張健

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 兒內(nèi)科，河南 新鄉(xiāng) 4530000)

白血病是嚴(yán)重威脅人類生命健康的惡性腫瘤之一，是一類造血干細(xì)胞的惡性克隆性疾病。白血病干細(xì)胞(leukemia stem cells，LSCs)概念最早于1994年被提出，Dick等通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)了LSCs的存在。LSCs具有強(qiáng)大的自我更新能力，多向分化潛能，產(chǎn)生耐藥等特點(diǎn)［1］。LSCs被認(rèn)為是導(dǎo)致白血病耐藥和復(fù)發(fā)的根源［2］。

三氧化二砷具有誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞分化、凋亡等作用，用于治療急性早幼粒細(xì)胞白血病取得了突出的療效，有學(xué)者認(rèn)為三氧化二砷是通過降低磷酸甘露糖異構(gòu)酶基因(phosphomannose isomerase，PMI基因)而靶向清除慢性粒細(xì)胞白血病患者體內(nèi)的白血病干細(xì)胞［3］。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein，IAPs)是近年來備受矚目的一類蛋白質(zhì)家族，獨(dú)立于Bcl-2的抗凋亡蛋白。某些IAPs成員異常高表達(dá)常引起細(xì)胞凋亡受阻，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。X連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP)是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制劑。X連鎖凋亡抑制蛋白是腫瘤細(xì)胞內(nèi)抑制凋亡發(fā)生的重要蛋白之一。蒽貝素是一種XIAP的小分子抑制劑，能夠通過抑制XIAP，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡［4-6］。本研究將蒽貝素與三氧化二砷聯(lián)合應(yīng)用，考察XIAP的小分子抑制劑蒽貝素對(duì)三氧化二砷抑制白血病干細(xì)胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 二氧化碳細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國熱電公司);流式細(xì)胞儀(美國貝克曼公司);DMEM高糖培養(yǎng)基(美國GIBCO公司);胎牛血清(美國康寧公司);蒽貝素(美國sigma公司);MTT試劑盒(sigma公司);注射用三氧化二砷(北京雙鷺?biāo)帢I(yè));其余試劑為分析純。人急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株(KG-1a，購自ATCC);非糖尿病型嚴(yán)重的聯(lián)合的免疫缺陷小鼠(成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司，動(dòng)物許可證號(hào):2013069283)。

1.2 白血病干細(xì)胞培養(yǎng) 人急性髓細(xì)胞白血病細(xì)胞株KG-1a購自美國ATCC，表達(dá)CD34+CD19+CD38+/-的KG-1a白血病干細(xì)胞由南京凱基生物分離。將KG-1a白血病干細(xì)胞置于含有100mg/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%CO2，飽和濕度，溫度為37℃。待細(xì)胞匯合度為0.8～0.9時(shí)，用2.5mg/L胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將白血病干細(xì)胞分為生理鹽水組、三氧化二砷組、蒽貝素組和三氧化二砷+蒽貝素組。

1.3 白血病干細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn) 培養(yǎng)KG-1a白血病干細(xì)胞接種于96孔板中，當(dāng)孔板中細(xì)胞完全貼壁且處于對(duì)數(shù)生長期時(shí)加入無菌過濾后的生理鹽水、三氧化二砷注射液(1 mmol/mL)、蒽貝素溶液(40 mmol/mL)和三氧化二砷(1 mmol/mL)與蒽貝素(40 mmol/mL)混合溶液各20μL，使各孔終體積為200μL。每組設(shè)5組重復(fù)。將孔板移入37℃ CO2孵箱中分別培養(yǎng)24、48 h后取出，每孔加入20μL 5mg/mL MTT溶液，再放回孵箱中繼續(xù)孵育4 h，將孔板中液體倒出，每孔加入200μL DMSO，37℃避光振搖15 min，用熒光讀數(shù)儀在490 nm處測(cè)定各孔的光密度值。

1.4 白血病干細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn) 按“1.2”項(xiàng)下培養(yǎng)細(xì)胞并給藥，將KG-1a白血病干細(xì)胞給藥孵育24 h，然后用冰PBS清洗細(xì)胞3次，F(xiàn)ITC/PI雙染，細(xì)胞避光放置15 min，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡數(shù)量。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)(wound healing assay)用來在體外判斷腫瘤細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)性和遷移能力。收集生長良好的KG-1a白血病干細(xì)胞，接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞生長融合率達(dá)到80%左右，用20μL移液槍頭垂直培養(yǎng)板機(jī)械性地劃出3條平行線，并用PBS洗滌細(xì)胞3次，保證劃痕處沒有細(xì)胞，補(bǔ)加完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。按照“1.2”項(xiàng)下給藥方法給藥，分別于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～6 h后，更換新鮮完全培養(yǎng)基，然后繼續(xù)培養(yǎng)18 h，考察劃痕兩側(cè)細(xì)胞間的距離和細(xì)胞遷移情況。

1.6 荷白血病小鼠模型動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 參照Saprap等方法［7］將培養(yǎng)的KG-1a白血病干細(xì)胞通過尾靜脈注射入非糖尿病型嚴(yán)重的聯(lián)合的免疫缺陷小鼠體內(nèi)，建模3 w后斷尾取血觀察小鼠外周血可見白血病細(xì)胞數(shù)目。取建模成功小鼠24只隨機(jī)分為4組，每組6只，分別為生理鹽水組、三氧化二砷注射液組(3mg/kg)、蒽貝素溶液組(120mg/kg)和三氧化二砷(3mg/kg)與蒽貝素(120mg/kg)混合溶液組。于分組后第3、6、9、12和15天給藥，觀察并記錄各組小鼠的生存期，繪制生存曲線。

2 結(jié)果

2.1 蒽貝素對(duì)三氧化二砷抑制白血病干細(xì)胞增殖的影響MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，三氧化二砷和蒽貝素對(duì)KG-1a白血病干細(xì)胞均有一定的增殖抑制作用。當(dāng)三氧化二砷與蒽貝素聯(lián)合用藥時(shí)，對(duì)KG-1a白血病干細(xì)胞的增殖具有更強(qiáng)的抑制作用，聯(lián)合用藥對(duì)白血病干細(xì)胞的抑制能力顯著強(qiáng)于單獨(dú)用藥，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05，見圖1)。

圖1 不同藥物干預(yù)對(duì)KG-1a白血病干細(xì)胞存活率的影響*P＜0.05，與生理鹽水相比;#P＜0.05，與三氧化二砷和蒽貝素比較;ΔP＜0.05，與24 h的三氧化二砷+蒽貝素比較Fig.1 Effect of various drugs on KG-1a cell viability*P＜0.05，compared with control group;#P＜0.05，compared with As2 O3 or embelin;ΔP＜0.05，compared with As2O3+embelin at 24 h

2.2 蒽貝素對(duì)三氧化二砷促進(jìn)白血病干細(xì)胞凋亡的影響研究藥物體外誘導(dǎo)KG-1a白血病干細(xì)胞凋亡的定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三氧化二砷、蒽貝素和聯(lián)合給藥都能不同程度誘導(dǎo)白血病干細(xì)胞的凋亡。各組誘導(dǎo)白血病干細(xì)胞壞死和早期凋亡率分別為36.96%、35.1%和94.1%，而對(duì)照生理鹽水組早期凋亡率為0.24%(見圖2)。

圖2 各給藥組對(duì)白血病干細(xì)胞凋亡的影響A:生理鹽水組;B:三氧化二砷組;C:蒽貝素組;D:聯(lián)合用藥組Fig.2 Effect of various drugs on KG-1a leukemia stem cells apoptosisA:saline group;B:As2 O3 group;C:embelin group;D:As2 O3+embelin group

2.3 蒽貝素聯(lián)合三氧化二砷對(duì)細(xì)胞遷移的影響 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示:生理鹽水組，三氧化二砷干預(yù)組和蒽貝素干預(yù)組的細(xì)胞均向中間劃痕區(qū)域生長，即細(xì)胞向“傷口”內(nèi)運(yùn)動(dòng)遷移。而聯(lián)合干預(yù)組處理后的細(xì)胞這種現(xiàn)象減弱很多，僅有少數(shù)的細(xì)胞向劃痕中央遷移，但是比各單獨(dú)給藥組和生理鹽水組要少很多。結(jié)果說明，三氧化二砷和蒽貝素聯(lián)合干預(yù)能夠有效抑制KG-1a白血病干細(xì)胞的“傷口愈合”，從而影響KG-1a白血病干細(xì)胞的遷移性。

圖3 各給藥組對(duì)KG-1a白血病干細(xì)胞遷移能力的影響Fig.3 Effect of various drugs on KG-1a leukemia stem cells motility and migration

2.4 蒽貝素聯(lián)合三氧化二砷對(duì)荷瘤鼠中位生存期的影響荷瘤小鼠給藥第5次后停止給藥，直至小鼠全部自然死亡，統(tǒng)計(jì)各組小鼠的生存期，繪制Kplan-Meier曲線(見圖4)。結(jié)果顯示:生理鹽水組，蒽貝素組，三氧化二砷組和聯(lián)合給藥組的中位生存期分別為23、26、31和37d，聯(lián)合給藥能夠顯著延長荷瘤小鼠的生存期。

圖4 各組荷瘤小鼠的kaplan-meier曲線1.生理鹽水組;2.蒽貝素組;3.三氧化二砷組;4.三氧化二砷組+蒽貝素組Fig.4 kaplan-meier curves of tumor rats after treated with different drugs1.saline group;2.embelin group;3.As2 O3 group;4.As2 O3+embelin group

3 討論

造血干細(xì)胞是最早被證實(shí)存在的干細(xì)胞，而“腫瘤干細(xì)胞”這一概念最早被應(yīng)用于白血病。學(xué)術(shù)界廣泛認(rèn)為腫瘤干細(xì)胞是腫瘤耐藥、復(fù)發(fā)的根源［2］。目前針對(duì)白血病干細(xì)胞的治療策略包括抑制干細(xì)胞的信號(hào)通路分子、誘導(dǎo)干細(xì)胞凋亡、改變腫瘤微環(huán)境相關(guān)分子等［8-9］。

2010年，香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院發(fā)現(xiàn)，若劑量適當(dāng)，砒霜的潛在毒性會(huì)被解除，尤其是對(duì)心臟的副作用會(huì)大大減低，并成功把砒霜研發(fā)成為處方的口服藥物，已治愈超過一百名血癌病人?；颊呓邮艽隧?xiàng)治療的存活率達(dá)七成［10-11］?？诜€能應(yīng)用于治療其他癌癥，包括淋巴癌和多發(fā)性骨髓瘤。目前國內(nèi)外的研究者們對(duì)三氧化二砷的抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行了廣泛而深入的研究，己證實(shí)三氧化二砷不僅對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤有效，其對(duì)實(shí)體瘤如乳癌、肺癌、膀胱癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、頭頸部腫瘤、食管癌、胃癌、肝癌的生長和增殖均有抑制作用［12-14］。蒽貝素是一種XIAP的小分子抑制劑，能夠通過抑制XIAP，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。蒽貝素與其他化療藥物聯(lián)用能夠有效增強(qiáng)化療藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制效果［15］。

本研究將三氧化二砷與蒽貝素聯(lián)合用于白血病干細(xì)胞的治療研究。研究結(jié)果表明，三氧化二砷聯(lián)合蒽貝素能夠有效抑制KG-1a白血病干細(xì)胞的增殖，蒽貝素能夠促進(jìn)三氧化二砷誘導(dǎo)KG-1a白血病干細(xì)胞凋亡。腫瘤干細(xì)胞具有強(qiáng)大的自我更新能力和多向分化潛能。本研究通過細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)考察給藥后腫瘤細(xì)胞的遷移能力。遷移是腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。遷移就是腫瘤細(xì)胞與母體瘤分離，穿越血管壁，侵襲周邊正常組織時(shí)，需要一定的運(yùn)動(dòng)能力。結(jié)果顯示出聯(lián)合用藥能夠有效抑制白血病干細(xì)胞的遷移。體內(nèi)荷瘤鼠治療實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組生理鹽水和各單獨(dú)給藥組相比，聯(lián)合給藥都能夠有效延長荷瘤小鼠的中位生存期。

綜上所述，蒽貝素能夠有效增強(qiáng)三氧化二砷對(duì)白血病干細(xì)胞的增殖抑制作用，誘導(dǎo)白血病干細(xì)胞凋亡，其機(jī)制與蒽貝素的抑制劑XIAP有關(guān)。三氧化二砷與蒽貝素聯(lián)合應(yīng)用是一種潛在的抗腫瘤干細(xì)胞治療方法。

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