鄧伊++王志強

[摘要] 目的 研究ATP敏感性鉀通道（KATP通道）開放劑對氣道平滑肌細胞（ASMCs）增殖過程的影響，以及細胞因子信號轉導抑制蛋白3/5（SOCS3/5）表達變化與轉化生長因子-β1（TGF-β1）分泌釋放水平的關系。 方法 體外構建增殖型ASMCs原代培養(yǎng)細胞模型，分為ASMCs組、AngⅡ·ASMCs組、淋巴細胞（L）組、ASMCs+L組和AngⅡ·ASMCs+L組。Real-time PCR檢測細胞中SOCS3 mRNA及SOCS5 mRNA表達的差異；ELISA法檢測上清液中TGF-β1的釋放水平。觀察KATP通道開放劑尼可地爾（NCR）干預的影響。 結果 與ASMCs組比較，AngⅡ·ASMCs組TGF-β1的表達水平明顯升高（P<0.01）；NCR作用于細胞后各組ASMCs表達TGF-β1與格列本脲（GLI）比較明顯減少（P<0.05）。與ASMCs+L組比較，AngⅡ·ASMCs+L組SOCS3 mRNA表達增加，而SOCS5 mRNA表達減少（P<0.05）。NCR可以下調SOCS3的表達，上調SOCS5的表達。 結論 KATP通道開放可以通過抑制ASMCs增殖而調控TGF-β1分泌表達；SOCS3和SOCS5可能是哮喘氣道重塑的特異性免疫治療中的重要靶點。

[關鍵詞] KATP通道開放劑；氣道平滑肌細胞；細胞因子信號轉導抑制因子；哮喘

[中圖分類號] R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2014）10（b）-0004-04

細胞因子信號轉導抑制因子（suppressor of cytokine signaling，SOCS）是近年來新發(fā)現(xiàn)的一類負向調節(jié)因子[1]，參與多種細胞因子信號轉導過程，其中SOCS3和SOCS5作為SOCS家族的重要成員，可能與哮喘等免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展有關，并有望成為這類疾病的治療靶點。有研究說明[2]，ATP敏感性鉀通道（KATP通道）開放劑對哮喘的氣道重塑可以產(chǎn)生有益的作用，其機制尚未見系統(tǒng)性的研究報道。本研究利用在體外原代培養(yǎng)的哮喘大鼠氣道平滑肌細胞（airway smooth muscle cells，ASMCs），建立增殖型ASMCs模型，探索KATP通道開放劑的作用是否與逆轉氣道平滑肌細胞增殖有關，以及對SOCS3/5免疫失衡的影響，為治療哮喘等免疫失衡疾病建立新的方法提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

淋巴細胞分離液，購自碧云天；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記羊抗兔二抗，購自武漢博士德生物工程有限公司；α-肌動蛋白（α-SMA）單抗，購自Boster；SOCS3/5引物，上海生工；大鼠轉化生長因子-β1（transforming growth factor-β，TGF-β1）ELISA試劑盒，購自伊萊瑞特生物科技有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基，購自美國Gbico BRL公司；地塞米松（dexamethasone，DEX）注射液，浙江仙據(jù)制藥股份有限公司；尼可地爾（nicorandil，NCR），日本Tohoku Nipro醫(yī)藥公司；血管緊張素Ⅱ（angiotensin Ⅱ，AngⅡ）、Ⅰ型膠原酶（collagenaseⅠ）、格列本脲（glibenclamide，GLI）均購自Sigma公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及鑒定 雄性SD大鼠，SPF級，年齡21～36 d，體重100～140 g，由三峽大學實驗動物中心提供。方法參考相關文獻進行改進[3]。以10%的水合氯醛（0.4 ml/100 g）腹腔注射麻醉大鼠，放入超凈臺中，開胸取出氣管，刮去外膜內(nèi)膜，D-Hank′s液洗凈，剪碎、消化后，用20%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基，5%CO2培養(yǎng)箱中37℃靜置培養(yǎng)1周左右，可見細胞從組織塊周圍爬出。實驗用3～6代細胞，免疫細胞化學染色鑒定平滑肌細胞上特有的α-SMA。

1.2.2 AngⅡ誘導ASMCs的增殖與表達 AngⅡ（100 nmol/L）處理ASMCs，連續(xù)作用3 d，24 h換一次液；Western blotting檢測α-SMA，評定AngⅡ對ASMCs增殖誘導作用；上清中TGF-β1分泌表達用ELISA檢測（按說明書操作），分為ASMCs組和AngⅡ·ASMCs組。

1.2.3 AngⅡ·ASMCs與淋巴細胞共培養(yǎng) 以AngⅡ處理ASMCs后，D-Hank′s液洗3遍，消化重懸，以1×106 cell/L鋪于6孔板中，待細胞貼壁生長24 h，加入提取的2 ml T淋巴細胞（1×105 cell/L），作用36 h，分為L組、ASMCs+L組和AngⅡ·ASMCs+L組。

1.2.4 Real-time PCR檢測SOCS3和SOCS5在共培養(yǎng)體系中的表達 ①收集上清中的淋巴細胞，（5～10）×106單個核細胞加Trizol 1 ml，混勻后Trizol法提取總RNA，紫外分光光度法測定RNA含量。②RT-PCR反應體系：RNA 4.0348 μg，Oligo（dT）15（10 μmol/L）2 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2 μl，ddH2O（RNAse free）至14.5 μl，70℃ 5 min，短暫離心后置于冰上；以上PCR管全部14.5 μl，5×RT緩沖液4 μl，HRP（RRI）/RNAse Inhibitor 0.5 μl，M-MLV 1 μl，ddH2O（RNAse free）至20 μl，42℃ 60 min，95℃ 5 min。③Real-time PCR反應體系：β-actin f（10 μmol/L）0.5 μl，β-actin r（10 μmol/L）0.5 μl，dNTP（2.5 mmol/L）2 μl，Ex Taq 0.25 μl，10×Ex Taq E緩沖液2.5 μl，cDNA 1 μl，ddH2O至25 μl，94℃ 4 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 25 s，30個循環(huán)，72℃ 4 min，4℃ 4 min，引物序列及擴增條件見表1。

表1 Real-time PCR反應的引物序列及擴增條件

1.2.5 KATP通道調節(jié)劑處理細胞 NCR（開放劑）處理ASMCs以及共培養(yǎng)組細胞，并以DEX（治療藥）和GLI（拮抗劑）分別作為陽性對照和陰性對照。加藥后細胞培養(yǎng)36 h，每12小時換一次液。Real-time PCR檢測SOCS3和SOCS5的表達差異；上清中TGF-β1分泌表達用ELISA檢測。

1.3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以x±s表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 AngⅡ作用于ASMCs的增殖與表達

2.1.1 Western blotting檢測α-SMA的表達 BandScan分析膠片灰度值分析后兩組α-SMA/β-actin的比較如圖1，可見，AngⅡ處理后的ASMCs表達α-SMA水平比未用AngⅡ處理的ASMCs組明顯升高，說明AngⅡ處理ASMCs后可使細胞增殖。

圖1 AngⅡ處理前后ASMCs增殖的比較

α-SMA/β-actin代表ASMCs增殖量，與ASMCs組比較，*P<0.01

2.1.2 ELISA法檢測上清液中TGF-β1表達的差異 與ASMCs組比較，AngⅡ·ASMCs組TGF-β1的表達水平明顯升高（P<0.01）（圖2）。

圖2 AngⅡ處理ASMCs前后TGF-β1表達的差異

與ASMCs組比較，*P<0.01

2.2 SOCS3和SOCS5 mRNA在共培養(yǎng)體系中的表達

熒光定量PCR結果采用ΔΔCt法計算：目的基因相對表達量=2-ΔΔCt，ΔΔCt=實驗組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因）-對照組（Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因），所以2-ΔΔCt表示目的基因相對于內(nèi)參基因的相對表達量。ASMCs與淋巴細胞共培養(yǎng)后，SOCS3 mRNA表達增加，而SOCS5 mRNA表達減少（P<0.05）；與ASMCs+L組比較，AngⅡ·ASMCs與淋巴細胞共培養(yǎng)，SOCS3 mRNA表達增加，而SOCS5 mRNA表達減少（P<0.05）（表2）。

表2 SOCS3和SOCS5基因表達相對量2-ΔΔCt值（x±s，n=3）

與L組比較，*P<0.05；與ASMCs+L組比較，#P<0.05

2.3 KATP通道開放劑作用結果

2.3.1 藥物作用后上清中的TGF-β1表達差異 在各組用藥后DEX和NCR使ASMCs表達TGF-β1水平均比用拮抗劑GLI明顯減少（P<0.05）；而AngⅡ處理ASMCs后分泌表達TGF-β1比ASMCs組明顯增加（P<0.01）（表3）。

表3 檢測上清中的TGF-β1表達差異（x±s，n=3）

與拮抗劑GLI比較，*P<0.05；與ASMCs組比較，#P<0.01

2.3.2 藥物作用后SOCS3和SOCS5表達差異 與拮抗劑GLI比較，DEX和NCR作用與共培養(yǎng)體系可以下調SOCS3 mRNA的表達水平，上調SOCS5 mRNA的表達水平（表4）。

3 討論

支氣管哮喘以慢性氣道炎癥和氣道重塑為主要特征，伴隨發(fā)生氣道高反應，而氣道重塑的機制和治療藥物是目前研究的熱點。支氣管平滑肌細胞是支氣管主要的結構細胞，其異常增殖在氣道重塑中起到十分重要的作用[4-5]。氣道平滑肌細胞增生的直接后果是造成氣道壁的增厚，加重氣道的狹窄，產(chǎn)生氣道高反應性，造成呼吸道氣流受限，與哮喘嚴重程度密切相關。因此，有效遏制氣道平滑肌細胞過度增殖，是治療難治性哮喘的根本途徑之一[6]。收縮型ASMCs無增殖和遷移能力，對外界刺激產(chǎn)生收縮反應，增殖/合成型能夠分泌表達多種活性物質，具有增殖、遷移的能力[7]。本實驗采用AngⅡ誘導，在體外建立增殖型ASMCs與淋巴細胞共培養(yǎng)模型，結果顯示，ASMCs的增殖可以調節(jié)Th1/Th2免疫相關細胞因子信號轉導抑制因子的平衡，促進SOCS3的表達而抑制SOCS5的表達，從而使SOCS3/5免疫失衡，表現(xiàn)為SOCS3與炎癥反應正相關，而SOCS5則相反。TGF-β1的合成分泌與ASMCs增殖呈正相關，說明TGF-β1可能參與哮喘ASMCs的增殖過程，在哮喘的發(fā)病過程中有重要的作用。TGF-β1與氣道損傷后的修復過程及氣道重塑有密切關系，其在氣道中表達增高能刺激氣道平滑肌細胞ASMCs分裂與增殖，導致平滑肌增生和肥厚及氣道重塑，從而加重哮喘。

鉀通道是體內(nèi)一種重要的離子通道，它廣泛分布于各種器官組織的細胞膜，在調節(jié)膜電位和興奮性方面起著重要作用；平滑肌上至少有三種鉀通道：鈣激活鉀通道（KCa）、遲整流鉀通道（Kdr）、KATP。其中，KATP最為重要，當該通道開放時，產(chǎn)生一系列電化學反應，有效舒張平滑肌、起到降壓解痙的作用[8]，因此，KATP通道是多種疾病的治療靶點。本實驗結果顯示，KATP通道開放劑對ASMCs的增殖有抑制作用，相應地TGF-β1也隨之減少，與拮抗劑有明顯的差異；同時，又可下調SOCS3 mRNA的表達，上調SOCS5 mRNA的表達，從而逆轉ASMCs增殖所致的SOCS3/5表達失衡，說明KATP通道開放劑能夠抑制氣道平滑肌細胞增殖和分泌。

目前認為[9-12]，SOCS通過兩條通路抑制信號傳導的作用，即JAK激酶/信號轉導和轉錄激活因子（JAK/STAT），有絲分裂原活化蛋白激酶/細胞外信號調節(jié)激酶 （MAPK/ERK），但是當前對JAK/STAT通路研究較多，對MAPK/ERK通路研究較少。SOCSs通過細胞內(nèi)JAK-STAT系統(tǒng)信號途徑調節(jié)細胞信號轉導，參與細胞炎性反應、細胞增殖與分化等生物學功能的調節(jié)。已有研究發(fā)現(xiàn)，SOCS蛋白對Th細胞的分化具有重要的調控作用[9，13-14]，其中SOCS5/3與Th1/Th2免疫失衡密切相關，SOCS3主要表達在Th2細胞中并抑制Th1型免疫反應，SOCS5通過抑制Th2細胞因子信號轉導促進Th1細胞分化[15-17]。因此認為KATP開放劑能夠抑制氣道平滑肌細胞增殖分泌，并通過調節(jié)Th1/Th2免疫因子和SOCS蛋白的免疫平衡產(chǎn)生治療作用，此方面的研究可望為臨床對哮喘的預防和治療提供新的思路。

[參考文獻]

[1] Linossi EM，Babon JJ，Hilton DJ，et al.Suppression of cytokine signaling：the SOCS perspective[J].Cytokine Growth Factor Rev，2013，24（3）：241-248.

[2] Wan X，Zhao J，Xie J.Effects of mitochondrial ATP-sensitive K（+） channel on protein kinase C pathway and airway smooth muscle cell proliferation in asthma[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2012，32（4）：480-484.

[3] 邱晨，李娜.平滑肌細胞培養(yǎng)方法探討[J].廣東醫(yī)學，2008，29（11）：1791-1793.

[4] Damera G，Tliba O，Penattieri RA Jr.Airway smooth muscle as an immunomodulatory cell[J].Pulm Pharmacol Ther，2009，22（5）：353-359.

[5] Prakash YS.Airway smooth muscle in airway reactivity and remodeling：what have we learned[J]Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2013，305（12）：L912-933.

[6] Xia YC，Redhu NS，Moir LM，et al.Pro-inflammatory and immunomodulatory functions of airway smooth muscle：emerging concepts[J].Pulm Pharmacol Ther，2013，26（1）：64-74.

[7] Hirota JA，Nguyen TT，Schaafsma D，et al.Airway smooth muscle in asthma：phenotye plasticity and fanction[J].Pulm Pharmacol Ther，2009，22（5），370-378.

[8] Malerba M，Radaeli A，Mancuso S，et al.The potential therapeutic role of potassium channel modulators in asthma and chronic obstructive pulmonary disease[J].J Biol Regul Homeost Agents，2010，24（2）：123-130.

[9] Yoshimura A，Suzuki M，Sakaguchi R，et al.SOCS，Inflammation，and Autoimmunity[J].Front Immunol，2012，3：20.

[10] Babon JJ，Kershaw NJ，Murphy JM，et al.Suppression of cytokine signaling by SOCS3：characterization of the mode of inhibition and the basis of its specificity[J].Immunity，2012，36（2）：239-250.

[11] Kolesnik TB，Nicholson SE.Analysis of Suppressor of Cytokine Signalling （SOCS） gene expression by real-time quantitative PCR[J].Methods Mol Biol，2013，967：235-248.

[12] Babon JJ，Nicola NA.The biology and mechanism of action of suppressor of cytokine signaling 3[J].Growth Factors，2012，30（4）：207-219.

[13] Palmer DC，Restifo NP.Suppressors of cytokine signaling （SOCS） in T cell differentiation，maturation，and function[J].Trends Immunol，2009，30（12）：592-602.

[14] Zhang JG，Nicholson SE.Detection of endogenous SOCS1 and SOCS3 proteins by immunoprecipitation and Western blot analysis [J].Methods Mol Biol，2013，967：249-259.

[15] Daegelmann C，Herberth G，Rder S，et al.Association between suppressors of cytokine signalling，T-helper type 1/T-helper type 2 balance and allergic sensitization in children[J].Clin Exp Allergy，2008，38（3）：438-448.

[16] Nakaya M，Hamano S，Kawasumi M，et al.Aberrant IL-4 production by SOCS3-over-expressing T cells during infection with Leishmania major exacerbates disease manifestations[J].Int Immunol，2011，23（3）：195-202.

[17] Tang JF，Guan SH，Wang ZG.Roles of interleukin-10 differentiated dendritic cell of allergic asthma patients in T-lymphocyte proliferation in vitro[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2012，92（40）：2851-2854.

（收稿日期；2014-06-05 本文編輯：郭靜娟）

[參考文獻]

[1] Linossi EM，Babon JJ，Hilton DJ，et al.Suppression of cytokine signaling：the SOCS perspective[J].Cytokine Growth Factor Rev，2013，24（3）：241-248.

[2] Wan X，Zhao J，Xie J.Effects of mitochondrial ATP-sensitive K（+） channel on protein kinase C pathway and airway smooth muscle cell proliferation in asthma[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2012，32（4）：480-484.

[3] 邱晨，李娜.平滑肌細胞培養(yǎng)方法探討[J].廣東醫(yī)學，2008，29（11）：1791-1793.

[4] Damera G，Tliba O，Penattieri RA Jr.Airway smooth muscle as an immunomodulatory cell[J].Pulm Pharmacol Ther，2009，22（5）：353-359.

[5] Prakash YS.Airway smooth muscle in airway reactivity and remodeling：what have we learned[J]Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2013，305（12）：L912-933.

[6] Xia YC，Redhu NS，Moir LM，et al.Pro-inflammatory and immunomodulatory functions of airway smooth muscle：emerging concepts[J].Pulm Pharmacol Ther，2013，26（1）：64-74.

[7] Hirota JA，Nguyen TT，Schaafsma D，et al.Airway smooth muscle in asthma：phenotye plasticity and fanction[J].Pulm Pharmacol Ther，2009，22（5），370-378.

[8] Malerba M，Radaeli A，Mancuso S，et al.The potential therapeutic role of potassium channel modulators in asthma and chronic obstructive pulmonary disease[J].J Biol Regul Homeost Agents，2010，24（2）：123-130.

[9] Yoshimura A，Suzuki M，Sakaguchi R，et al.SOCS，Inflammation，and Autoimmunity[J].Front Immunol，2012，3：20.

[10] Babon JJ，Kershaw NJ，Murphy JM，et al.Suppression of cytokine signaling by SOCS3：characterization of the mode of inhibition and the basis of its specificity[J].Immunity，2012，36（2）：239-250.

[11] Kolesnik TB，Nicholson SE.Analysis of Suppressor of Cytokine Signalling （SOCS） gene expression by real-time quantitative PCR[J].Methods Mol Biol，2013，967：235-248.

[12] Babon JJ，Nicola NA.The biology and mechanism of action of suppressor of cytokine signaling 3[J].Growth Factors，2012，30（4）：207-219.

[13] Palmer DC，Restifo NP.Suppressors of cytokine signaling （SOCS） in T cell differentiation，maturation，and function[J].Trends Immunol，2009，30（12）：592-602.

[14] Zhang JG，Nicholson SE.Detection of endogenous SOCS1 and SOCS3 proteins by immunoprecipitation and Western blot analysis [J].Methods Mol Biol，2013，967：249-259.

[15] Daegelmann C，Herberth G，Rder S，et al.Association between suppressors of cytokine signalling，T-helper type 1/T-helper type 2 balance and allergic sensitization in children[J].Clin Exp Allergy，2008，38（3）：438-448.

[16] Nakaya M，Hamano S，Kawasumi M，et al.Aberrant IL-4 production by SOCS3-over-expressing T cells during infection with Leishmania major exacerbates disease manifestations[J].Int Immunol，2011，23（3）：195-202.

[17] Tang JF，Guan SH，Wang ZG.Roles of interleukin-10 differentiated dendritic cell of allergic asthma patients in T-lymphocyte proliferation in vitro[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2012，92（40）：2851-2854.

（收稿日期；2014-06-05 本文編輯：郭靜娟）

[參考文獻]

[1] Linossi EM，Babon JJ，Hilton DJ，et al.Suppression of cytokine signaling：the SOCS perspective[J].Cytokine Growth Factor Rev，2013，24（3）：241-248.

[2] Wan X，Zhao J，Xie J.Effects of mitochondrial ATP-sensitive K（+） channel on protein kinase C pathway and airway smooth muscle cell proliferation in asthma[J].J Huazhong Univ Sci Technolog Med Sci，2012，32（4）：480-484.

[3] 邱晨，李娜.平滑肌細胞培養(yǎng)方法探討[J].廣東醫(yī)學，2008，29（11）：1791-1793.

[4] Damera G，Tliba O，Penattieri RA Jr.Airway smooth muscle as an immunomodulatory cell[J].Pulm Pharmacol Ther，2009，22（5）：353-359.

[5] Prakash YS.Airway smooth muscle in airway reactivity and remodeling：what have we learned[J]Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2013，305（12）：L912-933.

[6] Xia YC，Redhu NS，Moir LM，et al.Pro-inflammatory and immunomodulatory functions of airway smooth muscle：emerging concepts[J].Pulm Pharmacol Ther，2013，26（1）：64-74.

[7] Hirota JA，Nguyen TT，Schaafsma D，et al.Airway smooth muscle in asthma：phenotye plasticity and fanction[J].Pulm Pharmacol Ther，2009，22（5），370-378.

[8] Malerba M，Radaeli A，Mancuso S，et al.The potential therapeutic role of potassium channel modulators in asthma and chronic obstructive pulmonary disease[J].J Biol Regul Homeost Agents，2010，24（2）：123-130.

[9] Yoshimura A，Suzuki M，Sakaguchi R，et al.SOCS，Inflammation，and Autoimmunity[J].Front Immunol，2012，3：20.

[10] Babon JJ，Kershaw NJ，Murphy JM，et al.Suppression of cytokine signaling by SOCS3：characterization of the mode of inhibition and the basis of its specificity[J].Immunity，2012，36（2）：239-250.

[11] Kolesnik TB，Nicholson SE.Analysis of Suppressor of Cytokine Signalling （SOCS） gene expression by real-time quantitative PCR[J].Methods Mol Biol，2013，967：235-248.

[12] Babon JJ，Nicola NA.The biology and mechanism of action of suppressor of cytokine signaling 3[J].Growth Factors，2012，30（4）：207-219.

[13] Palmer DC，Restifo NP.Suppressors of cytokine signaling （SOCS） in T cell differentiation，maturation，and function[J].Trends Immunol，2009，30（12）：592-602.

[14] Zhang JG，Nicholson SE.Detection of endogenous SOCS1 and SOCS3 proteins by immunoprecipitation and Western blot analysis [J].Methods Mol Biol，2013，967：249-259.

[15] Daegelmann C，Herberth G，Rder S，et al.Association between suppressors of cytokine signalling，T-helper type 1/T-helper type 2 balance and allergic sensitization in children[J].Clin Exp Allergy，2008，38（3）：438-448.

[16] Nakaya M，Hamano S，Kawasumi M，et al.Aberrant IL-4 production by SOCS3-over-expressing T cells during infection with Leishmania major exacerbates disease manifestations[J].Int Immunol，2011，23（3）：195-202.

[17] Tang JF，Guan SH，Wang ZG.Roles of interleukin-10 differentiated dendritic cell of allergic asthma patients in T-lymphocyte proliferation in vitro[J].Zhonghua Yi Xue Za Zhi，2012，92（40）：2851-2854.

（收稿日期；2014-06-05 本文編輯：郭靜娟）