王歡，陳曦，李靜，劉艷春，劉慶榮，陳麗娟

(1.唐山工人醫(yī)院 血液科，河北 唐山 063001;2.南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 血液內(nèi)科，江蘇 南京 210029)

多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)作為臨床較為常見的惡性血液腫瘤疾病之一，其來源于B細胞，以骨髓中漿細胞發(fā)生克隆性惡性增殖、積聚以及出現(xiàn)大量單克隆免疫球蛋白或輕鏈片段為主要特征，老年人由于身體機能較差，是本病的高發(fā)人群［1-2］。MM的生長、增殖和凋亡等病理過程受多種因素共同調(diào)控，如果治療不及時，能夠引發(fā)骨質(zhì)廣泛性損傷、貧血、反復(fù)感染、高鈣血癥以及腎功能不全損害等并發(fā)癥，嚴重影響患者的生活質(zhì)量［3-4］。本文通過觀察亞砷酸聯(lián)合T-VAD方案對老年多發(fā)性骨髓瘤患者血清APRIL、β2-m及TPO表達的影響，旨在探討亞砷酸聯(lián)合T-VAD方案治療老年多發(fā)性骨髓瘤的價值，從而為臨床治療提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取唐山工人醫(yī)院血液科2011年1月～2014年1月治療的88例老年多發(fā)性骨髓瘤患者作為觀察對象，觀察組45例，其中男性24例，女性21例，患者年齡65～80歲，平均年齡(70.96±7.84)歲，其中IgA型共15例，IgG型共18例，IgM型共4例，輕鏈型共6例(KAP型和LAM型各3例)，不分泌型共2例。根據(jù)Blades標準評價療效將觀察組分為有效組32例和無效組15例2個亞組;常規(guī)治療組共43例患者，其中男性22例，女性21例，患者年齡66～81歲，平均年齡(71.25±7.67)歲;其中IgA型共13例，IgG型共17例，IgM型共3例，輕鏈型共7例(KAP型和LAM型各3例)，不分泌型共3例。另選取同期體檢的健康老年人共45例作為對照組，其中男性22例，女性23例，患者年齡66～81歲，平均年齡(71.69±7.75)歲。病例入選標準:①年齡在65歲以上;②觀察組患者均符合西醫(yī)學(xué)多發(fā)性骨髓瘤診斷標準，明確診斷為多發(fā)性骨髓瘤［6］;③健康組排除心、腎、肝、腦血管、腫瘤以及各種炎癥疾病，無血液疾病史;④對本實驗知情同意，自愿參與。各組性別、年齡等資料無顯著性差異。

1.2 實驗試劑及儀器 ELISA檢測試劑盒(美國ADL公司);pGEM-T載體試劑盒、Trizol試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen公司);β2-m試劑盒(北京東雅生物技術(shù)有限公司)。ELX800酶標儀(美國BIO-TEKS公司);高速低溫離心機3K-30(美國Sigma公司);熒光定量PCR儀。

1.3 治療方法 亞砷酸聯(lián)合T-VAD方案具體方法:①亞砷酸(arsenious acid，哈爾濱伊達藥業(yè)有限公司，國藥準字H19990191)，用法為10mg亞砷酸+500mL5%葡萄糖溶液，靜脈滴注3～4 h，1次/d;②沙利度胺(江蘇常州藥業(yè)公司，國藥準字H32026129)，用法為100mg，1次/d;③長春新堿(山東振東泰盛制藥有限公司，國藥準字 H14020811)，用法為長春新堿0.4mg/m2+20mL生理鹽水，緩慢靜脈注射，1次/d，用藥時間為第1～4 d;④阿霉素(意大利 Actavis Italy S.p.A，注冊證號H20130186)，用法為10mg阿霉素+50mL生理鹽水，緩慢靜脈注射，1次/d，用藥時間為第1～4 d;⑤地塞米松(天津天藥藥業(yè)公司，國藥準字H20033553)，用法為40mg地塞米松，1次/d，口服，用藥時間為第1～4 d、第9～12 d及第17～20 d。常規(guī)治療組采用VAD方案。4周為1個療程，共進行2個療程。對照組不采取任何干預(yù)措施。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 檢測APRILmRNA及蛋白水平:清晨空腹取5mL外周血，經(jīng)EDTA抗凝處理后提取血漿，分離留取單個核細胞。將β2M全序列作為內(nèi)參，結(jié)合APRIL設(shè)計引物，合成熒光探針，成功構(gòu)建APRIL及β2M標準品后，采用Trizol法提取并檢測細胞總RNA的濃度和純度，采取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，擴增cDNA獲取目的片段，PCR產(chǎn)物連接T載體，藍白斑試驗對重組質(zhì)粒進行篩選，提取陽性克隆，采取EcoRⅠ酶切鑒定、測序、擴增、質(zhì)粒抽提后應(yīng)用核酸蛋白紫外分析儀進行定量分析，設(shè)5個APRIL或β2M標準品及6個對照復(fù)孔(空白及陰性各3個)，利用熒光定量檢測儀進行PCR擴增，電腦軟件計算β2M或APRILmRNA值。

1.4.2 檢測血清APRIL及TPO:觀察組患者在治療前以及治療結(jié)束后，對照組健康人群在體檢當日，空腹狀態(tài)下抽取5mL外周靜脈血，加入129 mmol/L枸櫞酸鈉(比例為9∶1)抗凝處理后，在4℃環(huán)境中進行離心處理(3000 r/min)10 min，分離獲取上清液，放置在－20℃冰箱中保存待測。依據(jù)ELISA試劑盒說明書進行血清TPO檢測。

1.4.3 檢測血清β2-m:在治療前后清晨空腹下取3mL靜脈血放置在消毒干燥試管內(nèi)，抗凝處理后采取離心處理(3 000 r/min)，分離血清，置于－20℃冰箱中備用，依據(jù)試劑盒說明書，應(yīng)用放射免疫分析法進行β2-m檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計學(xué)軟件分析實驗所得數(shù)據(jù)，計量數(shù)據(jù)采用“±s”表示，計量數(shù)據(jù)分析為t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組APRIL mRNA水平比較 cDNA作為模板，瓊脂糖凝膠電泳顯示PCR擴增產(chǎn)物大小符合預(yù)期(見圖1)。與對照組比較，MM患者APRIL mRNA表達顯著升高(P＜0.05)，治療后APRILmRNA仍處于高水平，但是其表達受到顯著抑制，與常規(guī)治療相比，觀察組APRIL mRNA顯著降低(P＜0.05，見表1)。

圖1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoresis results

表1 各組APRILmRNA水平比較Tab.1 Comparison of APRILmRNA levels

2.2 各組血清APRIL、β2-m及TPO檢測結(jié)果比較 觀察組及常規(guī)治療組患者血清APRIL、β2-m及TPO濃度顯著高于對照組，經(jīng)過治療后表達水平雖然顯著下降，但仍明顯高于對照組(P＜0.05)，其中觀察組下降水平顯著優(yōu)于常規(guī)治療組(P＜0.05，見表2)。

表2 各組APRIL、β2-m及TPO檢測結(jié)果比較Tab.2 Comparison of APRIL，β2-m and TPO detection results

2.3 觀察組不同療效患者的APRIL蛋白、β2-m及TPO表達水平比較 2個療程結(jié)束后，有效組患者病情得到有效控制，其血清APRIL、β2-m以及TPO表達水平顯著低于無效組(P＜0.05，見表3)。

表3 觀察組不同療效患者血清APRIL、β2-m及TPO表達水平比較Tab.3 Serum APRIL，β2-m and TPO expression levels in observation groupof patients with different curative effect

3 討論

MM作為臨床常見的惡性克隆性疾病之一，目前臨床治療多采用VAD方案，VAD雖然能夠有效改善MM臨床癥狀，但是其導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能損傷以及纖溶異常，增加血栓的風險［7］，并且其耐藥性較高，臨床治療效果并不理想。亞砷酸及沙利度胺作為臨床治療多發(fā)性骨髓瘤的新藥，研究發(fā)現(xiàn)［8］2者聯(lián)合維生素C不僅具有減少新血管生成、抑制骨髓瘤細胞、調(diào)節(jié)細胞因子分泌及骨髓瘤細胞基因表達的作用，而且能夠有效治療多發(fā)性骨髓瘤，而且耐藥性低、不良反應(yīng)少。雖然MM發(fā)病機制與以及預(yù)后評估的相關(guān)性研究始終是臨床的熱點，但是關(guān)于亞砷酸聯(lián)合T-VAD方案治療老年多發(fā)性骨髓瘤的研究仍然較為匱乏。

本實驗通過檢測老年多發(fā)性骨髓瘤患者血清APRIL、β2-m及TPO的表達水平，對亞砷酸聯(lián)合T-VAD方案的有效性進行評價。APRIL作為腫瘤壞死因子超家族的新成員之一，主要存在于外周血淋巴細胞、巨噬細胞、單核細胞、樹突狀細胞以及腫瘤細胞內(nèi)，能夠?qū)δ[瘤細胞生長起促進作用［9］。羅澤宇等人［10］認為APRIL作為MM細胞增殖存活受體之一，不僅能夠?qū)APK以及PI3/AKT信號途徑進行誘導(dǎo)，激活 COX-2活性，增加McL-1、BcL-2等從而促進抗凋亡蛋白的表達，提高PGE2生成量，從而促進骨髓瘤細胞增殖，延長其生存時間，而且能夠抑制細胞死亡，促進破骨細胞活化，增強粘附作用，加速MM惡化，其可作為判斷MM的有效指標。β2-m是體內(nèi)重要的低分子量蛋白之一，其位于細胞膜，具有完整組織相容性，是HLA抗原的重要組成部分。江榮科［11］認為β2-m異常增高主要與瘤細胞分化、瘤細胞壞死、免疫系統(tǒng)受損后淋巴細胞活性增加，β2-m與HLA腫瘤抗原形成以及腎小球過濾下降有關(guān)，因此其能夠較為準確地反映骨髓瘤細胞克隆及增殖活性，可作為MM評價療效、判斷預(yù)后的可靠指標之一［12］。TPO作為巨核細胞特異性促分化因子，不僅能夠?qū)藓思毎脑鲋?、分化及成熟進行調(diào)控，而且能夠分裂形成功能性血小板，TPO主要產(chǎn)生于肝臟、腎臟、脾臟及骨髓，能夠調(diào)控機體造血功能，研究發(fā)現(xiàn)［13-14］MM患者血小板減少不僅與血小板壽命、血小板抗體及毒性物質(zhì)有關(guān)，而且與TPO水平關(guān)系密切。本實驗結(jié)果顯示，與正常健康人相比，老年多發(fā)性骨髓瘤患者患者的血清APRIL、β2-m及TPO呈顯著高表達，經(jīng)過亞砷酸聯(lián)合T-VAD治療后，3者表達水平雖然仍高于健康人，但是與治療前相比顯著下降(P＜0.05)，而且有效組患者表達水平顯著低于無效患者(P＜0.05)，提示亞砷酸聯(lián)合T-VAD方案可能通過抑制血清APRIL、β2-m及TPO表達，有效治療老年多發(fā)性骨髓瘤。綜上所述，亞砷酸聯(lián)合T-VAD方案能夠降低血清APRIL、β2-m及TPO表達，顯著改善老年多發(fā)性骨髓瘤治療效果，值得臨床應(yīng)用。

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