齊向輝，王旭，林靜，朱婧斐，羅艷，孫文敬

(江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江，212013)

耐高滲酵母是一類能夠在自然或人為高滲透壓環(huán)境下正常生長繁殖的微生物，分為耐糖酵母和耐鹽酵母。近年來，微生物相關(guān)研究領(lǐng)域已逐漸轉(zhuǎn)向極端微生物，其中耐高糖酵母已經(jīng)引起了人們的熱切關(guān)注。起初，耐高糖酵母的存在僅僅被作為引起高糖食品腐敗的標(biāo)志，后來Spencer［1］等人發(fā)現(xiàn):在好氧條件下，耐高滲酵母發(fā)酵糖類物質(zhì)能夠產(chǎn)生多種多元醇。隨后，各國研究者開始了對耐高糖酵母的深入研究，主要包括該類菌的好氧發(fā)酵和代謝機(jī)理。較不耐高滲酵母而言，耐高滲酵母具有活躍的HMP代謝途徑，能夠通過胞內(nèi)累積相容性物質(zhì)來適應(yīng)不同程度的高滲環(huán)境［2］。研究發(fā)現(xiàn)，酵母的耐高滲生長能力與其產(chǎn)多元醇的類別之間存在一定的關(guān)聯(lián)［3］，據(jù)此可以依據(jù)所需目標(biāo)發(fā)酵產(chǎn)物設(shè)置不同的發(fā)酵環(huán)境。另外，在食品工業(yè)和生物工程方面，耐高滲酵母的應(yīng)用愈加廣泛:(1)在高滲環(huán)境中，耐高滲酵母能夠產(chǎn)生D-阿拉伯糖醇，或赤蘚糖醇［4］等功能性多元醇物質(zhì)［5］。Onishi［6］等人報道了從葡萄糖到木糖醇的三步微生物發(fā)酵法，其中D-阿拉伯糖醇是關(guān)鍵中間產(chǎn)物，并提出以葡萄糖為發(fā)酵底物生產(chǎn) D-阿拉伯醇是可行的。自此，生物發(fā)酵法生產(chǎn) D-阿拉伯醇受到國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，并進(jìn)行了諸多相關(guān)研究。(2)由于很多種屬的酵母都能在高滲環(huán)境下胞內(nèi)累積甘油，所以耐高滲酵母也可以作為生產(chǎn)甘油的優(yōu)良工程菌［7］。(3)選擇耐高滲酵母作為生產(chǎn)菌株，可以很好的抑制生產(chǎn)過程中的雜菌污染。(4)固定化耐高滲酵母可以生產(chǎn)乙醇，目前利用此法生產(chǎn)乙醇的效率已經(jīng)有了很大的提高。菌種是發(fā)酵工程的靈魂，鑒于耐高滲酵母所產(chǎn)多元醇多數(shù)為功能性糖醇，也可將此類酵母稱為功能性微生物。

本文通過對采自天然高糖環(huán)境的樣品進(jìn)行高糖(40%)富集培養(yǎng)，從中篩選到了99株耐高糖酵母菌株，并對隨機(jī)挑選的40株(源自不同花蜜樣品)實驗菌株發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)生多元醇的種類進(jìn)行了初步分析，其中分離到的產(chǎn)D-阿拉伯糖醇和甘油的酵母居多。最后，根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察、生理生化實驗及ITS序列測定對不同典型菌落的酵母菌株進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

天然蜂蜜樣品，樣品A:棗花蜜;樣品B:油菜花蜜;樣品C:荊條花蜜;樣品D:野百花蜜。其中樣品A，B，C采自江蘇省鎮(zhèn)江市養(yǎng)蜂園。樣品D采自湖北房縣荒山上的天然蜂巢。

富集篩選培養(yǎng)基(g/L):400葡萄糖，10酵母粉，10胰蛋白胨(平板培養(yǎng)基另加20瓊脂粉);保藏培養(yǎng)基(g/L):50葡萄糖，10酵母粉，10胰蛋白胨，20瓊脂粉;YPD培養(yǎng)基(g/L):10酵母粉，10胰蛋白胨，20葡萄糖;發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):200葡萄糖，10酵母粉，10胰蛋白胨。

1.2 方法

1.2.1 耐高滲酵母的分離與篩選

將不同蜂蜜樣品分別稱取1.0 g，加入到含有20 mL富集培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，渦旋均勻后，30℃，200 r/min，搖瓶培養(yǎng)3 d。將富集培養(yǎng)物梯度稀釋后，分別吸取200 μL涂布到含富集培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，挑選生長良好的單菌落劃線分離純化，斜面保存于4℃冰箱。

1.2.2 耐高滲酵母產(chǎn)多元醇的種類分析

各自挑選10株源自不同花蜜樣品的耐高糖酵母，將其分別接種于含有20 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，30℃，200 r/min，搖瓶培養(yǎng)3 d。通過薄層層析法對發(fā)酵液中的多元醇產(chǎn)物進(jìn)行初步定性和粗定量檢測。根據(jù)葡萄糖和D-阿拉伯糖醇的Rf值和分離效果，分析普通硅膠玻璃板、鋁制硅膠板和微晶纖維素板的層析情況，優(yōu)化并確認(rèn)層析板規(guī)格和層析條件。樣品處理方法如下:取不同菌株的發(fā)酵液各1 mL，10 000 r/min離心10 min，取1 μL上清點樣于微晶纖維素板上，層析時間為80 min，重復(fù)層析3～4次，層析結(jié)束后自然晾干，層析圖譜的顯色采用飽和硝酸銀-丙酮和氫氧化鈉-乙醇溶液，具體可參照文獻(xiàn)［8］。

1.2.3 酵母菌株的鑒定

1.2.3.1 菌落形態(tài)及生理生化特征

從篩選到的菌株中挑選不同形態(tài)的典型單菌落，分別轉(zhuǎn)接于YPD液體培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)，在40倍顯微鏡下觀察不同時期菌體細(xì)胞的形態(tài)特征。實驗菌株的菌落形態(tài)及生理生化特征鑒定方法參照文獻(xiàn)［9］。

1.2.3.2 耐高滲酵母的分子特征

挑取選出的不同形態(tài)的典型單菌落于1 mL無菌水中，采用反復(fù)凍融法使細(xì)胞破壁，從而提取酵母菌的DNA，并以此作為PCR模板。采用真菌的通用引物，ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR 程序條件為:95℃預(yù)變性5 min，94℃變性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸40s，反應(yīng)32個循環(huán)，最后72℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后送測，測序工作由南京金斯瑞生物有限公司完成。在NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫中通過BLAST進(jìn)行同源序列對比，選擇相似性在98%以上酵母菌菌株的相關(guān)序列進(jìn)行分析，利用MEGA 4.1軟件，采用 Neighbor-Joining法進(jìn)行分子系統(tǒng)學(xué)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，分析所篩菌株與已知酵母菌的親緣關(guān)系。

1.2.4 氣相色譜法測定D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量

根據(jù)層析圖譜分析，初步篩選葡萄糖殘量低且D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量相對較高的菌株，將其轉(zhuǎn)接至發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行搖瓶培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為:30℃，200 r/min，搖瓶振蕩培養(yǎng)96 h。隨后將不同菌株的發(fā)酵液離心取上清分別傾倒入培養(yǎng)皿中置于－80℃冰箱冷凍3 h，再置于冷凍干燥機(jī)冷凍48 h，之后對發(fā)酵液中的固形物進(jìn)行糖精乙酸酯衍生化，具體方法如下:稱取菌株的發(fā)酵固形物100.0 mg于不同的Ep管(2 mL)中，各自加入10.0 mg鹽酸羥胺和1.0 mL吡啶，90℃水浴反應(yīng)30 min，取出冷卻至室溫，再各自加入1.0 mL乙酸酐，90℃水浴反應(yīng)30 min，取出冷卻至室溫，再經(jīng)氯仿萃取出有機(jī)相，待進(jìn)樣。選用Sigma公司的D-阿拉伯糖醇作為標(biāo)樣，梯度(10.0～60.0 mg)稀釋測樣，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其糖精乙酸酯衍生物的制備方法同上。氣相色譜分析條件:色譜柱Agilent HP－5(30 m×0.25 mm ×1 μm);柱溫:起始溫度180 ℃，保持30 min，10℃/min升溫至280℃，保持2 min;進(jìn)樣口:200℃;檢測器:FID，溫度:250℃;載氣:高純氮氣，流速20 mL/min;氫氣流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min，分流比:50∶1;進(jìn)樣量1 μL。

2 結(jié)果

2.1 耐高滲酵母的分離篩選

經(jīng)過葡萄糖含量為400 g/L的高糖培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，從不同來源的天然蜂蜜樣品中分離出99株生長良好的耐高滲酵母菌株。經(jīng)形態(tài)學(xué)初步鑒定，發(fā)現(xiàn)這些菌株可歸為3種菌落形態(tài)，菌落一較大，偏黃，半透明，光滑濕潤，色澤均一;菌落二較小，凸起，奶油色，不透明，光滑;菌落三為白色，不光滑，表面略有褶皺。其中，來自棗花蜜、油菜花蜜和荊條花蜜的酵母菌落形態(tài)單一，而來自野百花蜜中的酵母菌落呈現(xiàn)以上3種形態(tài)，具有一定的酵母多樣性。

2.2 耐高滲酵母發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)多元醇的初步分析

在層析板規(guī)格的選擇方面，實驗結(jié)果表明:微晶纖維素板對于多元醇類物質(zhì)具有最好的分離效果，確立了一種以微晶纖維素板為層析介質(zhì)，可用于對發(fā)酵液成分進(jìn)行初步定性和粗定量檢測分析的薄層層析方法。在層析展開劑選擇及優(yōu)化方面，經(jīng)過多種羥基類有機(jī)溶劑的不同比例配比，結(jié)合分離度和Rf值情況，試驗最終選用展開劑及其配比為:乙酸乙酯∶吡啶∶冰乙酸∶水 =16∶10∶2∶3，重復(fù)層析 3～4 次，層析效果比較好(部分層析圖譜見圖1)。在確定了層析條件的基礎(chǔ)上，從分離得到的99株源自不同花蜜樣品的菌株中隨機(jī)挑選40株(具有3種不同菌落形態(tài))耐高滲酵母，進(jìn)行搖瓶實驗。采用優(yōu)化的層析條件對發(fā)酵液進(jìn)行層析試驗和圖譜分析。

圖1 發(fā)酵液中多元醇的TLC結(jié)果(部分圖譜)Fig.1 The analysis result of fermentation broth by TLC

由圖1可以明顯看到，葡萄糖、D-阿拉伯糖醇、赤蘚糖醇和甘油的遷移率Rf值相差明顯，在此層析條件下，可將底物葡萄糖和產(chǎn)物D-阿拉伯糖醇兩者分離開來，該層析方法完全可以用于D-阿拉伯糖醇產(chǎn)生菌初篩過程中糖醇類產(chǎn)物的定性檢測。自不同樣品中分離的耐高滲酵母產(chǎn)多元醇的結(jié)果歸納如表1所示。

由表1可知，源自花蜜樣品的酵母屬產(chǎn)醇類別比較單一。在所分離到的耐高滲酵母中，產(chǎn)甘油的菌株來自不同花蜜樣品;產(chǎn)赤蘚糖醇的菌株大多數(shù)來自野百花蜜樣品;產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的菌株大部分是自荊條花蜜樣品中分離而來。

表1 來自不同花蜜樣品的耐高滲酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)多元醇的情況Table 1 The variety of polyol in the fermentation broth by flask-shaking of 40 strains isolated from different samples

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 酵母菌的形態(tài)學(xué)和生理生化特征

由于篩選到的產(chǎn)多元醇耐高滲酵母在平板上明顯分布3種形態(tài)的菌落，并結(jié)合TLC篩選的圖譜情況，各挑選1個典型特征的酵母單菌落，將其命名為JM-1，JM-2，JM-3。所選3株酵母菌落和細(xì)胞主要形態(tài)特征如圖2和圖3所示，發(fā)酵糖類和同化碳氮源的鑒定結(jié)果如表2所示。由這些圖表可知，菌株JM-1，JM-2，JM-3在G1固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)3 d后菌落特征雖然各有差異，但它們均有酵母菌的一些共有特征，如:菌落均為圓形，邊緣整齊，中間凸起，較黏稠，易挑起，色澤均一;借助光學(xué)顯微鏡進(jìn)一步觀察菌株JM-1，JM-2，JM-3在G1液體培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞特征發(fā)現(xiàn):菌體細(xì)胞呈圓形或橢圓形，出芽生殖，生長到穩(wěn)定期時出現(xiàn)類似于液泡組織，體積變大，具有典型的酵母菌細(xì)胞特征。

圖2 平板上3種不同的典型菌落形態(tài)Fig.2 Three typical colony morphology of strain JM-1，JM-2，JM-3

表2 發(fā)酵糖類及同化碳氮源等生理生化鑒定結(jié)果Table 2 The results of carbohydrate fermentation and assimilation carbon and nitrogen source

圖3 菌株JM-1，JM-2，JM-3在G1液體培養(yǎng)基中搖床培養(yǎng)16h的細(xì)胞形態(tài)Fig.3 The cellular morphology of strain JM-1，JM-2，JM-3

2.3.2 耐高滲酵母的分子生物學(xué)特征鑒定

真菌ITS區(qū)域核酸序列的相似性，已經(jīng)成為公認(rèn)的確定酵母菌分類地位的重要分子生物學(xué)依據(jù)。本實驗以反復(fù)凍融法提取的酵母DNA為模板，以真菌通用引物ITS1和ITS4為引物，通過PCR擴(kuò)增出的片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖4所示。

克隆所得到的菌株JM-1，JM-2，JM-3的ITS序列長度分別約為500、700、350bp，測序后確定長度分別為510，683，365bp，與電泳圖譜一致，試驗結(jié)果可信。經(jīng)NCBI中BLAST序列比對，根據(jù)同源序列搜索結(jié)果，選擇相似性在98%以上的酵母菌菌株的相關(guān)序列進(jìn)行分析。得到結(jié)果為:JM-1號菌株與Lodderomyces elongisporus的遺傳距離最近，且核苷酸序列相似性高達(dá) 100%，JM-2號菌株與 Zygosaccharomyces rouxii的遺傳距離最近，核苷酸序列相似性高達(dá)100%，JM-3號菌株與Starmerella sp.序列相似性達(dá)到99%。菌株JM-1，JM-2，JM-3的系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建如圖5所示，可以清楚顯示出實驗菌株與NCBI中一些參考酵母菌株的親緣關(guān)系。綜合菌落外觀形態(tài)，細(xì)胞形態(tài)，生理生化實驗 (與文獻(xiàn)［9］中相應(yīng)酵母菌屬的描述一致)及其分子生物學(xué)特征均表明，測序菌株JM-1，JM-2，JM-3的分類地位分別屬于Lodde1romyces elongisporus，Zygosaccharomyces rouxii，Starmerella sp.。

圖4 典型酵母菌株JM-1，JM-2，JM-3的 PCR產(chǎn)物Fig.4 PCR products of three strains

圖5 菌株JM-1，JM-2，JM-3同源樹的構(gòu)建Fig.5 Phylogenetic tree of strain JM-1，strain JM-2 and strain JM-3

2.4 產(chǎn)D-阿拉伯糖醇菌株產(chǎn)量的測定

根據(jù)層析圖譜結(jié)果，本實驗篩選出1株葡萄糖殘量低且D-阿拉伯糖醇產(chǎn)率相對較高的菌株Z.rouxii JM-12，將該菌株作為發(fā)酵出發(fā)菌株，利用氣相色譜法對D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量進(jìn)行初步定量。以D-阿拉伯糖醇標(biāo)品進(jìn)樣量(mg)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程:y=115 584x+96.877，R2=0.999 3，表明 D-阿拉伯糖醇在 10～60 mg范圍內(nèi)與峰面積的比值呈良好的線性關(guān)系。并且精密度試驗結(jié)果RSD=1.59%(n=3)，重復(fù)性試驗結(jié)果RSD=0.63%(n=3)，表明所用儀器精密度和重現(xiàn)性均良好。

圖6-A給出了D-阿拉伯糖醇和D-葡萄糖的混合標(biāo)品的糖精乙酸酯衍生物的色譜圖，其中D-阿拉伯糖醇的出峰時間為4.236 min，D-葡萄糖的出峰時間為5.124 min。菌株Z.rouxii JM-12的發(fā)酵液樣品經(jīng)過處理在同樣的色譜分析條件下進(jìn)樣，得到的圖譜如圖6-B所示，根據(jù)相同的保留時間可知:發(fā)酵產(chǎn)物D-阿拉伯糖醇衍生物的峰面積為4 191.3，帶入回歸方程可得到D-阿拉伯糖醇的進(jìn)樣量為35.4 mg，經(jīng)換算后可得菌株Z.rouxii JM-12轉(zhuǎn)化200 g/L D-葡萄糖得到D-阿拉伯糖醇的產(chǎn)量為(61.33+0.49)g/L，即0.31 g/g D-葡萄糖。

3 討論與結(jié)論

本試驗建立了一種簡單的分離耐高滲酵母的方法，即直接從天然高糖環(huán)境取樣，經(jīng)高糖富集培養(yǎng)，涂布高糖培養(yǎng)基篩選分離出多株耐高滲酵母，表現(xiàn)為3種菌落形態(tài)特征，經(jīng)ITS序列鑒定，結(jié)果分別屬于Lodderomyces elongisporus，Zygosaccharomyces rouxii，Starmerella sp.。有研究表明［10］，真菌的 ITS 序列在研究關(guān)系相近的屬間和種間的區(qū)別中十分有價值，如今的真菌系統(tǒng)發(fā)育和分類方法已經(jīng)普遍以ITS序列間的差異為理論基礎(chǔ)，采用多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)實現(xiàn)，同時，對ITS序列進(jìn)行的深入分析對于相關(guān)分子生物學(xué)的發(fā)展起到一定的推動作用。

圖6 氣相色譜圖Fig.6 Result of gas chromatography

通過實驗菌株發(fā)酵葡萄糖的試驗，得到多株產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的酵母。在此試驗過程中，大多數(shù)發(fā)酵液底物和羥基類產(chǎn)物比較容易分離，然而葡萄糖和D-阿拉伯糖醇的結(jié)構(gòu)和物理特性比較相似，較難分離開來，所以本實驗以葡萄糖和D-阿拉伯糖醇的Rf值之比作為分離效果的參考標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)二者的物理相似相容性，設(shè)計了多種羥基類有機(jī)溶劑的不同比例配比的組合層析劑，并最終確立了一種簡單有效的可初步用于篩選D-阿拉伯糖醇產(chǎn)生菌的定性和粗定量檢測的層析方法。

鑒于D-阿拉伯糖醇重要的應(yīng)用價值和需求潛力以及當(dāng)前制備的高成本，尋求發(fā)酵性能優(yōu)良的生產(chǎn)菌株是研究高效工業(yè)生產(chǎn)的前提。Badal［11］等人已經(jīng)報道過魯氏接合酵母屬產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的相關(guān)研究，并且D-拉伯糖醇的產(chǎn)率能夠達(dá)到0.48 g/g葡萄糖，深化了從自然高糖環(huán)境篩選產(chǎn)D-阿拉伯糖醇耐高滲酵母的意義。本研究也篩選出了1株性能優(yōu)良的菌株 Z.rouxii JM-12，其 D-阿拉伯糖醇產(chǎn)量可達(dá)61.3 g/L，即0.31 g/g葡萄糖，具有一定的開發(fā)應(yīng)用價值。據(jù)此，作者將通過進(jìn)一步篩選和優(yōu)化發(fā)酵條件，希望得到1株高產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的耐高滲酵母，為實現(xiàn)發(fā)酵法生產(chǎn)D-阿拉伯糖醇的技術(shù)路線奠定基礎(chǔ)。另外，作者將繼續(xù)研究產(chǎn)不同類別糖醇的耐高滲酵母在高滲環(huán)境下的生長能力的差異和積累某種多元醇的抗壓能力的相關(guān)度，從而進(jìn)一步解釋酵母的耐高滲代謝機(jī)制。

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