趙婷，姚粟，徐友強(qiáng)，程池

(中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)

細(xì)菌抗生素耐藥性問題目前引起了國際國內(nèi)的廣泛關(guān)注，成為社會熱點問題［1－3］。2014年，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)根據(jù)114個國家的數(shù)據(jù)進(jìn)行調(diào)查，抗生素耐藥性細(xì)菌正蔓延至全球各地［1］。大量不同種類的細(xì)菌用于食品或飼料的添加或生產(chǎn)，如發(fā)酵劑、益生菌等。這些微生物或微生物的代謝產(chǎn)物最終用于人體和動物，為了避免細(xì)菌抗生素耐藥性向人體或動物的轉(zhuǎn)移風(fēng)險，必須評估這些微生物菌種的抗生素耐藥性。2002年，國際糧農(nóng)組織(Food and Agriculture Organization，F(xiàn)AO)和WHO提出食品中益生菌菌種安全性評價應(yīng)包含抗生素耐藥性檢測［4］。2012年，《美國藥典》(United States Pharmacopeia，USP)和《食品化學(xué)法典》(Food Chemicals Codex，F(xiàn)CC)關(guān)于包含益生菌的食品微生物菌種附錄XV中，提出在菌種安全性評估方面應(yīng)包含耐藥性評估［5］。

歐洲食品安全局(European Food Safety Authority，EFSA)負(fù)責(zé)評估微生物菌種的安全性，安全資格認(rèn)證(Qualified Presumption of Safety，QPS)列表中的微生物菌種，具有長期食用歷史或經(jīng)EFSA專家組科學(xué)評估為食用安全的菌種，其相關(guān)產(chǎn)品在特定用途時，上市前不需要再進(jìn)行廣泛的評估程序。2012年，EFSA更新了相關(guān)法規(guī)［6－7］，提出了食品及飼料工業(yè)用細(xì)菌抗生素耐藥性評估體系，為國際范圍內(nèi)微生物菌種耐藥性評估提供了標(biāo)準(zhǔn)參考方法。2013年，EFSA更新QPS列表［8］，提出將耐藥性鑒定列為微生物菌種通用的安全評估項目，并采用統(tǒng)一的方法進(jìn)行評估。

1 細(xì)菌耐藥性定義

細(xì)菌耐藥性指細(xì)菌對于抗菌藥物作用的耐受性。當(dāng)某一種抗生素耐藥性是細(xì)菌物種所固有的特性時，它通常被稱為“固有耐藥性”，有時稱為“自然耐藥性”，即某一物種其所有菌株都具有該典型特性，相反，當(dāng)一個物種的某個典型敏感菌株對某一種抗生素具有耐藥性，被稱為“獲得性耐藥性”。獲得性耐藥性可能是由于外源基因或原始菌株的自然突變引起［6，9－10］。

2 耐藥性轉(zhuǎn)移

耐藥性轉(zhuǎn)移至人或動物，可能源于使用具有耐藥菌株的微生物產(chǎn)品或遺傳因素?；诤侠淼募僭O(shè)，在開放的環(huán)境如腸胃中，基因可以從一種微生物轉(zhuǎn)移至另外一種微生物，假定固有耐藥性也存在小概率的潛在危害，而插入外源基因的獲得性耐藥性被認(rèn)為具有很高的潛在危害及傳播風(fēng)險［10－11］。

外源基因插入是細(xì)菌間基因交換的結(jié)果。外源基因編碼抗生素耐藥性是存在的，尤其當(dāng)存在轉(zhuǎn)座子時，存在較大的耐藥性傳播風(fēng)險。美國馬里蘭大學(xué)抗生素耐藥性基因數(shù)據(jù)庫ARDB［12］提供抗生素耐藥性基因的檢索、注釋、分析功能，第一版更新至2009年7月，包括抗生素耐藥性基因23 137個，抗生素249種，基因組632個，微生物種1 737個，微生物屬267個。染色體基因突變引起的耐藥性存在較低的耐藥性傳播風(fēng)險［10－11］。原則上，作為食品或飼料添加劑使用的微生物，應(yīng)盡可能地選擇具有最低耐藥性的菌株。

3 抗生素選擇

所有用于食品或飼料添加劑的細(xì)菌必須建立相關(guān)菌株對人體和獸醫(yī)上重要抗生素的敏感性數(shù)據(jù)。另外，測試方法應(yīng)為國際認(rèn)可并標(biāo)準(zhǔn)化的方法?？股氐淖畹鸵志鷿舛?Minimum Inhibitory Concentration，MIC)以mg/L或μg/mL表示，需要測定的抗生素種類包括:氨芐青霉素、慶大霉素、卡那霉素、萬古霉素、鏈霉素、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、氯霉素，在特定的情況下包括泰樂菌素、阿泊拉霉素、萘啶酸、磺酰胺和甲氧芐氨嘧啶(見表1)，這些抗生素涵蓋了廣泛的抗生素種類［8］。

表1 微生物耐藥性截止值(mg/L)Table 1 Microbiological antibiotic resistance cut－off values(mg/L)

4 微生物截止值(cut-off values)

為了從敏感菌株中區(qū)分耐藥菌株，EFSA專家組定義了微生物截止值。微生物截止值的設(shè)置是通過研究同一個分類單元(種或?qū)?細(xì)菌對不同抗生素耐藥性的MIC值分布而得出。其中的一部分MIC值明顯偏離正常敏感菌株的歸類為耐藥菌株。試驗數(shù)據(jù)用于定義微生物截止值，如表1所示，數(shù)據(jù)來自歐洲委員會(European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases，EUCAST)大量微生物菌種樣本對抗生素敏感試驗［13］，該研究獲得了歐洲監(jiān)測項目資金支持。

評估這些作為食品或飼料添加劑使用的細(xì)菌，菌株可以歸類為對抗生素敏感或耐藥。敏感(S):當(dāng)菌株被一定濃度的某種抗生素抑制，該濃度等于或低于已建立的截止值(S≤x mg/L)時，該菌株被定義對該抗生素敏感;耐藥(R):當(dāng)菌株不被一定濃度的某種抗生素抑制，該濃度高于已建立的截止值(S＞x mg/L)時，該菌株被定義為對該抗生素耐藥。

確定的截止值用來從分離菌株中鑒定獲得性耐藥性細(xì)菌菌株，并且具有結(jié)果的一致性，這些截止值只被用來評估微生物相關(guān)產(chǎn)品可能存在的抗生素耐藥性。

5 MIC值測定

為評估細(xì)菌菌株對抗生素的耐藥性，采用瓊脂或肉湯進(jìn)行兩倍梯度稀釋，同時需要質(zhì)控菌株進(jìn)行驗證。測試應(yīng)該執(zhí)行根據(jù)國際公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，如臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)研究院(clinical and laboratory standards institute，CLSI)標(biāo)準(zhǔn)［14－16］、國際標(biāo)準(zhǔn)化組織(international organization for standardization，ISO)標(biāo)準(zhǔn)［17］、德國標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)會(deutsches Institut fǖr Normung，DIN)標(biāo)準(zhǔn)［18］等。經(jīng)培養(yǎng)后，間接定性或半定性方法來確定MIC值，傳統(tǒng)的瓊脂擴(kuò)散方法(Kirby-Bauer，KB)通常是不能接受的?，F(xiàn)有的科學(xué)信息表明，測定特定或相關(guān)細(xì)菌菌株時必須考慮到MIC值測定程序，如稀釋法、生長培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件等，需按照程序操作，避免不同培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件對結(jié)果造成的干擾。

6 基于遺傳基礎(chǔ)的耐藥性

當(dāng)檢測MIC值高于截止值，EFSA專家組確定某菌株對一個或更多的抗生素耐藥時，需要進(jìn)一步調(diào)查以確定是否為自然耐藥性。首先，需要區(qū)分獲得性耐藥性和固有耐藥性。這只會出現(xiàn)在某分類單元MIC值數(shù)據(jù)信息有限或缺乏時，在這些情況下，必須闡明菌株的自然結(jié)構(gòu)和基于遺傳基礎(chǔ)的耐藥性，可選擇該分類單元內(nèi)一些具有代表性的菌株進(jìn)行分析。因為固有耐藥性是特定于細(xì)菌的屬水平或種水平，所以首先需要用分子生物學(xué)的方法將菌株鑒定到種水平，當(dāng)特定分類單元內(nèi)的所有菌株均顯示對某一抗生素具有表型耐藥性，該耐藥性可被認(rèn)為是這一分類單元的固有耐藥性。

當(dāng)一個菌株聲稱與同一分類單元內(nèi)的其他菌株相比對某一抗生素具有更高的耐藥性時，表明存在獲得性耐藥性，這時，需要基于遺傳基礎(chǔ)的抗生素耐藥性相關(guān)信息。唯一的例外是屎腸球菌(Enterococcus faecium)對氨芐青霉素的耐藥性，菌株對氨芐西林MIC＞2 μg/mL時，不適合作為食品或飼料添加劑使用，這是由于醫(yī)院對該菌株進(jìn)行了特殊標(biāo)記［19］。

獲得性耐藥性可能是由于獲得外源基因或原有基因的突變?，F(xiàn)有文獻(xiàn)沒有報道某菌株具有獲得性耐藥基因，并不足以說明該菌株安全。EFSA專家小組提出食品及飼料添加劑菌種的抗生素耐藥性評估方法［8］，如圖1 所示。

任何攜帶固有耐藥性基因的細(xì)菌菌株，具有最小的潛在水平傳播風(fēng)險，因此，可用作食品或飼料添加劑;任何攜帶獲得性耐藥性基因的細(xì)菌菌株，如果是由于染色體突變引起的，具有較低的潛在水平傳播風(fēng)險，一般可用作食品或飼料添加劑;任何攜帶獲得性耐藥性基因的細(xì)菌菌株，如果是由于外源獲得性基因引起的，具有極高的潛在水平傳播風(fēng)險，不能用作食品或飼料添加劑;在缺乏相關(guān)基于遺傳基礎(chǔ)的耐藥性信息時，這些菌株不能用作食品或飼料添加劑。

圖1 食品及飼料添加劑菌種耐藥性評估流程Fig.1 Proposed scheme for the antimicrobial resistance assessment of a microorganism used in food or as a feed additive

對于QPS推薦的細(xì)菌來說，共同特點是不含耐藥性編碼基因。一般情況下QPS認(rèn)為攜帶獲得性耐藥性的菌株不能添加到食品和飼料生產(chǎn)過程中，獲得性耐藥基因不完全列表見表2。

7 EFSA細(xì)菌耐藥性評估體系對我國相關(guān)法規(guī)標(biāo)準(zhǔn)的借鑒意義

菌種耐藥性與菌種毒力、菌種致病性等屬于菌種安全性評價范疇［3］。我國在食品微生物菌種耐藥性由國家食品藥品監(jiān)督管理總局(SFDA)、國家衛(wèi)生與計劃生育委員會(NHFPC)負(fù)責(zé)管理，飼料微生物菌種耐藥性由中華人民共和國農(nóng)業(yè)部(MOA)負(fù)責(zé)管理。

我國出臺的涉及菌種耐藥性評估的法規(guī)包括:2001年，衛(wèi)生部關(guān)于印發(fā)《真菌類和益生菌類保健食品評審規(guī)定的通知》(衛(wèi)法監(jiān)發(fā)［2001］84 號)［20］第五條:“申報真菌類保健食品，除按衛(wèi)生部保健食品申報與受理規(guī)定的要求提交資料外，還應(yīng)提供菌種的安全性評價資料(包括毒力試驗)?！?002年，衛(wèi)生部關(guān)于印發(fā)《以酶制劑等為原料的保健食品評審規(guī)定的通知》(衛(wèi)法監(jiān)發(fā)［2002］100 號)［21］第二條:“使用微生物發(fā)酵直接生產(chǎn)保健食品的，除按保健食品申報與受理的規(guī)定提交相關(guān)資料外，還需提供菌種的安全性評價報告?！?011年，國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)發(fā)布《保健食品良好生產(chǎn)規(guī)范(修訂稿)》征求意見(食藥監(jiān)?；?011］548 號)［22］，生產(chǎn)企業(yè)進(jìn)行保健食品產(chǎn)品申報時，應(yīng)遵循:“菌絲體原料、益生菌類原料和藻類原料采購應(yīng)當(dāng)索取菌株或品種鑒定報告、穩(wěn)定性報告和不含耐藥因子的證明材料?！?013年，衛(wèi)計委印發(fā)《新食品原料申報與受理規(guī)定》和《新食品原料安全性審查規(guī)程》(國衛(wèi)食品發(fā)〔2013〕23 號)［23］第十二條規(guī)定:“安全性評估報告應(yīng)當(dāng)包括微生物耐藥性試驗報告和產(chǎn)毒能力試驗報告”等。

表2 獲得性耐藥基因不完全列表Table 2 Acquired antibiotic resistance gene part of the list

我國菌種耐藥性檢測標(biāo)準(zhǔn)包括:WS/T 125－1999紙片法抗菌藥物敏感試驗標(biāo)準(zhǔn)［24］，SN/T 1944－2007動物及其制品中細(xì)菌耐藥性的測定紙片擴(kuò)散法［25］。兩者均為紙片擴(kuò)散法，還未出臺最低抑菌濃度法(MIC)耐藥性評估方法標(biāo)準(zhǔn)，更未涉及基因水平耐藥性檢測。

食品安全是國際國內(nèi)的熱點問題，受到世界范圍內(nèi)的廣泛關(guān)注。用于食品工業(yè)的微生物菌種的食用安全性也是其重要組成部分。微生物菌種的安全性評價包括菌種耐藥性、菌種毒力、菌種致病性等。在微生物菌種耐藥性評估方面，歐盟、美國等發(fā)達(dá)國家在監(jiān)管、法規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)、技術(shù)體系等方面都位于國際前列，MIC表型檢測與耐藥性基因檢測相結(jié)合是食品及飼料微生物菌種耐藥性評估的趨勢，其對我國微生物菌種耐藥性評估體系的規(guī)范與發(fā)展具有重要借鑒意義。

8 展望

近年來，隨著全基因組測序的發(fā)展，基于全基因組測序挖掘、評估微生物菌種耐藥基因也逐漸開展，2011年，丹麥科漢森公司(Chr.Hansen)［26］通過全基因組測序篩查了28株乳酸菌的獲得性耐藥基因及毒力因子基因，2008年，Heimbach等［27］認(rèn)為蛋白相鄰類聚簇(clusters of orthologous groups，COGs)V可能包含耐藥基因，并分析了羅伊氏乳桿菌(Lactobacillus reuteri)DSM 17938全基因組COGs V。國際上已開發(fā)出 Etest? 、Neo-Sensitabs? 、Yeastone? 、Vitek? 、MIC T strip、VetMICTM等系列耐藥性檢測商業(yè)化衍生產(chǎn)品。我國學(xué)者也在中國傳統(tǒng)發(fā)酵食品細(xì)菌耐藥性評價方面做了有益的嘗試［28－30］，食品種類包括酸奶、腌菜、香腸等，細(xì)菌種類涵蓋乳酸桿菌(Lactobacillus)、嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus)等常見益生菌。課題組2012年采用CLSI M38-A2 MIC方法對保健食品生產(chǎn)菌株產(chǎn)孢小型絲狀真菌蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyces hepiali)進(jìn)行表型耐藥性評估［31］。面對微生物耐藥性可能引起的食品安全問題，相信未來會有越來越多的學(xué)者投入到微生物菌種耐藥性評估研究工作中，EFSA細(xì)菌耐藥性評估體系會持續(xù)更新，酵母、小型絲狀真菌耐藥性評估體系也會逐步建立，共同保障人類食品安全。

［1］World Health Organization.Antimicrobial resistance global report on surveillance［R］.Switzerl and:WHO，［2014 －04－01］.http://www.whoint/documents/surveillancereport/en/2014.

［2］Marina Pana.Antibiotic resistant bacteria-A continuous challenge in the new millennium ［M］.Rijeka，Croatia:In Tech，2012.

［3］CDC.About antimicrobial resistance:A brief overview.Center for Disease Control and Prevention［R］.Atlanta，Georgia:Center for Disease Control and Brevention，2013，http://www.cdc.gov/drugresistance/about.html

［4］FAO/WTO Guidelines for the evaluation of probiotics in food［C］.London Ontwio Joint，Canada:Food and Agriculture Organization(FAO)/World Health Organization(WHO)，Working Group meeting，2002:5 －1.

［5］USP Food Chemicals Codex 8th edition，Appendix XV:Microbial food cultures including probiotics［M］.Rockville，Maryland.The United States Pharmacopeial Convention，2012:1 709－1 715.

［6］Guidance on the assessment of bacterial susceptibility to antimicrobials of human and veterinary importance［J］.EFSA Journal，2012;10(6):2 740.

［7］Guidance for the preparation of dossiers for zootechnical additive，EFSA Panel on additvies and products on substances used in animal feed(FEEDAP)［J］.EFSA Journal，2012，10(1):2 536

［8］Liht T R.Scientific Opinion on the maintenance of the list of QPS biological agents intentionally added to food and feed ［J］.EFSA Journal，2013，11(11):3 449.

［9］Ammor MS，F(xiàn)lorez AB，Mayo B.Antibiotic resistance in non-enterococcal lactic acid bacteria and biofidobacteria［J］.Food Microbiology，2007，24(6):559 －570.

［10］Van Reenen CA，Dicks LM.Horizontal gene transfer amongst probiotic lactic acid bacteria and other intestinal microbiota:What are the possibilities?A review［J］.Archives of Microbiology，2011，193(3):157－168.

［11］Devirgiliis C，Barile S，Perozzi G.Antibiotic resistance determinants in the interplay between food and gut microbiota［J］.Genes＆ Nutrition，2011(6):275－284.

［12］Center for Bioinformatics and Computational Biology Onirersity of Maryland Colledge park.Antibiotic resistance(AR)gene database ARDB.http://ardb.cbcb.umd.edu/

［13］The European Committee on Antimicrobial Susceptibility.EUCAST database，http://www.eucast.org

［14］CLSI M100-S21.Performance standards for antimicrobial susceptibility testing;twenty-first informational supplement［S］.Clinical and Laboratory Standards Institute，2011.

［15］CLSI M38-A2.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of filamentous fungi，Approved standard-Second edition［S］.Clinical and Laboratory Standards Institute，2008.

［16］CLSI M27-A3.Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeasts;Approved standard-Third edition［S］.Clinical and Laboratory Standards Institute，2008.

［17］ISO 10932(=IDF 223).Milk and milk products-Determination of the minimal inhibitory concentration(MIC)of antibiotics applicable to bifidobacteria and non-enterococcal lactic acid bacteria(LAB)［S］.International Organization for Standardization/the International Dairy Federation，2010.

［18］DIN 58940-7.Medical microbiology-Susceptibility testing of microbial pathogens to antimicrobial agents-Part 7:Determination of the minimum bactericidal concentration(MBC)with the method of microbouillondilution［S］.Deutsches Institut fǖr Normung，2009.

［19］Guidance on the safety assessment of Enterococcus faecium in animal nutrition ［J］.EFSA Journal，2012，10(5):2682.

［20］衛(wèi)生部關(guān)于印發(fā)《真菌類和益生菌類保健食品評審規(guī)定的通知》［Z］.衛(wèi)法監(jiān)發(fā)84號，2001.

［21］衛(wèi)生部關(guān)于印發(fā)《以酶制劑等為原料的保健食品評審規(guī)定的通知》［Z］.衛(wèi)法監(jiān)發(fā)100號，2002.

［22］國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)發(fā)布《保健食品良好生產(chǎn)規(guī)范(修訂稿)》征求意見［Z］.食藥監(jiān)保化函548號，2011.

［23］衛(wèi)生部印發(fā)《新食品原料申報與受理規(guī)定》和《新食品原料安全性審查規(guī)程》［Z］.國衛(wèi)食品發(fā)23號，2013.

［24］WS/T 125紙片法抗菌藥物敏感試驗標(biāo)準(zhǔn)［S］.中華人民共和國衛(wèi)生部，1999.

［25］SN/T 1944動物及其制品中細(xì)菌耐藥性的測定紙片擴(kuò)散法［S］.中華人民共和國國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗檢疫總局，2007.

［26］Bennedsen M，Stuer-Lauridsen B，Danielsen M，et al.Screening for antimicrobial resistance genes and virulence factors via genome sequencing［J］.Applied and Environmental Microbiology，2011，77:2 785－2 787.

［27］Heimbach J.Generally Recognized as safe(GRAS)determination of Lactobacillus reuteri strain DSM 17938［Z］.GRAS Notice，2008.

［28］PAN L，HU X，WANG XY.Assessment of antibiotic resistance of lactic acid bacteria in Chinese fermented foods［J］.Food Control，2011，22(8):1 316 －1 321.

［29］ZHOU N，ZHANG JX，F(xiàn)AN MT，et al.Antibiotic resistance of lactic acid bacteria isolated from Chinese yogurts［J］.Journal of Dairy Science，2012，95(9):4 775 －4 783.

［30］Nawaz M，WANG J，ZHOU A，et al.Characterization and transfer of antibiotic resistance in lactic acid bacteria from fermented food products［J］.Current Microbiology，2011，62(3):1 081－1 089.

［31］趙婷，姚粟，李輝，等.CLSI M38-A2稀釋法對蝙蝠蛾擬青霉(Paecilomyces hepiali)的藥敏檢測［J］.微生物學(xué)通報，2012，39(7):965－970.