王東新，郗曉云，李英奇

(1山西醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生化學(xué)教研室，太原 030001;2山西大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院;*通訊作者，E-mail:wdx2002hx@aliyun.com)

阿霉素(doxorubicin hydrochloride，DOX)是一種廣譜抗癌藥物，通過(guò)微生物方法合成的一種含糖苷的蒽環(huán)類(lèi)抗生素，其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1。它的抗癌作用機(jī)制是能嵌入細(xì)胞的雙鏈DNA，抑制RNA和DNA的合成，對(duì)RNA的抑制作用最強(qiáng)，屬周期非特異性藥物，對(duì)各種生長(zhǎng)周期的腫瘤細(xì)胞都有殺滅作用［1］。同時(shí)DOX也是很好的金屬螯合劑，研究表明DOX與Fe3+配位可加強(qiáng)DOX與DNA的作用，同時(shí)產(chǎn)生的自由基可引起DNA的氧化損傷，提高DOX的抗癌效率［2］。但是由于DOX具有較強(qiáng)的骨髓抑制作用和心臟毒性［3］，易使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，從而限制其臨床的應(yīng)用。

動(dòng)物體內(nèi)的抑癌實(shí)驗(yàn)和體外實(shí)驗(yàn)證明稀土離子對(duì)肉瘤和化學(xué)致癌均有抑制作用［4，5］，稀土離子由于其離子半徑適中、電荷多，在體內(nèi)易與各種蛋白配位，并有較差的細(xì)胞穿透性［6］，從而失去其抗癌功能。但是與一些易于穿透細(xì)胞膜，特別是核膜的配體配位后可加強(qiáng)其抗癌功能。稀土離子鋱(Tb3+)的配合物具有優(yōu)異的熒光特性而便于對(duì)其進(jìn)行光譜分析，近年來(lái)對(duì)Tb3+在生物體內(nèi)的熒光成像研究較多［7］，但是 Tb3+與 DOX配合物的研究未見(jiàn)報(bào)道。本文主要使用光譜方法對(duì)Tb3+與DOX形成的配合物及其穩(wěn)定性進(jìn)行了研究，并對(duì)DOX-Tb3+配合物是否可提高DOX的抗癌作用進(jìn)行了測(cè)定。

圖1 阿霉素結(jié)構(gòu)示意Figure 1 The structure of DOX

1 材料與方法

1.1 材料

阿霉素(DOX，doxorubicin hydrochloride，深圳萬(wàn)樂(lè)藥業(yè)有限公司，批號(hào)H44024359)，TbCl3(上海丹曦化工科技有限公司)，實(shí)驗(yàn)用Hepes(pH 7.4)緩沖體系，噻唑藍(lán)(MTT，Sigma)，細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM(賽默飛世爾生物化學(xué)制品有限公司)，胎牛血清(FBS，杭州四季青生物工程材料有限公司)，胰蛋白酶(Trypsin，Amresco)，EDTA(北京化工廠)，二甲基亞砜(DMSO，Amresco)，實(shí)驗(yàn)中所用化學(xué)試劑均為分析純，細(xì)胞培養(yǎng)用水為三次蒸餾水，其他用水為一次蒸餾水，人肝癌細(xì)胞(HepG2細(xì)胞)由山西大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)所提供。

1.2 儀器

水套式二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(HF160W，上海力申科學(xué)儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(Model 550，美國(guó)Bio-rad公司)，紫外－可見(jiàn)分光光度計(jì)(Cary E-clipse，美國(guó)VARIAN公司)，熒光分光光度計(jì)(Cary Eclipse，美國(guó)VARIAN公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 DOX紫外可見(jiàn)吸收光譜的測(cè)定 室溫下，將DOX的Hepes溶液加入到1 cm比色皿中，以Hepes緩沖液為空白，繪制吸收光譜。測(cè)定480 nm處DOX的吸光度并依據(jù)其摩爾吸光系數(shù)確定其濃度(ε=11 500 L/(mol·cm))［8］。用 50 μl微量注射器向 DOX(5.0×10－5mol/L)的 Hepes(pH 7.4)溶液中逐量加入Tb3+溶液，搖勻，掃描光譜圖不變時(shí)為反應(yīng)平衡，并記錄該光譜圖。

1.3.2 熒光光譜測(cè)定 室溫下，將 DOX的 Hepes溶平液加入到1 cm比色皿中，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫均為10 nm，繪制500－750 nm的熒光光譜。同時(shí)逐量加入Tb3+溶液，搖勻，掃描光譜圖不變時(shí)為反應(yīng)平衡，并記錄光譜圖。

1.3.3 DOX-Tb3+配合物穩(wěn)定性的測(cè)定 將 DOX與Tb3+按1∶1的比例加入1 cm比色皿中，反應(yīng)后掃描紫外可見(jiàn)吸收光譜，并分別加入氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸等)和EDTA觀察光譜的變化。

1.4 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性

HepG2細(xì)胞接種到含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，置于37℃、飽和濕度、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁長(zhǎng)滿(mǎn)至80%－90%滿(mǎn)時(shí)傳代。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞懸液(7.5×103個(gè)細(xì)胞/mL)接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔200μl，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，待細(xì)胞完全貼壁后，分別加入5.1 μmol/L DOX、TbCl3和 DOX-Tb3+繼續(xù)培養(yǎng)24 h和48 h，以未處理的空白細(xì)胞為對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。反應(yīng)結(jié)束后每孔加入20μl MTT(5 mg/mL)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加150μl DMSO，震蕩10 min，待結(jié)晶完全溶解，于490 nm下用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值(A)。按照如下公式計(jì)算細(xì)胞存活率:細(xì)胞存活率(%)=實(shí)驗(yàn)組 A值/空白對(duì)照 A值×100%。

2 結(jié)果

2.1 DOX 與 Tb3+的作用

2.1.1 紫外吸收光譜 在pH為7.4的緩沖液中，DOX在480 nm附近處有一較寬的吸收帶，溶液為紅色，DOX的吸收光譜見(jiàn)圖2。DOX分子中的蒽環(huán)上的羥基和酮基上的氧與Tb3+配位，形成金屬配合物，使吸收光譜發(fā)生變化。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Tb3+與DOX有較強(qiáng)的相互作用，隨著Tb3+的加入，DOX在480 nm處的寬吸收帶紅移，峰高降低;同時(shí)在538 nm和580 nm附近的吸光度升高，得到與DOX有明顯區(qū)別的吸收曲線(圖2)，溶液呈現(xiàn)紫色，當(dāng)Tb3+達(dá)到一定濃度后，吸收光譜不再改變。采用光度滴定法進(jìn)行測(cè)定，以480 nm處的吸光度對(duì)［Tb3+］/［DOX］摩爾比作圖，曲線具有明顯的拐點(diǎn)，可以確定Tb3+與DOX形成1∶1的穩(wěn)定配合物(圖3)。

圖2 Tb3+滴定DOX的紫外－可見(jiàn)吸收光譜Figure 2 Ultraviolet-visible absorption spectra of DOX titrated by Tb3+

2.1.2 分子熒光光譜 以480 nm作為激發(fā)光激發(fā)下，DOX在595 nm處有最大熒光發(fā)射峰，560 nm有一個(gè)肩峰，用Tb3+滴定DOX溶液，記錄不同［Tb3+］/［DOX］摩爾比時(shí)的熒光光譜。實(shí)驗(yàn)表明，隨著稀土離子Tb3+的加入，DOX的熒光強(qiáng)度均隨之減弱。當(dāng)Tb3+達(dá)到一定濃度后，熒光光譜不再改變。不同濃度Tb3+滴定DOX的熒光光譜變化見(jiàn)圖4，結(jié)果顯示稀土離子Tb3+與DOX發(fā)生了作用，生成配合物，使分子的共軛體系發(fā)生改變，熒光效率降低。以595 nm的熒光強(qiáng)度對(duì)［Tb3+］/［DOX］摩爾比作圖(見(jiàn)圖5)，得到配合物的配比亦為［Tb3+］/［DOX］=1∶1。

圖3 DOX的吸光度隨［Tb3+］/［DOX］摩爾比的變化Figure 3 The absorbance of DOX at different molar ratio of［Tb3+］/［DOX］

圖4 Tb3+滴定DOX的熒光光譜Figure 4 The fluorescent spectra of DOX titrated by Tb3+

2.2 DOX和稀土離子配合物與氨基酸、EDTA的作用

為進(jìn)一步了解稀土離子Tb3+與DOX的結(jié)合能力強(qiáng)弱，我們研究了在氨基酸和EDTA的滴加下DOX與稀土離子Tb3+配合物的光譜變化。氨基酸、EDTA與DOX本身不發(fā)生作用，但可與DOX分子競(jìng)爭(zhēng)中心離子Tb3+，對(duì)DOX的稀土離子配合物有影響。實(shí)驗(yàn)表明，氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸等)的加入對(duì)Tb3+-DOX的特征吸收曲線沒(méi)有明顯影響，其在580nm處附近的吸收帶無(wú)變化，說(shuō)明這些氨基酸不能將Tb3+從DOX-Tb3+配合物中競(jìng)爭(zhēng)下來(lái);而強(qiáng)絡(luò)合劑EDTA的加入使DOX-Tb3+的特征吸收曲線發(fā)生變化，使其在580 nm處附近的吸收帶消失，而480 nm的吸光度升高(圖6，見(jiàn)第341頁(yè))，顯示出游離DOX的特征吸收曲線，溶液的顏色也由紫色變成紅色，表明EDTA使DOX-Tb3+配合物解離。

圖5 Tb3+的加入對(duì)DOX在595 nm處熒光強(qiáng)度的變化Figure 5 The changes of the fluorescence intensity of DOX at 595 nm after titrating Tb3+

2.3 DOX-Tb3+配合物對(duì)細(xì)胞毒性的影響

MTT試驗(yàn)是基于細(xì)胞水平測(cè)定毒性的方法，以HepG2細(xì)胞為模型，使用 MTT試驗(yàn)分別測(cè)定了DOX、TbCl3和DOX-Tb3+配合物對(duì)細(xì)胞的存活率，由此可得出對(duì)細(xì)胞毒性的大小順序?yàn)門(mén)bCl3＜DOX＜DOX-Tb3+(見(jiàn)圖7)。實(shí)驗(yàn)證明TbCl3對(duì)細(xì)胞的毒性較小，這可能是因?yàn)門(mén)b3+具有較強(qiáng)的配位能力以及較差的細(xì)胞穿透性而難以發(fā)揮其功效。但是當(dāng)DOX與Tb3+配位后對(duì)細(xì)胞的毒性比自由的DOX增大，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，見(jiàn)圖7)，可能是DOX-Tb3+與DNA的作用比DOX本身增強(qiáng)，Tb3+的存在使DOX對(duì)細(xì)胞毒性起協(xié)同作用。

圖6 氨基酸和EDTA的滴加對(duì)DOX-Tb3+配合物吸光光譜的變化Figure 6 The changes of the absorbance spectra of DOX-Tb3+complex after titrating amino acid and EDTA

圖7 MTT法測(cè)定細(xì)胞的存活率Figure 7 The cell viability was determined by MTT assay

3 討論

DOX可與稀土離子Tb3+相互作用形成1∶1的穩(wěn)定配合物，生物小分子如氨基酸等難以使配合物解離，只有強(qiáng)的絡(luò)合劑如 EDTA才能將其解離。DOX-Tb3+配合物可增加 DOX對(duì)癌細(xì)胞的毒性，Tb3+對(duì)DOX的細(xì)胞毒性起協(xié)同作用。

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