陳龍，許光治，高前欣，周萌，王姝，倪勤學(xué)，張有做

(浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江省農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)改良技術(shù)研究重點實驗室，浙江臨安，311300)

在動物和人體內(nèi)，黑色素的產(chǎn)生是一種自我保護機制，它是一種對紫外線吸收效果很好的吸收劑，能夠有效地保護皮膚免受陽光輻射的侵害。但是，黑色素的合成屬于人體黑色素細胞對外來侵害的一種應(yīng)激反應(yīng)，這種反應(yīng)受到遺傳，內(nèi)分泌，紫外線刺激，飲食等因素的影響，如果反應(yīng)過于強烈，則會導(dǎo)致人體黑色素代謝失調(diào)，積累量大于排泄量，造成皮膚過黑，甚至引起一系列皮膚病，嚴重者導(dǎo)致黑色素瘤的產(chǎn)生。在植物體內(nèi)，多酚氧化酶是引起果蔬酶促褐變的主要酶類［1－2］，目前市場上流行的黑色素合成抑制劑多數(shù)是通過抑制蘑菇酪氨酸酶的活性來或則阻斷酪氨酸的氧化途徑來實現(xiàn)美白的效果［3－4］，據(jù)其抑制黑色素形成過中所起的作用不同，酪氨酸酶抑制劑可分為含酚羥基的化合物、黃酮類化合物、醛類化合物、羧基化合物和肽、氨基酸及其衍生物等［5］。已有研究表明，在海洋生物體內(nèi)獲得的膠原多肽對蘑菇酪氨酸酶活性具有一定的抑制作用［6］。關(guān)于陸生動物膠原多肽抑制酪氨酸酶的報道尚屬鮮見。

本文以從雞爪皮中提取的分子量低于3 kDa的膠原多肽為實驗對象，探索其對蘑菇酪氨酸酶活性抑制的機制，目的是希望獲得酪氨酸酶抑制活性較高的肽類物質(zhì)，并采用B16黑色素瘤細胞對其安全性和色素合成阻斷功能進行研究，以期為大宗禽類副產(chǎn)品的利用開辟新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗室制備的分子質(zhì)量低于3 kDa的脫鹽雞爪皮膠原多肽;小鼠B16黑色素瘤細胞，中科院上海細胞保藏中心;L-多巴，阿拉丁試劑公司;蘑菇酪氨酸酶，Sigma公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、小牛血清、胰蛋白酶、MTT購自 Gibco公司;二甲基亞砜(DMSO)、Triton-100等均購自于上海生物工程有限公司;其他試劑均為分析純。

Tecan-M200酶標儀，瑞士Tecan;DK-80多溫控精宏水浴鍋，上海精宏;pHSJ-35 pH計，上海雷磁儀器廠;BPN-BOCH CO2培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司;TS100倒置相差顯微鏡，日本尼康公司;超凈工作臺，蘇凈集團安泰公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 蘑菇酪氨酸酶抑制效果測定方法

蘑菇酪氨酸酶酶活性測定方法是根據(jù)Hyung-Kyoon Choi［7］的方法進行適當調(diào)整而來的，采用200 μL的反應(yīng)體系，按照表1加入藥品進行反映，其中磷酸鹽緩沖液、樣品及蘑菇酪氨酸酶加入后于25℃水浴鍋中保溫10 min，再加入底物，于25℃水浴鍋中反應(yīng)10 min，測定475 nm波長的OD值。

根據(jù)測得的OD值計算蘑菇酪氨酸酶相對活性抑制率，蘑菇酪氨酸酶抑制率計算:

式中，I:蘑菇酪氨酸酶抑制率;A0:對照組空白測得的OD值;A1:對照組測得OD值;B0:樣品組空白測得OD值;B1:樣品組測得OD值。

表1 反應(yīng)液組成及體積Table 1 Compositions and volume of reaction buffer

1.2.2 蘑菇酪氨酸酶半抑制濃度(IC50)的測定

以磷酸鹽緩沖液將樣品配制成不同濃度的溶液，使得在200 μL的反應(yīng)體系中獲得不同的抑制量。根據(jù)1.2.1的方法固定底物L(fēng)-DOPA和酶的濃度，反應(yīng)后測定各個單位OD值，帶入公式(2)，計算蘑菇酪氨酸酶活性率，繪制出劑量響應(yīng)曲線。根據(jù)劑量響應(yīng)曲線得出樣品的IC50值，并進行驗證實驗。

式中，I:蘑菇酪氨酸酶活性率;A0:對照組空白測得的OD值;A1:對照組測得OD值;B0:樣品組空白測得OD值;B1:樣品組測得OD值。

1.2.3 雞爪皮膠原多肽對蘑菇酪氨酸酶抑制動力學(xué)測試

研究雞爪皮膠原多肽對蘑菇酪氨酸酶抑制動力學(xué)，可根據(jù)Lineweaver-Burk曲線來判定。固定反應(yīng)體系中酶的濃度(25 U/mL)，加入不同濃度的雞爪皮膠原多肽，改變反應(yīng)體系中底物濃度，測出每一組的反應(yīng)初速度以O(shè)D475nm/min表示。以反應(yīng)初速度的倒數(shù)和底物濃度的倒數(shù)分別為縱坐標和橫坐標繪制Lineweaver-Burk雙倒數(shù)曲線，通過曲線交點所在象限判斷雞爪皮膠原多肽對蘑菇酪氨酸酶的競爭機制。

1.2.4 MTT法細胞增殖活性

取對數(shù)生長期的B16黑色素瘤細胞，胰蛋白酶消化后，使用RPMI－1640完全培養(yǎng)基配制成細胞密度為5×104的細胞懸浮液接種于96孔板，每孔200 μL，置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。貼壁24 h后，棄去培養(yǎng)基。向96孔板中加入200 μL含雞爪皮膠原多肽(濃度為 0、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL)完全培養(yǎng)基;對照組加入等體積的完全培養(yǎng)基。每一個樣品濃度設(shè)置6個復(fù)孔，兩個板分別培養(yǎng)24 h和48 h。用酶標儀于570 nm測定每孔細胞的OD值A(chǔ)。以A表示細胞增殖活性。

1.2.5 黑色素含量的測定

調(diào)整細胞濃度為5×105個/mL，接種于6孔板，每孔接種2 mL細胞懸浮液。貼壁后的細胞處理及培養(yǎng)條件同1.2.4，雞爪皮膠原多肽濃度為0、25、50、100、200 μg/mL。每個濃度設(shè)置6個復(fù)孔，培養(yǎng)48 h后收獲細胞，并計數(shù)細胞后定量。本研究參照Hideya Ando等［8］的方法稍作修改，加入10%DMSO的1 mol/L的NaOH溶液完全溶解裂解細胞，超聲破碎處理30 min，80℃水浴加熱2 h，于470 nm處測定OD值A(chǔ)，黑色素相對含量計算:

式中，I:黑色素相對含量，%;A1:樣品組的 OD值;A0:空白組的OD值。

1.2.6 酪氨酸酶相對活性測定

細胞的接種密度、處理、培養(yǎng)條件及收獲、計數(shù)方法同1.2.4。采用Kim［9］的方法于475 nm處測定0 min和30 min的OD值，計算蘑菇酪氨酸酶的相對活性:

式中，R:蘑菇酪氨酸酶相對活性，%;A30:樣品組在30 min時測得OD值;A0:樣品組在0 min時測得OD值;B30:空白組在30 min時測得OD值;B0:空白組在0 min時測得OD值。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理方法

實驗數(shù)據(jù)均是經(jīng)過3次平行實驗的得到的平均值，并采用SPSS19.0分析計算其標準偏差，Microsoft Excel(office 2003)軟件作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 雞爪皮膠原多肽抑制蘑菇酪氨酸酶的IC50測定結(jié)果與分析

雞爪皮膠原多肽抑制蘑菇酪氨酸酶的劑量響應(yīng)曲線是隨著膠原多肽的濃度增加，蘑菇酪氨酸酶活變化的曲線。根據(jù)實驗1.2.2的方法作圖1，隨著膠原多肽的濃度增加，蘑菇酪氨酸酶活性逐漸降低，說明膠原多肽對蘑菇酪氨酸酶是具有抑制效果的。根據(jù)曲線擬合方程測得雞爪皮膠原多肽對蘑菇酪氨酸酶的IC50值為0.426 mg/mL。與熊果苷［10］對蘑菇酪氨酸酶抑制的IC50=1.44 mg/mL相比，雞爪皮膠原多肽的抑制蘑菇酪氨酸酶效果更好。這是由于熊果苷主要作用于酪氨酸→多巴這一反應(yīng)過程，而對多巴→多巴醌這一過程的抑制效果較差。而雞爪皮膠原多肽對多巴→多巴醌這一催化過程抑制效果較好。

圖1 雞爪皮膠原多肽的劑量對蘑菇酪氨酸酶活的影響(n=3)Fig.1 Effects of concentration of chicken collagen peptides on activity of tyrosinase(n=3)

2.2 雞爪皮膠原多肽對蘑菇酪氨酸酶抑制動力學(xué)測試

圖2為雞爪皮膠原多肽對蘑菇酪氨酸酶抑制動力學(xué)的雙倒數(shù)作圖，均得到一組橫軸截距不變的直線，5條直線相較于X負半軸，Km值表現(xiàn)為交點的負倒數(shù)，且保持不變，這說明雞爪皮膠原多肽不影響米氏常數(shù)(Km);最大反應(yīng)速度表現(xiàn)為五條直線在Y軸的截距的倒數(shù)，隨著濃度的增加，Vmax逐漸降低，膠原多肽與酶分子的結(jié)合與底物分子與酶的結(jié)合是獨立的，并不影響底物和酶的結(jié)合，抑制劑可以同時與游離(E)和結(jié)合酶(ES)結(jié)合，且結(jié)合常數(shù)相同，增加底物濃度并不能減少I對酶的抑制。以直線斜率(Intercept)和多肽濃度做圖(內(nèi)插圖a)，擬合直線，得到直線斜率為膠原多肽對蘑菇酪氨酸酶的抑制常數(shù)(Ki)為10.76 mg/mL。

2.3 雞爪皮膠原多肽對B16黑色素瘤細胞增殖活性的影響

雞爪皮膠原多肽在不同濃度和不同時間對B16黑色素瘤細胞增殖活性影響曲線見圖3。分別于24和48 h采用MTT檢測法測定細胞相對數(shù)量。由圖3可知，24和48 h時膠原多肽在0～200 μL/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)對細胞增殖活性均無顯著性影響(P＜0.05)，而熊果苷在48 h時對細胞增殖活性有一定的抑制作用(P＜0.05)，從另一個角度來講，熊果苷對細胞有微弱的毒性作用。

圖2 雞爪皮膠原多肽對蘑菇酪氨酸酶抑制類型及抑制常數(shù)的測定(n=3)Fig.2 Chicken collagen peptides on the tyrosinase enzyme inhibition diol type and determination of inhibition constants(n=3)

圖3 不同濃度雞爪皮膠原多肽和熊果苷作用24 h、48 h對黑色素瘤細胞增殖活性的影響(n=6)Fig.3 Different concentrations of chicken collagen peptides and arbutin role 24 h，48 h on melanoma cell proliferation activity(n=6)

2.4 雞爪皮膠原多肽對B16黑色素瘤細胞黑色素含量的影響

不同濃度雞爪皮膠原多肽對黑色素瘤細胞黑色素含量的影響見圖4。通過測定細胞中黑色素吸光值計算黑色素的相對含量。從圖4看雞爪皮膠原多肽在0 μg/mL和25 μg/mL時差異性不顯著，而濃度升高至50 μg/mL時差異性顯著，熊果苷作為陽性對照，對黑色素瘤細胞黑色素含量的影響均顯著。當濃度為200 μg/mL時，膠原多肽和熊果苷作用的黑色素瘤細胞黑色素相對含量分別為57.83%和31.53%。

圖4 不同濃度雞爪皮膠原多肽和熊果苷對黑色素瘤細胞黑色素含量的影響(n=6)同一組分標記字母不同，表示差異顯著(P＜0.05)Fig.4 Effect of different concentrations of chicken collagen peptides and Arbutin melanin content of melanoma tumor cells(n=6)

2.5 雞爪皮膠原多肽對B16黑色素瘤細胞蘑菇酪氨酸酶酶活的影響

圖5 不同濃度雞爪皮膠原多肽和熊果苷對B16黑色素瘤細胞蘑菇酪氨酸酶酶活的影響(n=6)同一組分標記字母不同，表示差異顯著(P＜0.05)Fig.5 palmatum influence of different concentrations of collagen peptides and arbutin B16 melanoma cells activity of tyrosinase(n=6)

雞爪皮膠原多肽作用黑色素瘤細胞對蘑菇酪氨酸酶活性抑制曲線見圖5。膠原多肽在濃度范圍為0～200 μg/mL時對黑色素瘤細胞蘑菇酪氨酸酶活性影響顯著(P ＜0.05)，200 μg/mL時活性降低到70.63%，熊果苷作為對照，對蘑菇酪氨酸酶抑制效果顯著(P＜0.05)，曲線在50 μg/mL之后下降速度加快，到200 μg/mL時，蘑菇酪氨酸酶活性降低到75.17%。雞爪皮膠原多肽能夠被細胞吸收有效抑制黑色素瘤細胞中的酪氨酸酶活性。

3 結(jié)論

目前市場上流行很多黑色素合成抑制劑，如氫醌、曲酸、熊果苷等，均是通過干擾黑色素的形成及轉(zhuǎn)移過程而達到降低黑色素含量的目的。熊果苷和曲酸常用于市場上出現(xiàn)的各種美白產(chǎn)品中，研究表明，熊果苷和氫醌使用過多會導(dǎo)致皮膚出現(xiàn)永久性不可逆白斑［5］;而曲酸是有細胞毒性作用的，并會增加卵巢細胞染色體變異的概率。因此需要尋找安全可靠無毒副作用的酪氨酸酶抑制劑。關(guān)于海洋生物膠原多肽抑制黑色素合成的研究已有報道［6］。

本研究中，雞爪皮膠原多肽抑制蘑菇酪氨酸酶活性的IC50=0.570 mg/mL，與熊果苷對蘑菇酪氨酸酶抑制的 IC50=1.44 mg/mL相比，抑制能力更顯著［11］，膠原多肽抑制蘑菇酪氨酸酶屬于非競爭性抑制;以小鼠B16黑色素瘤細胞為模型體外驗證雞爪膠原多肽的安全性及對黑色素合成的阻斷作用。實驗結(jié)果表明雞爪皮膠原多肽對細胞增殖活性無明顯影響，200 μg/mL時黑色素相對合成水平降低了42.17%，蘑菇酪氨酸酶相對活性下降了29.37%。其抑制黑色素合成的能力是與多肽濃度成正相關(guān)的，這與王靜鳳［13］等人的研究結(jié)果相似。關(guān)于雞爪皮膠原多肽抑制黑色素合成的具體機制有待進一步探索。

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