣運(yùn)糧河流域（簡(jiǎn)稱DT，31°25′37″N，118°42′59″E）、浙江省余姚市姚江流域（簡(jiǎn)稱YY，30°0′16.49″N，121°3′6.33″31°25′37″E）、江蘇省太湖靠近東西山側(cè)水域（簡(jiǎn)稱DXS，30°59′58.16″N，120°27′21.02″E），每個(gè)種群采集8尾，將尾鰭保存于無(wú)水乙醇中（-20 ℃）備用。

1.2基因組DNA提取

采用常規(guī)苯酚-氯仿抽提法[29]從鰭條組織中提取基因組DNA。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA質(zhì)量，放入 -20 ℃ 冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.3SRAP-PCR 反應(yīng)

根據(jù)已發(fā)表的SRAP通用引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成正、反向引物各14個(gè)（表1），將它們隨機(jī)配對(duì)構(gòu)成196對(duì)不同引物組合，用于PCR擴(kuò)增，篩選出帶型清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性較好的引物組合用于進(jìn)一步試驗(yàn)。25 μL SRAP-PCR反應(yīng)體系為：10×buffer 2.5 μL（含 Mg2+），2 mmol/L dNTPs 2.5 μL，10 mmol/L正/反向引物各 0.5 μL，5 U/μL Taq DNA 酶0.2 μL，基因組 DNA 1 μL，不足部分用滅菌雙蒸水補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性 1 min，35 ℃ 退火1 min，72 ℃延伸2 min，5個(gè)循環(huán)；94 ℃ 變性 1 min，53 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min。

表1用于河川沙塘鱧遺傳多樣性分析的SRAP引物序列

引物

1.4數(shù)據(jù)分析

根據(jù)SRAP擴(kuò)增電泳圖譜，將每條帶視為1個(gè)位點(diǎn)，對(duì)每個(gè)樣品SRAP擴(kuò)增帶的有無(wú)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，有帶記為1，無(wú)帶記0，將電泳圖譜轉(zhuǎn)換成數(shù)字矩陣。采用POPGENE 1.32計(jì)算群體的Shannons信息指數(shù)（I）、Neis基因多樣性（H），統(tǒng)計(jì)不同引物組合對(duì)不同群體的多態(tài)位點(diǎn)百分率（P），計(jì)算Neis無(wú)偏遺傳距離（D）和遺傳相似度（S），并根據(jù)遺傳距離構(gòu)建3個(gè)群體的UPGMA聚類圖。

2結(jié)果與分析

2.1SRAP引物的篩選及擴(kuò)增圖譜

利用河川沙塘鱧3個(gè)群體的DNA對(duì)196對(duì)SRAP引物組合進(jìn)行篩選，其中11個(gè)引物組合（F2R3、F2R8、F2R12、F3R3、 F3R5、F3R10、 F4R4、F6R9、F9R11、F11R12、F12R8）得到穩(wěn)定、可重復(fù)、多態(tài)性好的擴(kuò)增圖譜（圖1、圖2、表2）。

表2河川沙塘鱧不同SRAP引物組合的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)

引物組合位點(diǎn)總數(shù)

（個(gè)）引物組合位點(diǎn)總數(shù)

（個(gè)）F2R311F4R46F2R86F6R95F2R126 F9R115F3R37F11R126F3R54F12R88F3R107

記錄擴(kuò)增出的在100～750 bp之間的條帶數(shù)（即位點(diǎn)數(shù)），發(fā)現(xiàn)每對(duì)引物組合擴(kuò)增的位點(diǎn)數(shù)為 4～11 個(gè)。擴(kuò)增位點(diǎn)最多的引物組合是 F2R3，擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)為 11個(gè)；擴(kuò)增位點(diǎn)最少的引物組合是F3R5，擴(kuò)增位點(diǎn)數(shù)為 4個(gè)。

2.2群體遺傳多樣性分析

表2中11對(duì)引物組合在 24尾河川沙塘鱧個(gè)體中共擴(kuò)增出71個(gè)位點(diǎn)，由表3對(duì)各群體遺傳參數(shù)的比較發(fā)現(xiàn)：YY群體和DXS群體多態(tài)位點(diǎn)占比最大，為24.14%；DT群體最小，為6.90%。此外還可看出，Neis 基因多樣性（H）由大到小依次為DXS群體（0.093 9）、YY群體（0.078 4）、DT群體（0.033 0）；Shannons 多樣性指數(shù)（I）由大到小依次為DXS群體（0136 8）、YY群體（0.120 6）、DT群體（0.046 3）。整體結(jié)果可以看出，DXS群體、YY群體的多態(tài)位點(diǎn)占比、Neis 基因多樣性和 Shannons 多樣性指數(shù)均稍高于DT群體。

2.3群體遺傳距離和遺傳相似度

依據(jù)Nei的方法由各位點(diǎn)等位基因頻率計(jì)算河川沙塘鱧3個(gè)群體間的Neis無(wú)偏遺傳距離（D）、遺傳相似度（S），結(jié)果

表3河川沙塘鱧3個(gè)群體SRAP擴(kuò)增位點(diǎn)的多態(tài)性和遺傳多樣性參數(shù)

群體多態(tài)位點(diǎn)

占比（%）Neis基因

多樣性（H）Shannons

信息指數(shù)（I）DT6.900.033 00.046 3YY24.140.078 40.120 6DXS24.140.093 90.136 8

見(jiàn)表4?？梢钥闯?，DT群體與YY群體間的遺傳距離最大（0286 7），遺傳相似度最小（0.750 7）；DXS 群體與YY群體的遺傳距離最?。?.036 3），遺傳相似度最大（0.964 4）。UPGMA 聚類圖顯示，YY群體和DXS群體聚為1支，DT群體單獨(dú)聚為1支（圖3）。

表4河川沙塘鱧群體間的Neis無(wú)偏遺傳距離D

（對(duì)角線下方）和遺傳相似度S（對(duì)角線上方）

群體DTYYDXSDT0.750 70.765 7YY0.286 70.964 4DXS0.267 00.036 3

3討論與結(jié)論

遺傳多樣性作為生物多樣性的重要組成部分，是物種多樣性、生態(tài)系統(tǒng)多樣性和景觀多樣性的基礎(chǔ)，也是生命進(jìn)化和適應(yīng)的基礎(chǔ)；種內(nèi)遺傳多樣性越豐富，物種對(duì)環(huán)境變化的適應(yīng)能力也越大。通常認(rèn)為多態(tài)位點(diǎn)比率、Neis 基因多樣指數(shù)和 Shannons 信息指數(shù)是衡量群體遺傳多樣性的常用指標(biāo)。本研究中3個(gè)河川沙塘鱧群體的多態(tài)位點(diǎn)占比在6.90%～2414%間，Neis 基因多樣指數(shù)為0.033 0～0.093 9，Shannons信息指數(shù)在0.046 3～0.136 8間。與其他水產(chǎn)動(dòng)物的SRAP數(shù)據(jù)比較發(fā)現(xiàn)，3個(gè)群體的多態(tài)位點(diǎn)占比低于程長(zhǎng)洪等研究的暗紋東方鲀?nèi)后w（54.98%～58.87%）[24]，冉瑋等研究的3個(gè)地理群體團(tuán)頭魴（29.07%～58.14%）[25]，賈永義等研究的翹嘴紅鲌群體（50.00%）、團(tuán)頭魴群體（4632%）[30]，張志偉等研究的江蘇南通文蛤（57.81%）[28]；周勁松等研究的羅氏沼蝦（55.6%～64.1%）[21]；張慧研究的大麻哈魚(yú)（7375%）[31]，可見(jiàn)河川沙塘鱧的遺傳多樣性目前仍處于比較低的水平，與Hou等用D-loop基因序列研究不同群體的河川沙塘鱧遺傳多樣性結(jié)果[14]一致。這可能與第四紀(jì)冰川有關(guān)，冰期使得很多淡水魚(yú)都遭受了災(zāi)難性毀滅，河川沙塘鱧也難逃厄運(yùn)，受到嚴(yán)重的破壞，只有少數(shù)幸存下來(lái)。除了歷史原因，近年來(lái)環(huán)境惡化、生態(tài)棲息地被破壞、水利修建、人類過(guò)度濫捕等因素也導(dǎo)致河川沙塘鱧數(shù)量銳減。

遺傳相似度和遺傳距離從一定程度上衡定了種群間遺傳差異程度[32]。本研究對(duì)各群體進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，DT群體與YY群體間的遺傳距離最大（0.286 7），遺傳相似度最?。?.750 7），DXS 群體與YY群體的遺傳距離最?。?036 3），遺傳相似度最大（0.964 4），親緣關(guān)系最近，同時(shí)UPGMA聚類圖顯示YY群體和DXS群體聚為1支，DT群體聚為單獨(dú)的1支，與mtDNA控制區(qū)序列分析得出的DXS 群體與YY群體的遺傳距離最小的結(jié)果一致[14]。從地理位置上看，DXS群體的地理位置與YY群體的地理位置較近，客觀上增加了2個(gè)群體的遺傳相似度。

本研究結(jié)果顯示，河川沙塘鱧的遺傳多樣性低，為了恢復(fù)河川沙塘鱧漁業(yè)資源，在加強(qiáng)對(duì)其保護(hù)、保護(hù)其產(chǎn)卵場(chǎng)和改善水域環(huán)境條件的同時(shí)，應(yīng)該嚴(yán)格設(shè)立禁捕期、限制捕撈器械規(guī)格，同時(shí)加強(qiáng)人們對(duì)漁業(yè)資源保護(hù)的意識(shí)，在明確遺傳結(jié)構(gòu)的基礎(chǔ)上，加強(qiáng)河川沙塘鱧人工養(yǎng)殖的研究和推廣，從而減輕人類對(duì)野生資源的捕撈壓力，緩解市場(chǎng)需求。同時(shí)應(yīng)選擇等位基因數(shù)多、雜合度較高、親緣關(guān)系接近天然個(gè)體的群體進(jìn)行人工放流，從而恢復(fù)野生河川沙塘鱧資源。

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[24]程長(zhǎng)洪，張敏瑩，劉凱，等. 利用SRAP標(biāo)記研究四個(gè)暗紋東方鲀?nèi)后w的遺傳多樣性[J]. 水生生物學(xué)報(bào)，2012，36（5）：858-865.

[25]冉瑋，張桂蓉，王衛(wèi)民，等. 利用SRAP標(biāo)記分析3個(gè)團(tuán)頭魴群體的遺傳多樣性[J]. 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，29（5）：601-606.

[26]Hu Z H，Lv Y P，Wang C H，et al. Analysis on ‘Whole Red of patterns Oujiang colour carp （Cyprinus carpio var. Color） by SRAP and SCAR markers[J]. Aquaculture Research，2012，43（4）：588-594.

[27]徐汗福. 烏蘇里擬鲿（Pseudobagrus ussuriensis）不同群體間的遺傳多樣性比較研究[D]. 蘇州：蘇州大學(xué)，2011.

[28]張志偉，陳愛(ài)華，姚國(guó)興，等. 我國(guó)沿海不同地理原種文蛤的 SRAP 分析[J]. 海洋與湖沼，2010，41（3）：429-434.

[29]Sambrook J，F(xiàn)ritsch E F，Maniatis T. Molecular cloning：a laboratory manual[M]. 2nd ed. New York：Cold Springharbor Laboratory Press，1989.

[30]賈永義，顧志敏，葉金云，等. 翹嘴紅鲌（♀）×團(tuán)頭魴（♂）雜種F1的SRAP標(biāo)記分析[J]. 上海海洋大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，20（2）：198-203.

[31]張慧. 大麻哈魚(yú)SRAP體系建立及其遺傳多樣性研究[D]. 哈爾濱：東北林業(yè)大學(xué)，2011.

[32]張永明，金 洪，馬萬(wàn)里，等. 瀕危植物綿刺8個(gè)種群遺傳多樣性的AFLP分析[J]. 生態(tài)學(xué)報(bào)，2009，29（5）：2686-2693.

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