許偉，柯增光，，顏秀花，邵 榮，云志

1(鹽城工學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇鹽城，224051)2(南京工業(yè)大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇南京，210009)

蓖麻為大戟科蓖麻屬植物，是世界十大油料作物之一，在世界范圍內(nèi)廣泛種植［1］。我國是世界第二大蓖麻生產(chǎn)國［2］。蓖麻籽經(jīng)過壓榨出油后得到的殘?jiān)礊楸吐槠伞１吐槠芍泻胸S富的蛋白和天然活性物質(zhì)，其中的蓖麻堿［3］具有殺蟲［4］、保肝［5］、鎮(zhèn)痛［6，7］等作用;此外，蓖麻堿還具有中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮作用，低劑量時(shí)對記憶具有一定的改善效果，較大劑量時(shí)致驚厥，可作為工具藥制備癲癇動物模型篩選抗驚厥藥［8］。長期以來，蓖麻粕還只是作為肥料用于農(nóng)田，效益低下［9］。蓖麻粕的有效開發(fā)利用對推動蓖麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展、創(chuàng)造經(jīng)濟(jì)效益具有積極作用。本研究采用微波輔助法從蓖麻粕中提取蓖麻堿，通過響應(yīng)面優(yōu)化蓖麻堿提取工藝，并初步研究了蓖麻堿的抑菌性，以期為蓖麻堿的高效開發(fā)、拓寬利用途徑提供一些基礎(chǔ)科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大腸桿菌(Escherichia coli)、淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、金黃色葡萄球菌(Staphyloccus aureus)，都由鹽城工學(xué)院生物實(shí)驗(yàn)中心提供;蓖麻籽，購自河北省安國市華仁藥材有限公司。

甲醇(分析純)、無水乙醇(分析純)、石油醚(分析純)，購自江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司;無水乙醚(分析純)、三氯甲烷(分析純)，購自南京化學(xué)試劑有限公司;乙腈(色譜純)，購自美國天地公司;蒸餾水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

DK-80電熱恒溫水槽，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;RE-2000B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海雅榮生化設(shè)備儀器有限公司;752紫外可見分光光度計(jì)，上海佑科儀器有限公司;XO-SM50超聲波微波組合反應(yīng)系統(tǒng)，南京先歐生物科技有限公司;P230Ⅱ高效液相色譜，大連依利特有限公司;AUY220電子天平，日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蓖麻粕制備

將蓖麻籽粉碎，加入V(乙醚)∶V(石油醚)=3∶1的混合溶劑，固液比為1∶3(g∶mL)，機(jī)械攪拌1h，將固-液混合物進(jìn)行分離，干燥后得到脫脂蓖麻粕。

1.3.2 蓖麻堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

準(zhǔn)確稱取25 mg蓖麻堿純品，甲醇溶解定容在25 mL 容量瓶中，準(zhǔn)確吸取上述溶液 1、2、3、4、5、6 mL，分別定容在10 mL的容量瓶中，高效液相色譜法測峰面積。以蓖麻堿的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.3 蓖麻粕中蓖麻堿含量測定

準(zhǔn)確稱取蓖麻粕20 g，按1∶10(g∶mL)的料液比加入蒸餾水，在微波功率400 W下提取5 min，過濾，濾液濃縮至膏狀，轉(zhuǎn)移至索氏抽提器中，加入三氯甲烷150 mL，在90℃下回流提取3 h，蒸出溶劑，甲醇充分溶解并定容至50 mL，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，用高效液相色譜分析，記錄峰面積。將分離得到的蓖麻粕重復(fù)上述操作，直至峰面積小于500 mV·sec，將所有峰面積相加，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到蓖麻堿的質(zhì)量濃度c，然后根據(jù)下式計(jì)算蓖麻堿含量。

式中:y為蓖麻堿含量，%;c為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的待測蓖麻堿質(zhì)量濃度，mg/mL;V為提取液體積，mL;m為樣品的質(zhì)量，g。

1.3.4 蓖麻堿提取率計(jì)算

式中:η為蓖麻堿提取率，%;c為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出的待測蓖麻堿質(zhì)量濃度，mg/mL;V為提取液體積，mL;m為樣品的質(zhì)量，g;y為蓖麻堿含量，%。

1.3.5 單因素實(shí)驗(yàn)

以蓖麻堿提取率作為考察指標(biāo)，通過單因素實(shí)驗(yàn)分別研究微波功率(100，200，300，400，500，600 W)、液固比(2，4，6，8，10，12 mL/g)和提取時(shí)間(1，2，3，4，5，6 min)對蓖麻堿提取率的影響，初步確定適宜提取蓖麻堿的相應(yīng)水平范圍。每個(gè)處理3次平行實(shí)驗(yàn)，取平均值。

1.3.6 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取微波功率、液固比和提取時(shí)間3個(gè)因素，采用三因素三水平響應(yīng)面分析的方法優(yōu)化蓖麻堿提取工藝，實(shí)驗(yàn)因素和水平表設(shè)計(jì)見表1。每個(gè)處理平行實(shí)驗(yàn)3次，取平均值。所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Design Expert8.0軟件進(jìn)行分析。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiment

1.3.5 蓖麻堿的抑菌性研究

1.3.5.1 菌種的活化及菌懸液的制備［10］

將3種供試菌分別接入到已滅菌的斜面上，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別挑取一環(huán)已活化好的菌種接種到裝有50 mL LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫培養(yǎng)搖床(160 r/min、37℃)中培養(yǎng)12 h，然后用無菌生理鹽水將3種菌稀釋至濃度約5×106～5×107CFU/mL的菌懸液。

1.3.5.2 抑菌性實(shí)驗(yàn)

蓖麻堿的抑菌性實(shí)驗(yàn)采用參考文獻(xiàn)［11－12］中的方法并略作修改。取直徑為6 mm的濾紙片于121℃、0.1 MPa下濕熱滅菌20 min備用。將已滅菌的濾紙片分別放入濃度為10、5和2.5 mg/mL的蓖麻堿溶液中浸泡30 min。將每個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)倒入15 mL已滅菌的固體培養(yǎng)基，待培養(yǎng)基凝固后，各取供試菌液0.2 mL分別涂布在固體培養(yǎng)基上，制成含菌平板，每種菌的平板貼3片浸過不同濃度的蓖麻堿溶液的濾紙片和1片浸過生理鹽水的濾紙片，對稱放置。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以十字交叉法測量抑菌圈直徑，取平均值，比較蓖麻堿對各種菌的抑菌性。每種菌做3組平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蓖麻堿標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蓖麻堿的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)、峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=21 654.48x+666.08，相關(guān)系數(shù)R2為0.998，呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 蓖麻堿含量測定

重復(fù)測定3次，蓖麻堿含量平均值為0.164 1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.38%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性較好。

表2 蓖麻堿含量測定Table 2 Ricinine content determination

2.3 微波輔助提取蓖麻堿的單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 微波功率對蓖麻堿提取率影響

微波功率對蓖麻堿提取率的影響見圖1。

圖1 微波功率對蓖麻堿提取率影響Fig.1 Effect of microwave power on the extraction rate of ricinine

由圖1可以看出，當(dāng)微波功率較小時(shí)，隨著微波功率的增加，蓖麻堿的提取率上升，當(dāng)微波功率達(dá)到400 W后，蓖麻堿的提取率開始下降。可能是隨著微波功率增加，微波的熱效應(yīng)增強(qiáng)，提取液的溫度升高，增加了固液擴(kuò)散速度，提高了提取率;但是當(dāng)功率過大，使升溫速度過快，可能導(dǎo)致提取液爆沸，造成了提取液的損失，而且功率增加也會增加能耗［13］。因此最適的微波功率為400 W。

2.3.2 液固比對蓖麻堿提取率影響

液固比對蓖麻堿提取率的影響見圖2。由圖2可以看出，隨著液固比的增加，蓖麻堿提取率逐漸上升，液固比超過10后，蓖麻堿提取率幾乎不發(fā)生變化?？赡苁且?yàn)槿軇┝吭龃蠛螅瑵舛忍荻茸兇?，有利于蓖麻堿的溶出;液固比超過10后，再增加液固比，蓖麻堿的提取率也不再增加，表明提取已達(dá)到平衡［14］。因此最適的液固比為10。

圖2 液固比對蓖麻堿提取率影響Fig.2 Effect of material to solvent on the extraction rate of ricinine

2.3.3 提取時(shí)間對蓖麻堿提取率影響

提取時(shí)間對蓖麻堿提取率的影響見圖3。由圖3可以看出，隨著微波提取時(shí)間的延長，蓖麻堿提取率逐漸提高，當(dāng)提取時(shí)間達(dá)到5 min時(shí)，蓖麻堿的提取率達(dá)到最大值，再延長提取時(shí)間，蓖麻堿提取率開始下降?？赡苁请S著提取時(shí)間的不斷延長，環(huán)境溫度不斷上升，促進(jìn)了溶質(zhì)的浸出，當(dāng)提取時(shí)間超過5 min時(shí)，環(huán)境溫度過高，使溶劑沸騰，溶劑量減少，溫度過高也可能導(dǎo)致蓖麻堿分解［15］。因此最適的提取時(shí)間為5 min。與傳統(tǒng)提取方法［16］(熱水提取時(shí)間一般為3～4 h)相比，微波提取法顯著縮短了蓖麻堿的提取時(shí)間。

2.4 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

2.4.1 回歸方程的建立與方差分析

響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表3。運(yùn)用 Design Expert8.0軟件對表3中的17個(gè)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，擬合后得到關(guān)于微波功率(W)、液固比(mL/g)和提取時(shí)間(min)的二次多項(xiàng)式回歸模型為:

蓖麻堿提取率Y%=49.10+0.14 X1+2.53 X2－0.44 X3+0.66 X1X2－2.83 X1X3+1.29 X2X3－

圖3 提取時(shí)間對蓖麻堿提取率影響Fig.3 Effect of extraction time on the extraction rate of ricinine

表3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Results of response surface experiment

該回歸模型及模型系數(shù)顯著性驗(yàn)證結(jié)果見表4。

表4 回歸模型的方差分析Table 4 Variance analysis of regression model

由表4可知，該模型極其顯著(P值＜0.000 1)，決定系數(shù)R2值為0.998 3，表明該模型蓖麻堿提取率的實(shí)驗(yàn)值和擬合值之間具有很好的擬合度。該模型的失擬項(xiàng)P值＞0.10，表明二次模型是合適的。對模型系數(shù)顯著性分析可知，因素X1對蓖麻堿提取率的影響不顯著，X2、X3、X1X2、X1X3、X2X3、X12、X2和X2對蓖麻堿提取率的影響顯著。因素的P值越小，對蓖麻堿提取率的影響越顯著。一次項(xiàng)中各因素對蓖麻堿提取率的影響顯著性大小順序是液固比(X2)＞提取時(shí)間(X3)＞微波功率(X1)。

2.4.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)中各因素交互作用影響

響應(yīng)面優(yōu)化蓖麻堿提取實(shí)驗(yàn)中液固比和微波功率對蓖麻堿提取率的交互作用影響見圖4。從圖4可以看出，提取時(shí)間處于最佳值時(shí)，蓖麻堿提取率隨著微波功率的增大先升高后降低，隨著液固比的增加先快速上升后緩慢上升達(dá)到穩(wěn)定。

圖4 微波功率和液固比對蓖麻堿提取率的響應(yīng)曲面圖Fig.4 Response surface of microwave power，solvent-to-material on the extraction rate of ricinine

響應(yīng)面優(yōu)化蓖麻堿提取實(shí)驗(yàn)中微波功率和提取時(shí)間對蓖麻堿提取率的交互作用影響見圖5。

圖5 微波功率和提取時(shí)間對蓖麻堿提取率的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface of microwave power，solvent-to-material extraction time on the extraction rate of ricinine

從圖5可以看出，液固比處于最佳值時(shí)，蓖麻堿提取率隨著微波功率的增大先升高后降低，隨著提取時(shí)間的延長先升高后降低。

響應(yīng)面優(yōu)化蓖麻堿提取實(shí)驗(yàn)中液固比和提取時(shí)間對蓖麻堿提取率的交互作用影響見圖6。從圖6可以看出，微波功率處于最佳值時(shí)，蓖麻堿提取率隨著提取時(shí)間的延長先升高后降低，隨著液固比的增加先快速上升后緩慢上升達(dá)到穩(wěn)定。

圖6 提取時(shí)間和液固比對蓖麻堿提取率的響應(yīng)曲面圖Fig.6 Response surface of extraction time，solvent-to-material on the extraction rate of ricinine

2.4.3 回歸模型驗(yàn)證

經(jīng)過Box-Behnken設(shè)計(jì)得到微波提取蓖麻堿最優(yōu)工藝條件為:微波功率408.01 W，提取時(shí)間5.21 min，液固比12(mL∶g)。在此工藝條件下蓖麻堿的提取率為50.74%。

考慮到實(shí)際操作的便利，將蓖麻堿的最優(yōu)工藝條件修正為:微波功率408 W，提取時(shí)間5.2 min，液固比12(mL∶g)。在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到蓖麻堿的提取率為50.81%，相對偏差為0.14%，證明該模型是適合有效的。

2.5 蓖麻堿抑菌性結(jié)果

蓖麻堿對各種菌的抑菌作用見圖7。由圖7可知，蓖麻堿對大腸桿菌、淀粉液化芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌都具有抑制作用，且隨著蓖麻堿的濃度增加而增強(qiáng)。蓖麻堿對各菌種的抑菌效果為:大腸桿菌＞淀粉液化芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌。

圖7 蓖麻堿對各種菌種的抑菌作用Fig.7 Antibacterial activity of ricinine on different strains

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以蓖麻粕為原料，以水為提取溶劑，采用微波輔助提取蓖麻堿，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面優(yōu)化了蓖麻堿提取工藝，得到微波提取蓖麻堿的最佳工藝條件為:微波功率408.01 W，提取時(shí)間5.21 min，液固比12(mL∶g)。在此工藝條件下獲得蓖麻堿提取率的理論值為50.74%，通過驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得到實(shí)際提取率為50.81%，相對偏差為0.14%，證明該模型是適合有效的。通過方差性分析可知各因素對蓖麻堿提取率的影響顯著性大小順序是液固比(X2)＞提取時(shí)間(X3)＞微波功率(X1)。采用微波輔助提取法具有比傳統(tǒng)提取方法時(shí)間短的特點(diǎn)。采用濾紙片法測定蓖麻堿的抑菌性，結(jié)果表明蓖麻堿對大腸桿菌、淀粉液化芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌都具有抑制作用，蓖麻堿對各菌種的抑菌效果為大腸桿菌＞淀粉液化芽孢桿菌＞金黃色葡萄球菌。

［1］Severino L S，Auld D L，Baldanzi M，et al.A review on the challenges for increased production of castor［J］.Agronomy journal，2012，104(4):853 －880.

［2］Mutlu H，Meier M A R.Castor oil as a renewable resource for the chemical industry［J］.European Journal of Lipid Science and Technology，2010(112):10 －30.

［3］Cristiane D M C，Jaqueline R B，Vanessa D C D.Highspeed counter-current chromatographic isolation of ricinine，an insecticide from Ricinus communis［J］.Journal of Chromatography A，2009，1 216(19):4 290 －4 294.

［4］張智勇，陳永生，倪娜，等.蓖麻產(chǎn)品在農(nóng)藥中的應(yīng)用及研究進(jìn)展［J］.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)科技，2011(6):74－76.

［5］尚宇光，李淑芬，肖鴦布，等.植物中生物堿的提取工藝［J］. 現(xiàn)代化工，2002，22(S1):51 －54.

［6］Ferraz A C，Angelucci M E M，Da Costa M L，et al.Pharmacological evaluation of ricinine，a central nervous system stimulant isolated from Ricinus communis［J］.Pharmacology Biochemistry ＆ Behavior，1999，63(3):367 －375.

［7］趙光，李珺，張美，等.蓖麻殼水提物的鎮(zhèn)痛作用及成分分析［J］. 藥物分析雜志，2007，27(12):1 928－1 931

［8］張智勇，倪娜，李國瑞，等.蓖麻及其衍生制品在食品工業(yè)中應(yīng)用的研究進(jìn)展［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(22):428－431.

［9］邵建新，鄧樹娥，高景華，等.蓖麻粕的脫毒及營養(yǎng)分析［J］. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2002，12(2):157 －158.

［10］邢美蓮，賈鵬燕，馮冬燕，等.吳茱萸不同溶劑提取物抗氧化和抑菌性研究［J］.作物雜志，2013(6):76－78.

［11］李作美，許暉，曾曉雄.鼎湖鱗傘多糖的抑菌作用及抗氧化活性［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39(11):167－170.

［12］彭登峰，柴春祥，馬玲，等.Mozzarella干酪提取液的抗菌活性［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2013，39(1):92－95.

［13］孔維寶，李陽，白萬明，等.微博輔助提取油橄欖果渣多酚［J］. 食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(4):233－237.

［14］婁在祥，王洪新，呂文平，等.微博輔助提取牛蒡葉多酚及其抗氧化、抗菌活性研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36(1):161 －165.

［15］陳姿含，管驍，李景軍.水溶性大豆多糖的微波浸提工藝優(yōu)化［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)2012，38(10):194－198.

［16］穆莎茉莉，冀照君，張樹軍，等.響應(yīng)面法優(yōu)化蓖麻堿提取工藝［J］.食品工業(yè)科技2012，33(21):206－209.