楊小萍，岳思君，徐春燕，蘇建宇

(寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，西部特色生物資源保護(hù)與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，寧夏銀川，750021)

蛹蟲草(Cordyceps militaris)又稱北冬蟲夏草，屬麥角菌科(Clavicipitaceae)蟲草菌屬(Cordyceps)［1］，其活性成分和藥理作用與冬蟲夏草相似［2－5］，具有補(bǔ)肺益腎、滋補(bǔ)強(qiáng)身、抗癌、抗疲勞、抗衰老、提高免疫力等功效［6］，其中尤以蟲草菌素、蟲草酸和蟲草多糖的藥用價(jià)值最為顯著［7］。

研究表明，枸杞能促進(jìn)蛹蟲草的生長(zhǎng)和有效成分的積累，使蛹蟲草的產(chǎn)量得到提高、保健功能得到增強(qiáng)［8］。同時(shí)，蟲草對(duì)枸杞中的糖類、蛋白質(zhì)、纖維等物質(zhì)的利用，以及在代謝過程中對(duì)一些重要的有效成分進(jìn)行轉(zhuǎn)化，有助于提高枸杞活性成分在復(fù)合制劑中的功效［9］。本文在蛹蟲草液體培養(yǎng)不同時(shí)期加入以不同方式獲取的枸杞汁，對(duì)其復(fù)合發(fā)酵工藝進(jìn)行研究，并對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物有效成分含量及清除羥自由基能力進(jìn)行比較分析，以期開發(fā)出一種兼具蟲草和枸杞二者活性物質(zhì)的發(fā)酵制品。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種

蛹蟲草(Cordyceps militaris 14013)，購(gòu)買自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 枸杞

市售寧夏中寧枸杞。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基:NaNO33 g，K2HPO41 g，KCl 0.5 g，Mg-SO40.5 g，F(xiàn)eSO40.01 g，蔗糖30 g，水1 000 mL，pH 6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基:NaNO33 g/L，K2HPO41 g/L，KCl 0.5 g/L，MgSO40.5 g/L，F(xiàn)eSO40.01 g/L，另添加一定量的枸杞汁，并根據(jù)加入枸杞汁的含糖量添加蔗糖使其終濃度為30 g/L，pH 6.0。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 蛹蟲草搖瓶發(fā)酵

種子培養(yǎng):從試管斜面中切取約1 cm2帶培養(yǎng)基的斜面菌絲，接入裝有75 mL種子培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中，25℃、150 r/min 培養(yǎng) 4 d。

蟲草枸杞復(fù)合發(fā)酵:500 mL搖瓶中裝入150 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，接種量10%，25℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)。

1.3.2 枸杞汁的制備

枸杞水提液制備:稱取枸杞10 g，洗凈，加6倍水浸泡1 h后，煮沸30 min，倒出枸杞汁，再在枸杞渣中補(bǔ)加適量的水，煮沸20 min，合并枸杞汁，過濾，定容至1 000 mL。以3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定枸杞汁中的糖含量。

枸杞勻漿液制備:稱取枸杞10 g，洗凈，加6倍水浸泡1h后，榨汁機(jī)粉碎，紗布過濾得勻漿液，再在枸杞渣中補(bǔ)加適量的水，重復(fù)打磨2次。合并枸杞汁，過濾，定容至1 000 mL，制備成濃度為10 g/L的枸杞勻漿液。按上述方法分別制備20、30和40 g/L的枸杞勻漿液。以3，5-二硝基水楊酸法測(cè)定枸杞汁中的糖含量。

1.3.3 發(fā)酵產(chǎn)物干重的測(cè)定

取一定量的搖瓶發(fā)酵液，4 000 r/min離心20 min，棄上清液，水洗，重復(fù)數(shù)次，至上清液為無色。收集沉淀，于80℃烘至恒重，在干燥器中冷卻至常溫，稱重并研磨成細(xì)粉，重復(fù)5次。

1.3.4 蟲草素的提取與測(cè)定

微波提取法［10］:精確稱取0.1 g發(fā)酵產(chǎn)物，加入20 mL蒸餾水中，微波處理60 s，功率200 W，過濾，濾液定容至250 mL，各組重復(fù)3次。用紫外分光光度法［11］測(cè)定蟲草素含量。

1.3.5 蟲草酸的提取與測(cè)定

精確稱取0.2 g發(fā)酵產(chǎn)物，加入20 mL 70%的乙醇中，微波處理80 s，功率200 W。過濾，蒸餾水洗滌殘?jiān)瑢V液、洗液合并于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，從中吸取1.0 mL于100 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，作為待測(cè)樣品，各組重復(fù)3次。用紫外分光光度法測(cè)定蟲草素含量。

1.3.6 多糖的提取與測(cè)定

熱水浸提法［12］:稱取發(fā)酵產(chǎn)物0.5 g，加入15 mL蒸餾水中，70℃水浴浸提2.5 h。提取液10 000 r/min離心10 min，上清液定容至15 mL，吸取1 mL，稀釋至250 mL，為待測(cè)樣品，各組重復(fù)3次。用苯酚硫酸法［16］測(cè)定胞內(nèi)多糖含量。

1.3.7 發(fā)酵產(chǎn)物清除羥自由基能力測(cè)定

采用羥自由基測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)，按照說明書中方法測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞汁制備方式的選擇

為了確定復(fù)合發(fā)酵過程中枸杞汁適宜的制備方式，分別取75 mL 10 g/L的枸杞水提液和枸杞勻漿液加入75 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，使培養(yǎng)基中枸杞汁濃度分別為5g/L。以不添加枸杞汁為對(duì)照，發(fā)酵168 h，每24 h取樣測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物干重，結(jié)果如圖1所示。

圖1 蟲草生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of Cordyceps militaris

由圖1可知，不添加枸杞汁時(shí)，蛹蟲草培養(yǎng)48 h后進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，96 h時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物干重達(dá)到最大為5.50 g/L，并在96～144 h基本保持不變，144 h后發(fā)酵產(chǎn)物干重開始下降，生長(zhǎng)進(jìn)入衰亡期。生長(zhǎng)期菌體平均生長(zhǎng)速率為0.16 g/h。

培養(yǎng)基中添加枸杞水提液，蛹蟲草培養(yǎng)24 h后進(jìn)入快速生長(zhǎng)，96 h時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物干重達(dá)7.00 g/L，120 h時(shí)獲得最大發(fā)酵產(chǎn)物干重為7.60 g/L，144 h后進(jìn)入衰退期。生長(zhǎng)期菌體平均生長(zhǎng)速率為0.20 g/h。

培養(yǎng)基中添加枸杞勻漿液，蛹蟲草培養(yǎng)24 h后進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，96 h時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物干重達(dá)7.60 g/L，144 h時(shí)獲得最大發(fā)酵產(chǎn)物干重為8.20 g/L，168 h后進(jìn)入衰退期。生長(zhǎng)期菌體平均生長(zhǎng)速率為0.24 g/h。

結(jié)果表明，培養(yǎng)基中添加枸杞汁可以提高菌體生長(zhǎng)速率，增加發(fā)酵產(chǎn)物干重。其中添加枸杞水提液發(fā)酵產(chǎn)物干重較對(duì)照增加38.18%，添加枸杞勻漿液菌體最高發(fā)酵產(chǎn)物干重較對(duì)照增加49.09%。由于枸杞勻漿液較多地保留了枸杞的成分，對(duì)蛹蟲草生長(zhǎng)的促進(jìn)作用更為明顯，且制備簡(jiǎn)便，便于工業(yè)化生產(chǎn)，因此，蟲草-枸杞復(fù)合發(fā)酵過程中枸杞汁的制備方式以勻漿法更為適宜。

2.2 枸杞汁添加量的確定

按1.2所述，分別添加濃度為10、20、30和40 g/L的枸杞勻漿液配制發(fā)酵培養(yǎng)基，使發(fā)酵培養(yǎng)基中枸杞汁濃度分別為5、10、15和20 g/L，以不添加為對(duì)照，搖瓶發(fā)酵144 h，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物干重和蟲草有效成分含量，結(jié)果如圖2和圖3所示。

圖2 添加不同濃度枸杞汁的發(fā)酵產(chǎn)物干重Fig.2 Fermentation product dry weight with adding different concentrations of Lycium barbarum juice

培養(yǎng)基中枸杞勻漿液濃度為10 g/L時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物干重最大為7.60 g/L，較對(duì)照提高了37.43%，濃度為5 g/L時(shí)次之，為6.23 g/L，較對(duì)照提高了12.66%。

培養(yǎng)基中添加10 g/L枸杞勻漿液時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物蟲草素含量顯著增加，為13.18 mg/g，較對(duì)照增加了52.48%，其他添加5 g/L和20 g/L的枸杞勻漿液則無顯著變化。

培養(yǎng)基中枸杞勻漿液濃度為5 g/L時(shí)發(fā)酵產(chǎn)物多糖含量顯著增加，為19.29 mg/g，較對(duì)照提高了23.81%，10 g/L枸杞勻漿液則無顯著變化。

圖3 添加不同濃度枸杞汁的蟲草有效成分含量Fig.3 Active ingredients contents of Cordyceps militaris with adding different concentrations of Lycium barbarum juice

與對(duì)照組相比，隨著枸杞勻漿液濃度的增加，蟲草酸含量逐漸降低，枸杞勻漿液濃度為5 g/L時(shí)蟲草酸含量與對(duì)照組相當(dāng)。

綜合考慮發(fā)酵產(chǎn)物干重和產(chǎn)物有效成分含量，枸杞勻漿液的最適添加濃度應(yīng)為5 g/L。

2.3 枸杞汁添加時(shí)期的確定

由蟲草生長(zhǎng)曲線(圖1)可知，培養(yǎng)基中添加枸杞勻漿液后，蛹蟲草培養(yǎng)至24～96 h時(shí)進(jìn)入快速生長(zhǎng)期，96 h后蟲草生長(zhǎng)進(jìn)入穩(wěn)定期。為保證枸杞汁的充分利用與轉(zhuǎn)化，選擇在蟲草進(jìn)入快速生長(zhǎng)期之前和之中(即蟲草發(fā)酵第0、24、48和72 h)加入枸杞勻漿液。發(fā)酵培養(yǎng)基中枸杞汁濃度為5 g/L，根據(jù)加入枸杞汁的含糖量添加蔗糖使其終濃度為30 g/L。發(fā)酵144 h，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物干重和蟲草有效成分含量，結(jié)果如圖4和圖5所示。

圖4 枸杞液不同加入時(shí)期的發(fā)酵產(chǎn)物干重Fig.4 Fermentation product dry weight with adding Lycium barbarum juice in different period

由圖4可知，枸杞勻漿液的添加時(shí)期對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物干重有顯著影響(P＜0.05)，發(fā)酵48 h加入枸杞勻漿液時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量最大為13.04 g/L，較蟲草菌絲體提高了135.80%，發(fā)酵72 h時(shí)加入次之，發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量為11.73 g/L，較蟲草菌絲體提高了112.12%。

圖5 枸杞液不同加入時(shí)期的蟲草有效成分含量Fig.5 Active ingredients contents of Cordyceps militaris with adding Lycium barbarum juice in different period

由圖5可知，枸杞勻漿液的添加時(shí)期對(duì)產(chǎn)物蟲草素含量無顯著影響(P＞0.05)，但對(duì)產(chǎn)物蟲草酸和多糖含量影響顯著(P＜0.05)，在發(fā)酵第72 h時(shí)加入枸杞勻漿液，產(chǎn)物蟲草酸和多糖含量均為最大，分別為178.21和30.73 mg/g。

綜合考慮發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量和有效成分含量，在發(fā)酵第72 h時(shí)加入枸杞勻漿液最為有利，在此工藝條件下發(fā)酵144 h，復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量可達(dá)11.73 g/L，較蟲草菌絲體升高了112.12%。其中蟲草素含量達(dá)11.23 mg/g，蟲草酸含量178.21 mg/g，多糖含量達(dá)30.73 mg/g，分別較蟲草菌絲體升高了29.98%、64.46%和97.20%。

2.4 蟲草枸杞復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)物清除羥自由基能力

按照以上復(fù)合發(fā)酵工藝發(fā)酵144 h，對(duì)復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)物清除OH·能力進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖6所示。從圖6中OH·清除能力可以看出，復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)物清除OH·能力為39 643 U/g，介于枸杞和單純蟲草粉之間，比未添加枸杞勻漿液的蟲草粉提高了44.62%。枸杞富含枸杞多糖，其清除OH·能力最高，為50 126 U/g。對(duì)比圖6中每升發(fā)酵液所含或者所獲取樣品的OH·清除能力可以發(fā)現(xiàn)，由于配制發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)每升發(fā)酵培養(yǎng)基中添加的枸杞為5.00 g，而蟲草發(fā)酵和復(fù)合發(fā)酵所獲得的產(chǎn)物產(chǎn)量分別為5.53 g/L和11.73 g/L，使得從每升發(fā)酵液中獲得的復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)物具有最高的OH·清除能力。進(jìn)一步比較發(fā)現(xiàn)，復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)物的OH·清除能力(46 501 U/L)顯著高于蟲草粉和枸杞的加和(39 588 U/L)，由此說明復(fù)合發(fā)酵過程中可能發(fā)生了有效物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化。綜上，培養(yǎng)基中添加枸杞勻漿液在提高發(fā)酵產(chǎn)物干重和有效成分含量的同時(shí)，顯著提高了發(fā)酵產(chǎn)物清除OH·能力，提示復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)物具有更好的抗氧化性。

圖6 三種樣品清除羥自由基能力比較Fig.6 Comparison of hydroxyl radical scavenging activities of the three samples

3 結(jié)論

通過對(duì)蛹蟲草液體發(fā)酵過程中添加枸杞汁的研究，確定了蟲草枸杞復(fù)合發(fā)酵工藝條件為:以勻漿法制備枸杞汁，培養(yǎng)基中枸杞汁濃度5 g/L，發(fā)酵72 h時(shí)添加，發(fā)酵周期144 h，復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量達(dá)11.73 g/L，較蟲草菌絲體升高了112.12%。其中蟲草素含量為11.23 mg/g，蟲草酸含量為178.21 mg/g，多糖含量為 30.73 mg/g，較蟲草菌絲體分別提高了29.98%，64.46%和97.20%，同時(shí)，復(fù)合發(fā)酵產(chǎn)物清除OH·能力較蟲草菌絲體提高了44.62%。

蟲草枸杞復(fù)合發(fā)酵工藝的確定對(duì)開發(fā)兼具蟲草和枸杞二者活性物質(zhì)的新型功能發(fā)酵制品具有重要的參考意義。

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