翟飛紅，王琳琳，韓建榮

1(山西大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山西太原，030006)

2(北京中醫(yī)藥大學(xué) 東方學(xué)院渤海校區(qū)，河北滄州，061108)

巴西蘑菇(Agaricus blazei)，其商品名又為“姬松茸”。其子實(shí)體富含多種有效成分，尤其是其子實(shí)體多糖，具有抗病毒、抗腫瘤等作用［1－2］。雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)為蘑菇屬的著名食用菌，因其擔(dān)子上通常著生2個(gè)擔(dān)孢子而得名。雙孢蘑菇肉質(zhì)肥厚，味道鮮美且熱能低，具有很好的醫(yī)療保健作用［3］。

巴西蘑菇與雙孢蘑菇同屬于蘑菇屬，兩者在栽培方法和技術(shù)上基本相似。除了其子實(shí)體可以利用外，還可以對(duì)其菌絲體的發(fā)酵產(chǎn)物加以利用。目前，已有文獻(xiàn)表明兩者的子實(shí)體均有抗氧化活性［4－6］，對(duì)于菌絲體的研究主要集中在液態(tài)發(fā)酵條件的摸索及氧脅迫條件下菌絲體的生長(zhǎng)狀況［7－8］，而對(duì)其液態(tài)發(fā)酵菌絲體多糖含量和抗氧化活性的研究較少。本文研究了巴西蘑菇和雙孢蘑菇經(jīng)液態(tài)發(fā)酵獲得的菌絲體的多糖含量和抗氧化活性，為開發(fā)利用兩種菌的菌絲體提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌種

巴西蘑菇(Agaricus blazei)和雙孢蘑菇(Agaricus bisporus)由本實(shí)驗(yàn)室提供，保存于馬糞瓊脂培養(yǎng)基中。

1.2 液態(tài)培養(yǎng)基［9］

采用玉米黃豆培養(yǎng)基，配方為:玉米粉20.0 g，黃豆粉10.0 g，酵母粉 2.0 g，蔗糖 20.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO31.0g，(NH4)2SO41.0 g，蒸餾水1 000 mL。

1.3 試劑

DPPH(1，1－二苯基苦基苯肼)，由 Sigma公司生產(chǎn);Ferrozine(菲洛嗪)，由美國(guó) BBI公司生產(chǎn);BHT(2，6－叔丁基－4－甲基酚)，由英國(guó)的 Avocado Research Chemicals 公 司 生 產(chǎn);K3Fe(CN)6、NaH2PO4、Na2HPO4、FeCl3、FeCl2、甲硫氨酸、氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)、EDTA－Na2、核黃素、苯酚、酒石酸鉀鈉、Na2SO3和3，5－二硝基水楊酸(DNS)，均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.4 菌絲球的收集與處理

將貯藏的巴西蘑菇和雙孢蘑菇菌種切塊接種于PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，將活化后的斜面菌種分別切成1 cm×1 cm的小塊，接種于裝有50 mL液態(tài)培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，每瓶接種5塊。接種后在室溫下放置48 h，然后于25℃、150 r/min搖瓶培養(yǎng)7 d。發(fā)酵完畢后，過濾收集菌絲球，并用蒸餾水清洗收集到的菌絲球2次。然后將菌絲球置于培養(yǎng)皿中，60℃烘干至恒重，置于密封瓶中備用。

1.5 抗氧化性物質(zhì)的提取

準(zhǔn)確稱取10 g干燥后的菌絲體，置于研缽中研磨，然后分別加入100 mL的80%乙醇溶液，于25℃、130 r/min的搖床上提取24 h，抽濾，取濾液，濾渣在相同的條件下復(fù)提，合并2次濾液。濾渣烘干后稱重，計(jì)算提取率與初始濃度;濾液在40℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到濃縮液，然后用體積分?jǐn)?shù)80%的乙醇溶液定容，待測(cè)。

1.6 抗氧化性的測(cè)定

1.6.1 DPPH·清除能力［10］

DPPH·是一種穩(wěn)定的自由基，其乙醇溶液為紫色，在517 nm處有最大吸收峰。當(dāng)往DPPH溶液中加入自由基清除劑時(shí)，溶液顏色會(huì)變淺，OD值變小。OD值變小的幅度與DPPH·被清除的程度呈線形關(guān)系，故可用于檢測(cè)自由基被清除的程度。

根據(jù)文獻(xiàn)［10］略做修改。在2 mL不同濃度的樣液中加入2 mL DPPH溶液(0.08 mol/L)，搖勻，靜置30 min，對(duì)照用80%的乙醇溶液代替樣品，空白管為樣品加70%的乙醇(DPPH的溶劑)。517 nm處測(cè)OD值。DPPH·清除能力(W)計(jì)算:

式中:A0為對(duì)照吸光度值;A1為樣品吸光度值;A2為空白吸光度值。

樣品的EC50值根據(jù)其517 nm下的樣品曲線計(jì)算，BHT用作標(biāo)準(zhǔn)。

1.6.2 還原力［11］

當(dāng)溶液中存在還原劑時(shí)，F(xiàn)e3+和鐵氰化物復(fù)合物會(huì)接受還原劑給出的電子轉(zhuǎn)化為Fe2+形式的化合物，進(jìn)而兩者反應(yīng)生成普魯士藍(lán)(Fe4［Fe(CN)6］3)，其在700 nm處有最強(qiáng)吸收峰，溶液顏色會(huì)由黃色變成不同程度的綠色－藍(lán)色，故測(cè)定700 nm處的OD值即可測(cè)定Fe2+濃度。OD值越大，還原力越強(qiáng)。

根據(jù)文獻(xiàn)［11］測(cè)定。在1 mL不同濃度的樣液中分別依次加入2.5 mL磷酸緩沖液(50 mmol/L，pH 7.0)和 2.5 mL鐵氰化鉀溶液(1%)，50 ℃保溫 20 min，然后迅速冷卻，加入 2.5 mL三氯乙酸溶液(10%)，離心，取上清液。1.25 mL上清液中依次加入1.25 mL 蒸餾水和0.25 mL 氯化鐵溶液(0.1%)，混合均勻，靜置10 min，700 nm處測(cè)OD值。

樣品的EC50值根據(jù)其700 nm下的樣品曲線計(jì)算，BHT用作標(biāo)準(zhǔn)。

1.6.3 Fe2+螯合能力［12］

根據(jù)文獻(xiàn)［12］所報(bào)道的方法進(jìn)行了部分修改。在1.6 mL不同濃度的樣液中分別依次加入1.6 mL蒸餾水、0.4 mL FeCl2(0.5 mmol)、0.4 mL 菲洛嗪(0.5 mmol/L)，然后劇烈搖動(dòng)1 min，室溫放置20 min后，562 nm處測(cè)OD值?？瞻坠?A0)用蒸餾水代替樣液。Fe2+螯合能力(M)計(jì)算:

式中:A1為樣品吸光度值;A0為空白吸光度值。

樣品的EC50值根據(jù)其562 nm下的樣品曲線計(jì)算，EDTA用作標(biāo)準(zhǔn)。

1.6.4 O2－·的清除能力［13］

核黃素－蛋氨酸溶液被光照激發(fā)后，核黃素會(huì)與O2反應(yīng)生成O－2·。此時(shí)，生成的自由基會(huì)將NBT還原為甲月朁(CN4H4)，呈藍(lán)色，在560 nm處有特征吸收峰。當(dāng)往溶液中加入超氧陰離子自由基清除劑時(shí)，其OD值會(huì)降低。因此比較加入提取液前后的OD值的變化，可以判斷提取液對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力。

根據(jù)文獻(xiàn)［13］方法略做修改。1 mL磷酸緩沖液(50 mmol/L，pH 7.8)中分別依次加入 0.3 mL 甲硫氨酸溶液(130 mmol/L)、0.3 mL氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT，750 μmmol/L)、0.3 mL EDTA－Na2(100 μmol/L)、0.3 mL 核黃素溶液(20 μmol/L)，混勻后加入 2 mL不同濃度的樣液。在3 000 lX光照下放置20 min后，320 nm處測(cè)OD值。O－2·清除能力(C)計(jì)算:

其中:“A樣品”是指不同濃度樣品的吸光度，“A對(duì)照”是指對(duì)照的吸光度樣品的EC50根據(jù)抗氧化劑活性比例和樣品濃度圖來計(jì)算。

1.7 菌絲球多糖的提取

準(zhǔn)確稱取3 g干燥后的菌絲體，置于研缽中研磨，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，加入60 mL NaOH(1 mol/L)，80 ℃ 水浴4.5 h，5 000 r/min 離心 10 min，取上清液，以相同的方法對(duì)殘?jiān)M(jìn)行復(fù)提。合并2次濾液，70℃旋轉(zhuǎn)濃縮，得濃縮液。向濃縮液中加入3倍體積的95%乙醇，靜置6 h，5 000 r/min離心10 min，取沉淀，將沉淀用蒸餾水定容至50 mL，備用。

1.8 多糖含量的測(cè)定

1.8.1 總糖含量的測(cè)定

采用苯酚－硫酸法［14］。將定容至50 mL的樣品液稀釋50倍，吸取1 mL，然后加入1 mL蒸餾水，1 mL苯酚(6.0%)及5 mL 濃 H2SO4，靜置 10 min，搖勻，室溫下放置20 min，490 nm處測(cè)OD值。空白對(duì)照用蒸餾水代替樣品液。

1.8.2 還原糖含量的測(cè)定

采用 3，5－二硝基水楊酸法［15］。吸取定容至 50 mL的樣品液各2 mL，加入1 mL蒸餾水，3 mL DNS，加熱并煮沸7 min，迅速用流水冷卻至室溫，550 nm處測(cè)OD值?？瞻讓?duì)照用蒸餾水代替樣品液。

1.8.3 多糖含量的計(jì)算

多糖含量/%=總糖含量/%－還原糖含量/%

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS軟件(版本18.0)Duncan多重比較法［16］進(jìn)行多個(gè)均數(shù)間的兩兩比較和T檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPPH·清除能力的比較

從圖1可以看出，當(dāng)巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球提取液的濃度從3 mg/mL提高到15 mg/mL時(shí)，二者的DPPH·清除能力也逐漸增強(qiáng)。當(dāng)濃度為3 mg/mL和6 mg/mL時(shí)雙孢蘑菇菌絲球提取液的DPPH·清除能力要高于巴西蘑菇，且差異顯著;當(dāng)提取液濃度為9、12、15 mg/mL時(shí)，雙孢蘑菇菌絲球提取液的清除能力仍高于巴西蘑菇，但差異不顯著，而且隨著濃度的升高，兩者差異逐漸變小;當(dāng)提取液濃度為15 mg/mL時(shí)，雙孢蘑菇對(duì)DPPH·的清除率為88.4%，巴西蘑菇為86.97%。

圖1 巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球提取液的DPPH·清除能力Fig.1 Scavenging effect on DPPH radical of Agaricus blazei and Agaricus bisporus’s mycelial pellets

2.2 還原力的比較

由圖2可以看出，當(dāng)菌絲球提取液的濃度從3 mg/mL提高到15 mg/mL時(shí)，二者的還原力均逐漸增強(qiáng)，且巴西蘑菇的還原力高于雙孢蘑菇。當(dāng)濃度較低時(shí)，兩種菌的還原力差異不顯著，當(dāng)濃度增加到15 mg/mL時(shí)，兩種菌的還原力有顯著性差異。

2.3 Fe2+螯合能力的比較

從圖3可以看出，當(dāng)菌絲球提取液濃度從3 mg/mL提高到15 mg/mL時(shí)，巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球提取液的Fe2+螯合能力均逐漸增強(qiáng)，巴西蘑菇菌絲球提取液在各個(gè)濃度下的Fe2+螯合能力分別是雙孢蘑菇的 5.18、2.01、1.79、1.35、1.28 倍。當(dāng)濃度為 15 mg/mL時(shí)，巴西蘑菇菌絲球提取液的Fe2+螯合能力可達(dá)到86.38%，而雙孢蘑菇僅為66.56%。由此可得，巴西蘑菇菌絲球提取液的Fe2+螯合能力高于雙孢蘑菇，且差異極顯著。

圖2 巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球提取液的還原力Fig.2 Reducing power of Agaricus blazei and Agaricus bisporus’s mycelial pellets

圖3 巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球提取液的Fe2+螯合能力Fig.3 Ferrous Ions’chelating capacity of Agaricus blazei and Agaricus bisporus’s mycelial pellets

2.4 O－2·清除能力的比較

從圖4可知，當(dāng)菌絲球提取液濃度從3 mg/mL提高到15 mg/mL時(shí)，巴西蘑菇與雙孢蘑菇的O－2·清除能力均逐漸增強(qiáng);當(dāng)濃度較低時(shí)，巴西蘑菇菌絲球提取液的O－2·清除能力要顯著高于雙孢蘑菇，當(dāng)濃度增大至15 mg/mL時(shí)，兩種菌差異不顯著。由此可得，兩種菌對(duì)超氧陰離子均有一定的清除能力，而且巴西蘑菇菌絲球提取液的O－2·清除能力要高于雙孢蘑菇。

2.5 抗氧化性各指標(biāo)EC50值的比較

由表1可以看出，對(duì)于還原力，巴西蘑菇的EC50值遠(yuǎn)低于雙孢蘑菇的(僅為其36.8%);對(duì)于Fe2+螯合能力，巴西蘑菇的EC50值也明顯低于雙孢蘑菇，其EC50值為雙孢蘑菇的46.5%;對(duì)于O－2·的清除能力，巴西蘑菇的EC50值略低于雙孢蘑菇，其EC50值為雙孢蘑菇的86.0%;而對(duì)于DPPH·的清除能力，巴西蘑菇的EC50值則高于雙孢蘑菇(其EC50值為雙孢蘑菇的1.6倍)。經(jīng)T檢驗(yàn)，巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球提取液各抗氧化活性指標(biāo)的EC50值差異顯著。綜上所述，巴西蘑菇菌絲球提取液的抗氧化活性要明顯高于雙孢蘑菇菌絲球提取液的抗氧化活性。

圖4 巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球提取液清除能力的比較Fig.4 Superoxide anion’s scavenging capacity of Agaricus blazei and Agaricus bisporus’s mycelial pellets

表1 巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球抗氧化活性各指標(biāo)EC50值的比較Table 1 Comparison of EC50index of antioxidant activity between Agaricus blazei and Agaricus bisporus’s mycelial pellets

2.6 多糖含量的比較

由表2可以看出，巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球的多糖含量差異顯著，巴西蘑菇菌絲球的多糖含量達(dá)到9.85%，而雙孢蘑菇菌絲球的多糖含量為8.42%。巴西蘑菇菌絲球的多糖含量要比雙孢蘑菇高16.98%。

表2 巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲球多糖含量的比較Table 2 Comparison of polysaccharides content between Agaricus blazei and Agaricus bisporus’s mycelial pellets

3 討論

結(jié)果表明，巴西蘑菇和雙孢蘑菇菌絲球提取液均具有一定的抗氧化活性，且巴西蘑菇的抗氧化活性和多糖含量均明顯要高于雙孢蘑菇。

目前，對(duì)食用菌多糖的研究主要集中在其子實(shí)體上，研究表明:香菇子實(shí)體為3.53%，大杯傘(Clitocybe maxima)子實(shí)體為0.23%，金針菇(Flammulina velutiper)子實(shí)體為1.65%，茶樹菇(Agrocybe aegirit)子實(shí)體為0.92%，雞腿菇(Copyinds comatus)子實(shí)體為2.28%［17］，巴西蘑菇子實(shí)體多糖含量為 6.34%［18］，雙孢蘑菇多糖含量為3.38%［19］，而對(duì)于菌絲體多糖的研究較少。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:巴西蘑菇和雙孢蘑菇菌絲體的多糖含量分別為9.85%和8.42%，均高于文獻(xiàn)報(bào)道的巴西蘑菇和雙孢蘑菇子實(shí)體的多糖含量。巴西蘑菇與雙孢蘑菇菌絲體的多糖含量也比香菇、大杯傘、金針菇、茶樹菇和雞腿菇等子實(shí)體的多糖含量高。這從一個(gè)角度證明了巴西蘑菇和雙孢蘑菇菌絲體具有很好的開發(fā)利用價(jià)值。有文獻(xiàn)報(bào)道表明采用不同的多糖提取工藝，多糖的提取率會(huì)有較大的差異，如平菇破碎法提取多糖得率為11.20%，超聲法提取多糖得率為9.75%，超聲輔助復(fù)合酶法提取多糖得率為12.05%［20］，水提法多糖得率為6.48%［21］，說明提取工藝對(duì)多糖得率以及多糖含量的測(cè)定結(jié)果有較大的影響。本實(shí)驗(yàn)只用一種方法對(duì)巴西蘑菇和雙孢蘑菇菌絲體的多糖進(jìn)行了提取，下一步有必要借鑒對(duì)子實(shí)體的處理方式嘗試采用其他方法進(jìn)行多糖提取，或許能進(jìn)一步提高兩種菌絲體的多糖得率。

對(duì)于食用菌抗氧化活性的研究主要集中在子實(shí)體及其多糖抗氧化活性上。巴西蘑菇子實(shí)體的DPPH·清除能力的EC50值為2.378 mg/mL，還原力的EC50值為2.269 mg/mL，F(xiàn)e2+螯合能力的 EC50值為2.788 mg/mL［22］，這些數(shù)據(jù)表明巴西蘑菇子實(shí)體的抗氧化性明顯高于巴西蘑菇菌絲體的抗氧化活性。一般來說，食用菌子實(shí)體或菌絲體所含的多糖也有較高的抗氧化活性［23－24］，也就是說食用菌子實(shí)體或菌絲體的抗氧化活性會(huì)受到多糖含量的影響。對(duì)于食用菌子實(shí)體來說，一般含有較多的活性肽、核苷酸、黃酮類、萜類物質(zhì)，而這些物質(zhì)具有較強(qiáng)的抗氧化活性［25］，這些物質(zhì)也必然會(huì)影響到子實(shí)體的抗氧化活性。所以，如果要徹底闡明巴西蘑菇子實(shí)體的抗氧化活性比菌絲體的抗氧化活性更強(qiáng)的原因，有必要對(duì)巴西蘑菇菌絲體的活性肽、核苷酸、黃酮類及萜類等物質(zhì)進(jìn)行深入分析。

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