孫偉清++張昌輪++袁茜++梁建生++呂冰

摘要：采用RT-PCR和TA克隆技術(shù)，從水稻品種日本晴中擴增出類整合素候選基因（integrin-like protein，ILP）OsILP的cDNA片段。經(jīng)測序鑒定，克隆獲得的目的片段長為1 167 bp，包含完整的CDS，編碼388個氨基酸，預(yù)測分子量43 ku。進而將該片段連接至表達載體pTCK303中，通過PCR鑒定與酶切驗證，結(jié)果表明成功構(gòu)建了pTCK303-OsILP過表達載體。并將表達載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化為農(nóng)桿菌EHA105，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)將其導(dǎo)入水稻日本晴的愈傷中，經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化，陽性鑒定，獲得了過表達轉(zhuǎn)OsILP基因水稻株系。

關(guān)鍵詞：水稻；類整合素蛋白；過表達；轉(zhuǎn)基因株系

中圖分類號： Q785；S336文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）10-0017-04

收稿日期：2013-11-11

基金項目：江蘇省自然科學(xué)基金（編號：BK2009185）。

作者簡介：孫偉清（1987—），男，山東臨沂人，碩士，主要從事植物逆境生理研究。E-mail：qdswqlzc@163.com。

通信作者：呂冰，博士，副教授，主要從事植物生理生化與分子生物學(xué)研究。E-mail：lubing@yzu.edu.cn。水稻OsILP即Os03g0199100、LOC_Os03g10240，別稱UPF0496 protein 1，是由1 167個核苷酸序列編碼388個氨基酸組成的未知功能蛋白，預(yù)測分子量43 ku，屬于DUF677家族（domain of unknown function 677）。DUFs為具有保守結(jié)構(gòu)域。但在Pfam等蛋白家族數(shù)據(jù)庫中信息較少、功能尚待明確的一系列蛋白家族[1]。其中，DUF677 （PF05055）家族是植物中存在的一個功能未知的蛋白家族。該家族中，除OsILP外，擬南芥AT14A也是其中之一。AT14A是一個與動物整合素蛋白具有部分相似序列和功能的膜蛋白[2-3]，被命名為類整合素蛋白（integrin like protein，ILP）。

整合素是動物細胞黏附分子的重要成員，屬于一類跨膜蛋白的超家族，是由2個跨膜糖蛋白亞基（α亞基、β亞基）通過非共價鍵連接而成的異二聚體[4]。從結(jié)構(gòu)上看，α亞基、β亞基都是由1個大的N-胞外結(jié)構(gòu)域、1個短的跨膜結(jié)構(gòu)域、1個短的C-胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域組成[5]。構(gòu)成胞外結(jié)構(gòu)域的氨基酸通過折疊和纏繞形成一個結(jié)合 “口袋”，能識別并結(jié)合各種含有RGD（Arg-Gly-Asp）短肽序列的胞外基質(zhì)分子，并調(diào)節(jié)其與配體結(jié)合的特異性?？缒そY(jié)構(gòu)域相對較小，但在進化上屬高度保守的區(qū)域。在胞質(zhì)一側(cè)，整合素直接與包括α-輔肌動蛋白在內(nèi)的多種肌動蛋白結(jié)合蛋白相連[6]。當(dāng)細胞外因素刺激或細胞本身的生理功能發(fā)生變化時，α-輔肌動蛋白可通過其酪氨酸磷酸化、結(jié)合Ca2+或其他信號分子而影響細胞骨架形態(tài)，調(diào)節(jié)細胞運動。整合素作為黏附受體的生物學(xué)功能是傳導(dǎo)生化信號并改變細胞骨架的機械結(jié)構(gòu)，從而構(gòu)成了胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）-質(zhì)膜-細胞骨架連續(xù)體，成為動物細胞內(nèi)外信號雙向轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中的關(guān)鍵分子之一，在細胞的運動、增殖、分化、凋亡等方面起重要作用[7-9]。

序列比對結(jié)果表明，OsILP蛋白與擬南芥類整合素蛋白AT14A有22.87%的同源性，并且疏水氨基酸主要集中在 220～280 位氨基酸。預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)（圖1）顯示，其與動物整合素亞基的構(gòu)成更類似，即含有胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域各1個，且具有不同物種間較保守的同源序列，因此推測其為水稻中的類整合素（OsILP），參與了細胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程的調(diào)控。

本研究采用分子生物學(xué)技術(shù)克隆出OsILP，并構(gòu)建過表達載體，再通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化水稻植株，獲得過表達的轉(zhuǎn)OsILP基因水稻株系，旨在為研究OsILP編碼蛋白的表達、定位及生理功能，最終判斷OsILP蛋白是否為水稻中的類整合素，以及研究其在細胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試材料

供試材料為粳稻品種日本晴（Oryza sativa subsp. japonica cv. Nipponbare）。克隆載體pMD19-T購自TaKaRa公司。pTCK303雙元載體由中國科學(xué)院種康實驗室惠贈。大腸桿菌（E.coli）DH5α、農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）EHA105等分子生物學(xué)試驗常用菌種由筆者所在實驗室保存。

1.2OsILP基因擴增與T-A克隆

1.2.1引物設(shè)計根據(jù)GenBank公布的水稻基因及其登錄號NM_001055818在NCBI 數(shù)據(jù)庫中搜索OsILP基因的編碼序列，并結(jié)合表達載體（pTCK303）的多克隆酶切位點[10]（圖2）設(shè)計特異引物 （表1）。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，同時合成潮霉素（Hyg）抗性基因的引物。

1.2.2OsILP基因的PCR擴增提取日本晴水稻14 d幼苗的總RNA，以甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000 微量分光光度計檢測RNA 質(zhì)量，參照TaKaRa公司的cDNA第一鏈合成試劑盒說明書，采用20 μL反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄合成水稻cDNA第一鏈。

以第一鏈cDNA為模板進行PCR 擴增，擴增條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30次循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。

1.2.3OsILP基因的T-A克隆與測序純化的目的基因片段與pMD19-T載體連接，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細

表1目標基因的PCR擴增產(chǎn)物

基因引物序列（5′→3′）產(chǎn)物大小（bp）OsILPF：GGATCCATGGGGAACAGCAGCA；R：ACTAGTTCAGCTAGGATGCCGGATGA1 167HygF：CTTCTGCGGGCGATTTGTG；R：TGACTGGAGCGAGGCGATG300

胞。對所獲得的白斑菌落通過菌液PCR 擴增驗證后，按照上海捷瑞生物工程有限公司質(zhì)粒小提試劑盒說明書提取質(zhì)粒，并送至南京金斯瑞生物科技有限公司測序，以確定其是否為重組克隆載體pMD19-T-OsILP。

1.3過表達轉(zhuǎn)OsILP基因載體的構(gòu)建與農(nóng)桿菌的獲得

1.3.1OsILP基因過表達載體的構(gòu)建將上述重組克隆載體（pMD19-T-OsILP）質(zhì)粒和空載體pTCK303 質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和SpeⅠ 雙酶切，分別回收目標區(qū)域（1 200 bp 左右）片段和空載體酶切產(chǎn)物（約14 kb） 片段，用T4-DNA 連接酶過夜連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞。

用2種方法分別驗證重組質(zhì)粒：一是進行菌落PCR驗證；二是采用酶切驗證。PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物均用瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.2過表達轉(zhuǎn)OsILP基因農(nóng)桿菌的獲得采用凍融法將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105感受態(tài)細胞中，對抗生素篩選出的陽性菌落以目的基因OsILP為目標產(chǎn)物進行PCR鑒定。

1.4過表達轉(zhuǎn)OsILP基因水稻株系的獲得與鑒定

水稻轉(zhuǎn)基因操作步驟參考劉巧泉等的方法[11]，略作改動。提取T0代轉(zhuǎn)化苗的葉片DNA，以潮霉素抗性基因為目標產(chǎn)物進行PCR擴增，擴增條件：95 ℃預(yù)變性4 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，30次循環(huán)；72 ℃后延伸10 min。

2結(jié)果與分析

2.1OsILP基因的克隆

將從日本晴水稻中提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈后，進行OsILP基因的PCR擴增。瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物的結(jié)果如圖3-A所示，擴增產(chǎn)物大小為1 200 bp左右，符合目的片段1 167 bp預(yù)期。將回收并純化后的目標片段進行T-A克隆，菌液PCR驗證結(jié)果（圖3-B）表明，目的片段已轉(zhuǎn)入pMD19-T載體。陽性菌液測序結(jié)果經(jīng)NCBI序列比對，與NCBI上報道的OsILP基因序列99%匹配，只有第1 040位上的堿基由 “T”變成“C”，即由“GAT”變成“GAC”，密碼子由“CUA”變成“CUG”，編碼同一種氨基酸（亮氨酸），此為同義改變。上述結(jié)果表明重組克隆載體 pMD19-T-OsILP 已構(gòu)建成功。

2.2pTCK303-OsILP過表達載體的構(gòu)建

利用位于載體pMD19-T-OsILP和表達載體pTCK303內(nèi)含子兩端的BamHⅠ和SpeⅠ酶切位點，分別對提取的2個載體質(zhì)粒進行雙酶切，回收各自目的片段（1 167、14 kb），將兩者用T4-DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。對菌液進行PCR鑒定，結(jié)果見圖4-A。除陰性對照外，陽性對照和檢測菌液均可以擴增出1 167 bp長的目的片段。進而提取質(zhì)粒，對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定（圖4-B），1號泳道為空載體的酶切結(jié)果，在400 bp處可看到1條帶，為內(nèi)含子片段；2號泳道為重組載體的酶切結(jié)果，在1 200 bp左右處出現(xiàn)1條帶，說明目標片段（1 167 bp）已正確連接到pTCK303載體中。

將所構(gòu)建的過表達載體pTCK303-OsILP導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105中，農(nóng)桿菌菌液PCR檢測如圖4-C所示，1號泳道為空載體陰性對照，2號泳道為陽性對照，3～5號泳道為不同的單克隆菌株，2～5號泳道均擴增出目的片段，說明過表達載體pTCK303-OsILP已成功導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，可以進行下一步的愈傷轉(zhuǎn)化。

2.3農(nóng)桿菌介導(dǎo)的水稻遺傳轉(zhuǎn)化

以成熟胚愈傷組織為材料，與轉(zhuǎn)過表達載體pTCK303-OsILP的農(nóng)桿菌菌液共培養(yǎng)后，用含潮霉素、頭孢霉素的培養(yǎng)基進行抗性篩選，得到抗性愈傷（圖5-A），并對篩選出的抗性愈傷誘導(dǎo)生芽（圖5-B），再將生芽植株轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基培養(yǎng)生根（圖5-C），獲得再生抗性苗，然后移栽到盆缽（圖5-D）。

2.4T0代過表達轉(zhuǎn)OsILP基因水稻植株的潮霉素抗性基因檢測

提取再生苗葉片基因組DNA，以潮霉素抗性基因為特異擴增對象進行PCR擴增。由圖6可見，在檢測的9株再生苗中有6株能擴增出預(yù)期長度的目標條帶，即檢測出了潮霉素抗性基因，證實帶有嵌合基因的T-DNA區(qū)域已融合到水稻植株的基因組中，獲得了陽性轉(zhuǎn)基因植株。

3結(jié)論與討論

采用反向遺傳學(xué)技術(shù)，首先從水稻cDNA文庫中擴增出了OsILP基因編碼區(qū)全長序列。由于OsILP基因序列GC含量高達60%以上，使得引物的退火溫度變高，普通Taq酶無法擴增出完整的目的基因全長，只能得到500～800 bp的片段。本研究采用TaKaRa公司的 LA Taq with GC Buffer Ⅰ（編碼RR02AG），應(yīng)用LA PCR原理研制出具有3′→5′Exonuclease活性 （Proof reading活性） 的耐熱性DNA聚合酶。無論是擴增短鏈DNA還是長鏈DNA，其效率都優(yōu)于其他同類產(chǎn)品，尤其是在擴增大于10 kb的DNA片段上，其優(yōu)勢更加明顯，而且保真性能強。當(dāng)擴增具有復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu) （GC rich等） 的模板或重復(fù)序列的模板時，使用GC Buffer進行PCR擴增將非常有效。然而該酶雖能完整擴增出目的片段，但并不能保證測序結(jié)果與目的片段完全一致，多次試驗結(jié)果均不理想，最好的試驗結(jié)果是本研究中達到的99%匹配率，因是同義突變，沒有改變氨基酸序列，編碼蛋白與目標蛋白完全一致。

pTCK303雙元表達載體是構(gòu)建RNA干擾載體，使基因沉默的常用載體[10]。因其在內(nèi)含子兩端各自反向連入了1段目的基因，使之在轉(zhuǎn)錄后能形成雙鏈RNA（dsRNA）。dsRNA 首先與Dicer酶的dsRNA結(jié)合區(qū)結(jié)合，并降解成為21～23個核苷酸的小分子干擾RNA（siRNA）。siRNA在解旋酶的作用下解鏈形成的反義鏈RNA可指導(dǎo)生成一種核蛋白體復(fù)合物，也叫誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC），在解旋酶作用下，雙鏈RNA解鏈形成單鏈，RISC的內(nèi)切酶及外切酶活性被激活，在 siRNA序列的引導(dǎo)下，對靶mRNA進行剪切，從而降解特定mRNA，從而使目標基因沉默[12-15]。而本研究直接利用目的基因全長替換掉載體上的內(nèi)含子片段，使之成為過表達載體。

將構(gòu)建的過表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，再通過根癌

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻愈傷。具體操作時鑒于農(nóng)桿菌生長不容易控制，建議浸染后的愈傷組織一定要盡量吹干再移到共培養(yǎng)基，并且一定要在培養(yǎng)基里墊1層無菌濾紙，即使這樣，在后面篩選培養(yǎng)基中仍須加一定濃度的頭孢霉素，以防止農(nóng)桿菌過度繁殖。初步篩選僅有小部分能正常生長出嫩黃色的新生愈傷組織。第2步篩選時，潮霉素濃度加倍，而頭孢霉素的濃度相應(yīng)降低，此時大部分愈傷組織都能正常生長，只是極個別愈傷仍會大量繁殖農(nóng)桿菌，最后獲得9株轉(zhuǎn)基因再生苗。

T0代轉(zhuǎn)基因植株的鑒定主要是以載體上的潮霉素基因為擴增對象，初步鑒定獲得了6個過表達的轉(zhuǎn)基因水稻植株，這為研究OsILP蛋白的表達、定位及生理功能，最終判斷其是否即為水稻中的類整合素，以及研究OsILP在細胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用奠定了基礎(chǔ)。

4研究展望

生物信息學(xué)研究表明，OsILP的表達情況與生物脅迫、非生物脅迫、種子萌發(fā)均有關(guān)系。不僅如此，基因芯片數(shù)據(jù)庫結(jié)果還顯示，OsILP在水稻不同器官組織中的表達情況也各不相同，尤其在胚乳等貯藏器官中OsILP的表達量相對較高，而在葉片等營養(yǎng)器官中表達量相對較低。因此，OsILP的功能可能與水稻抗逆、種子萌發(fā)、籽粒胚乳發(fā)育密切相關(guān)。

OsILP是用擬南芥類整合素基因AT14A序列在水稻數(shù)據(jù)庫中BLAST尋找的基因，兩者的編碼蛋白同屬DUF677家族。筆者所在實驗室已有研究表明，AT14A作為擬南芥中的類整合素，介導(dǎo)了細胞壁-質(zhì)膜-細胞骨架連續(xù)體，在細胞的內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起著重要作用[3]。從結(jié)構(gòu)上來看，水稻OsILP含有胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域各1個，其分子結(jié)構(gòu)與動物整合素更為類似。結(jié)構(gòu)相似提示功能可能一致，OsILP是否為水稻中的類整合素及其與水稻種子發(fā)育、萌發(fā)及響應(yīng)逆境脅迫的關(guān)系，還須進一步驗證。

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將構(gòu)建的過表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，再通過根癌

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻愈傷。具體操作時鑒于農(nóng)桿菌生長不容易控制，建議浸染后的愈傷組織一定要盡量吹干再移到共培養(yǎng)基，并且一定要在培養(yǎng)基里墊1層無菌濾紙，即使這樣，在后面篩選培養(yǎng)基中仍須加一定濃度的頭孢霉素，以防止農(nóng)桿菌過度繁殖。初步篩選僅有小部分能正常生長出嫩黃色的新生愈傷組織。第2步篩選時，潮霉素濃度加倍，而頭孢霉素的濃度相應(yīng)降低，此時大部分愈傷組織都能正常生長，只是極個別愈傷仍會大量繁殖農(nóng)桿菌，最后獲得9株轉(zhuǎn)基因再生苗。

T0代轉(zhuǎn)基因植株的鑒定主要是以載體上的潮霉素基因為擴增對象，初步鑒定獲得了6個過表達的轉(zhuǎn)基因水稻植株，這為研究OsILP蛋白的表達、定位及生理功能，最終判斷其是否即為水稻中的類整合素，以及研究OsILP在細胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用奠定了基礎(chǔ)。

4研究展望

生物信息學(xué)研究表明，OsILP的表達情況與生物脅迫、非生物脅迫、種子萌發(fā)均有關(guān)系。不僅如此，基因芯片數(shù)據(jù)庫結(jié)果還顯示，OsILP在水稻不同器官組織中的表達情況也各不相同，尤其在胚乳等貯藏器官中OsILP的表達量相對較高，而在葉片等營養(yǎng)器官中表達量相對較低。因此，OsILP的功能可能與水稻抗逆、種子萌發(fā)、籽粒胚乳發(fā)育密切相關(guān)。

OsILP是用擬南芥類整合素基因AT14A序列在水稻數(shù)據(jù)庫中BLAST尋找的基因，兩者的編碼蛋白同屬DUF677家族。筆者所在實驗室已有研究表明，AT14A作為擬南芥中的類整合素，介導(dǎo)了細胞壁-質(zhì)膜-細胞骨架連續(xù)體，在細胞的內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起著重要作用[3]。從結(jié)構(gòu)上來看，水稻OsILP含有胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域各1個，其分子結(jié)構(gòu)與動物整合素更為類似。結(jié)構(gòu)相似提示功能可能一致，OsILP是否為水稻中的類整合素及其與水稻種子發(fā)育、萌發(fā)及響應(yīng)逆境脅迫的關(guān)系，還須進一步驗證。

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將構(gòu)建的過表達載體導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，再通過根癌

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化水稻愈傷。具體操作時鑒于農(nóng)桿菌生長不容易控制，建議浸染后的愈傷組織一定要盡量吹干再移到共培養(yǎng)基，并且一定要在培養(yǎng)基里墊1層無菌濾紙，即使這樣，在后面篩選培養(yǎng)基中仍須加一定濃度的頭孢霉素，以防止農(nóng)桿菌過度繁殖。初步篩選僅有小部分能正常生長出嫩黃色的新生愈傷組織。第2步篩選時，潮霉素濃度加倍，而頭孢霉素的濃度相應(yīng)降低，此時大部分愈傷組織都能正常生長，只是極個別愈傷仍會大量繁殖農(nóng)桿菌，最后獲得9株轉(zhuǎn)基因再生苗。

T0代轉(zhuǎn)基因植株的鑒定主要是以載體上的潮霉素基因為擴增對象，初步鑒定獲得了6個過表達的轉(zhuǎn)基因水稻植株，這為研究OsILP蛋白的表達、定位及生理功能，最終判斷其是否即為水稻中的類整合素，以及研究OsILP在細胞內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用奠定了基礎(chǔ)。

4研究展望

生物信息學(xué)研究表明，OsILP的表達情況與生物脅迫、非生物脅迫、種子萌發(fā)均有關(guān)系。不僅如此，基因芯片數(shù)據(jù)庫結(jié)果還顯示，OsILP在水稻不同器官組織中的表達情況也各不相同，尤其在胚乳等貯藏器官中OsILP的表達量相對較高，而在葉片等營養(yǎng)器官中表達量相對較低。因此，OsILP的功能可能與水稻抗逆、種子萌發(fā)、籽粒胚乳發(fā)育密切相關(guān)。

OsILP是用擬南芥類整合素基因AT14A序列在水稻數(shù)據(jù)庫中BLAST尋找的基因，兩者的編碼蛋白同屬DUF677家族。筆者所在實驗室已有研究表明，AT14A作為擬南芥中的類整合素，介導(dǎo)了細胞壁-質(zhì)膜-細胞骨架連續(xù)體，在細胞的內(nèi)外信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面起著重要作用[3]。從結(jié)構(gòu)上來看，水稻OsILP含有胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域各1個，其分子結(jié)構(gòu)與動物整合素更為類似。結(jié)構(gòu)相似提示功能可能一致，OsILP是否為水稻中的類整合素及其與水稻種子發(fā)育、萌發(fā)及響應(yīng)逆境脅迫的關(guān)系，還須進一步驗證。

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