馬騰臻，楊學山，張莉，張彥芳，李潁，祝霞，王婧，韓舜愈

1(甘肅農業(yè)大學，甘肅 蘭州，730070)2(甘肅省葡萄與葡萄酒工程學重點實驗室，甘肅蘭州，730070)3(甘肅省葡萄酒產業(yè)技術研發(fā)中心，甘肅蘭州，730070)

香氣是葡萄酒的重要感官質量指標之一。萜烯、C13-降異戊二烯衍生物等品種香氣化合物決定了葡萄酒的品種典型性和產地風格，這些物質主要以無味的糖苷鍵合態(tài)形式存在，可在釀造過程中通過酶水解或者酸水解作用轉變?yōu)橛坞x態(tài)，從而增強葡萄酒品種香［1－2］。

β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase EC 3.2.1.21，βG)可水解糖苷鍵合態(tài)風味前體物，是進行葡萄酒風味修飾的關鍵酶［3］。葡萄酒中的糖苷酶可來源于葡萄果實、商品酶制劑(多源于絲狀真菌)、酵母(釀酒酵母和非釀酒酵母)及乳酸菌［4］，釀造過程中酵母來源β-葡萄糖苷酶對鍵合態(tài)香氣化合物的釋放起著重要作用［5－6］，可使發(fā)酵后酒的品種風味特征得到有效表達［1］。

β-葡萄糖苷酶活性測定方法主要有電化法、熒光法和分光光度法，其中以對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)為反應底物的比色法最為普遍，該方法操作簡單、快速、靈敏度高、重現性好［7］。但由于不同來源β-葡萄糖苷酶酶學性質有較大差異，使得測定結果受反應時間、溫度、pH和底物濃度等條件的影響，不僅降低了數據的準確性，更不利于研究結果間的比較分析。

本試驗以甘肅河西走廊地區(qū)葡萄酒廠常用，且經前期篩選具有較高β-葡萄糖苷酶活性的紅佳釀酵母為試材，通過單因素及正交試驗優(yōu)化酶活測定條件，分析其產酶特性，以期為高產β-葡萄糖苷酶酵母菌株篩選及葡萄酒品種香氣調控研究提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

商品釀酒酵母:紅佳釀Vintage Red(VR)，意大利 Enartis公司;Levuline BRG，Lavin QA23，Lavin ICV D254，Lavin RC212，法國 Lallemand 公司;Fermicru VR5，Fermicru LVCB，荷蘭 DSM Food Specialties公司;VL1，法國 Laffort公司;Bayanus(BAY)，XR，法國Lamothe-Abiet公司;Elegance(ELE)，AWRI 796，澳大利亞Maurivin公司。(注:括號內為文中所用菌株的代碼)。

p-NPG(4-Nitrophenyl β-D-glucopyranoside，純度＞98%)，美國Sigma公司;蛋白胨，酵母浸粉，北京奧博星生物技術有限責任公司;對硝基苯酚(p-NP)，葡萄糖，無水Na2HPO4，檸檬酸，無水Na2CO3等均為國產分析純。

YPD液體培養(yǎng)基:葡萄糖20 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母浸粉10 g/L，超純水，pH 5.0;121℃滅菌20 min。

1.2 主要儀器與設備

CP214電子天平，上海奧豪斯儀器有限公司;HH-S型恒溫水浴鍋，金壇市恒豐儀器制造有限公司;Genesis 10s紫外可見分光光度計，美國Thermo Scientific公司;GZX-GF101-Ⅱ電熱恒溫鼓風干燥箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司;18100摩爾超純水機，重慶摩爾水處理設備有限公司;H2050R臺式高速冷凍離心機，長沙湘儀離心機儀器有限公司;NRY-200空氣恒溫搖床，上海南榮實驗室設備有限公司;SWCJ-2FD潔凈工作臺，蘇凈集團蘇州安泰空氣技術有限公司;SPX-150-Ⅱ生化培養(yǎng)箱，上海躍進醫(yī)療器械有限公司;SYQ-DSX-280B手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠;單道移液器，德國Eppendorf公司;PHS-3C pH計，上海雷磁有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株活化與培養(yǎng)

按推薦用量(0.2 g/L)稱取于4℃保存的紅佳釀酵母，接種至50倍體積的YPD液體培養(yǎng)基中，37℃活化20 min?；罨蟮木杲臃N至含有20 mL YPD培養(yǎng)基的50 mL搖瓶中，28℃，180 r/min，培養(yǎng)48 h，每個樣品重復2次。

1.3.2 標準曲線繪制

準確稱取對硝基苯酚(p-NP)139.0 mg，溶解于蒸餾水并定容至 1 000 mL，分別吸取0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL 于 10 mL 容量瓶中，用 1 mol/L Na2CO3溶液定容后混勻，以蒸餾水為空白，于400 nm處測定吸光值并繪制標準曲線。

1.3.3 β-葡萄糖苷酶活性測定條件優(yōu)化

1.3.3.1 酶活測定

將細胞培養(yǎng)液于 8 000 g，4℃條件下離心10 min，收集上清液。取上清液 100 μL，加入 200 μL p-NPG(5 mmol/L溶于pH 5.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中，P-C緩沖液)混勻，50℃反應30 min，立即加入2 mL 1mol/L Na2CO3終止反應并顯色，于400 nm下測定吸光值［8］。摩爾消光系數為:ε=18 300 m－1·cm－1［9］。

1.3.3.2 單因素試驗設計

以酶活力為評價指標，研究反應時間、反應溫度、底物濃度和緩沖液pH等因素在不同水平條件下對酶活力的影響，平行重復3次，單因素試驗的不同水平見表1。

表1 單因素試驗選取的不同水平Table 1 Levels of single-factor tests

1.3.3.3 正交試驗優(yōu)化

在單因素試驗的基礎上，確定正交試驗因素和水平，進行L9(34)正交試驗，優(yōu)化測活條件，結果取3次重復的平均值，見表2。

1.3.4 產酶特性研究

1.3.4.1 不同釀酒酵母菌株β-葡萄糖苷酶活性比較

酵母糖苷酶存在于細胞外，完整細胞(也稱細胞表面)和細胞內(也有學者認為只有胞外酶和完整細胞酶2種存在形式［10］)，但只有胞外酶和完整細胞酶才能水解糖苷鍵合態(tài)香氣前體物，胞內酶則不起作用［11］。發(fā)酵結束后，酵母細胞在重力作用下沉降，作為酒泥除去，而胞外糖苷酶活性則可維持較長時期［12－13］，對增強葡萄酒風味具有重要作用。

為衡量不同酵母產酶能力，以12株常用商品釀酒酵母為研究對象，測定其胞外及完整細胞酶活，操作流程見圖1［8］。

圖1 樣品處理流程圖Fig.1 Flow diagram for sample processing

胞外酶:以各菌株加熱滅活后的上清液為空白，用經正交試驗優(yōu)化的反應條件進行測定。

完整細胞酶:以經加熱滅活的細胞溶液為空白，參照胞外酶方法進行測定。胞外酶與完整細胞酶之和為總酶活［14］。

1.3.4.2 生長及產酶曲線

參照1.3.1中方法培養(yǎng)紅佳釀酵母，每4 h取樣，測定OD600值和胞外酶酶活，繪制生長及產酶曲線。

1.4 酶活力計算

式中:U為酶活力單位，U/mL;c為對硝基苯酚的濃度;V為反應體系的體積;N為稀釋倍數;t為反應時間;0.1為所取上清液或細胞液的體積。

β-葡萄糖苷酶酶活力單位(U)定義為，在上述反應條件下，1 min內底物被釋放出1 μmol的p-NP所需要的酶量。

1.5 數據處理方法

所有平均值數據經過IBM SPSS statistics 18軟件進行分析，數據以結果±標準差SD表示。

2 結果與分析

2.1 對硝基苯酚標準曲線

以對硝基苯酚濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標繪制標準曲線，結果如圖2所示，得線性回歸方程、相關系數分別為:Y=19.882x+0.001 7，R2=0.999 8。

圖2 對硝基苯酚標準曲線Fig.2 Calibration curve for p-nitrophenol assay

2.2 單因素試驗結果分析

2.2.1 反應時間對酶活性的影響

由圖3可以看出，隨著反應時間的延長，酶活性先降低，后趨于平緩，但差異不顯著。這是由于當反應體系中酶濃度與底物濃度一定時，隨反應的進行，反應速率及酶活力會隨著底物濃度的降低而降低;而當底物濃度降低至一定程度后，反應速率及酶活力均較低且趨于穩(wěn)定［15］。目前文獻中酵母β-葡萄糖苷酶活性測定時間從 10～180 min 不等［16－18］，反應時間過長導致試驗周期延長，效率低;而反應時間過短時吸光值較小，不符合比色法的要求。綜上所述，選擇反應時間為10 min。

2.2.2 反應溫度對酶活性的影響

由圖4可知，溫度對β-葡萄糖苷酶活性有較大影響，隨反應溫度的升高先增大后減小，50℃時到達最大值。這是因為:一方面，隨溫度的升高，反應速率隨之加快;但當溫度過高時，酶的生物活性會受到影響甚至因變性而失去其催化活性［15］，因此酵母β-葡萄糖苷酶活性測定溫度普遍較低，從25～50℃不等［19－20］，后續(xù)試驗選擇反應溫度為50℃。

圖3 反應時間對βG活性的影響Fig.3 Effects of reaction time on the activity of βG

圖4 反應溫度對βG活性的影響Fig.4 Effects of temperature on the activity of βG

圖5 底物濃度對βG活性的影響Fig.5 Effects of substrate concentration on the activity of βG

2.2.3 底物濃度對酶活性的影響

底物濃度是決定酶催化反應速度的主要因素，與酶濃度共同決定反應速度［15］，因此在酶活性測定過程中要求反應底物過量［7］。目前p-NPG法測定β-葡萄糖苷酶活性時底物濃度不盡相同，酵母來源從1～7 mmol/L 不等［17－19］;酒球菌來源從 2～ 20 mmol/L不等［13，20］;蜂蜜來源可達 30 mmol/L［21］。本試驗以稀釋2倍的粗酶液為研究對象，研究底物濃度對酶活力的影響，結果表明酶活力隨底物濃度的增加而增大，當底物濃度較高時，增幅趨于平緩(圖5)，其中30 mmol/L和40 mmol/L p-NPG對酶活力影響不顯著?？紤]到 p-NPG價格較為昂貴，因此選擇30 mmol/L的底物濃度進行后續(xù)試驗。

圖6 緩沖液pH對βG活性的影響Fig.6 Effects of pH value on the activity of βG

2.2.4 緩沖液pH對酶活性的影響

以不同pH值緩沖液稀釋2倍的粗酶液為研究對象，考察反應pH對酶活性的影響。如圖6所示，反應pH對酶活性有較大影響，且隨pH值的增大先增大后減小，pH值為5.0時達到最大值。這是因為每種酶都有其各自的最適pH，在最適pH時酶催化反應速度達到最大，當pH過高或過低時都可引起酶的變性失活。大部分β-葡萄糖苷酶均為酸性蛋白，最適pH值在酸性范圍內［7］，酵母β-葡萄糖苷酶測定pH 值從4～ 6 不等［17－18，24］，因此后續(xù)試驗選擇緩沖溶液pH為5.0。

2.3 正交試驗

由表2可知，各因素對酶活性的影響程度為:B＞C＞A，即反應pH＞底物濃度＞反應溫度。由k值得出最優(yōu)組合A2B3C3，即40 mmo/L p-NPG溶于 pH 5.5的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液中，50℃反應10 min。

用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對試驗結果進行方差分析，其結果見表3。

由表3可知，緩沖液pH和底物濃度對酶活性均有顯著影響，反應溫度的影響則不顯著。由于L9(34)正交試驗得到的最優(yōu)組合未在正交表中出現，所以需對正交試驗得到的最優(yōu)組合進行驗證試驗。在50℃，緩沖液pH值為5.5，底物濃度為40 mmol/L條件下反應10 min，重復5次，測得酶活力值為(47.58±0.58)U/mL，高于正交表中的試驗組，因此經方差分析所確定的是最佳測活參數。此外，5次測定結果的相對標準偏差(RSD)為1.21%(n=5)，說明該方法具有較好的重現性。

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Design and results of orthogonal test

表3 方差分析結果Table 3 Results of variance analysis

2.4 不同釀酒酵母菌株β-葡萄糖苷酶活性比較

由表4可知，上述12株商品釀酒酵母均具有β-葡萄糖苷酶活性，但各菌株酶活力大小及分布情況有較大差異。紅佳釀(VR)、VL1、RC212和 QA23胞外酶活較高;LVCB和D254完整細胞酶活較高;796、LVCB、VR、VL1、RC212、D254 總酶活較高。其中，紅佳釀酵母胞外酶活最高，且總酶活與商業(yè)高產菌株VL1 和 RC212［11，16］差異不顯著，表明紅佳釀酵母具有較好的產β-葡萄糖苷酶能力。

2.5 紅佳釀酵母生長及產酶曲線

由圖7可知，4～16h為紅佳釀酵母的對數生長期，16h后即為穩(wěn)定期，這可能是由于商品活性干酵母發(fā)酵特性好，生長繁殖較為迅速。隨生長時間的延長，β-葡萄糖苷酶活性先增大，28 h后趨于平緩，36 h時達到最大值，這與Villena等人報道的Debaryomyces pseudopolymorphus酵母在YPC培養(yǎng)基中的產酶情況相似［5］。此外，該菌株β-葡萄糖苷酶的生物合成在細胞的生長階段開始，當細胞生長進入穩(wěn)定期后，還可以延續(xù)合成一段較長時間，屬于延續(xù)合成型［15］，不同于乳酸菌的同步合成型［22］。

表4 各菌株所產β-葡萄糖苷酶活性比較(U/mL)Table 4 βG activity comparison of different strains(U/mL)

圖7 紅佳釀酵母生長及產酶曲線Fig.7 Grow and βG biosynthesis curve of VR

3 結論

通過單因素及正交試驗研究了反應時間、反應溫度、底物濃度和緩沖液pH等條件對β-葡萄糖苷酶活性的影響，發(fā)現反應溫度、緩沖液pH和底物濃度對酶活影響較大，確定了最佳測活參數為:pH 5.5檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖體系，40 mmol/L p-NPG，50℃反應10 min。

產酶特性研究結果表明紅佳釀酵母所產β-葡萄糖苷酶活性較強，與其他11株商品釀酒酵母菌株相比其胞外酶活最高，總酶活也較高;生長及產酶曲線研究發(fā)現該菌株在培養(yǎng)16h時即達到穩(wěn)定期，但直至36 h時酶活才達到最大值，證實該菌株β-葡萄糖苷酶的合成屬于延續(xù)合成型。

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