王海蓉 趙 靜 趙傳玉

（1.哈爾濱申宜科技有限公司，黑龍江 哈爾濱 150090；2.黑龍江省計算中心，150028）

刺五加為五加科植物，又名五加參，其根、莖、葉均可作為藥用，是東北地區(qū)典型的藥用植物，味辛、微苦，無毒。具有益氣健脾、益精壯骨、補腎安神之功效。其中的黃酮類化合物更是具有廣泛的藥理活性，它存在于刺五加的各部位，屬葉中含量最高。

隨著時代的進步和科學技術的發(fā)展，提取刺五加中黃酮類化合物的提取方法也日益廣泛應用于黃酮類化合物的提取中，如微波法、超聲法、超臨界流體萃取法等。傳統(tǒng)提取法都有共同的缺點就是提取時間長，溶劑用量大，提取率不高等。現(xiàn)代提取法超臨界流體萃取法雖選擇性強、提取物純度高，但由于其操作壓力高、能量消耗大、自身成本較高，因而不能進行工業(yè)生產(chǎn)。

我們自行研制的“逆流-超聲-熱壓”聯(lián)用提取技術是基于連續(xù)逆流提取技術和超聲強化提取技術的融合與改進。在逆流提取過程中，間歇地對被浸提的植物原料進行機械擠壓及局部加熱，植物原料在機械壓力和局部升溫的雙重作用下，在極短的時間內(nèi)完成一次徹底的傳質(zhì)交換過程。該技術為我單位最新研發(fā)成功的專有技術，目前已經(jīng)完成樣機測試檢驗，具有工作能耗低、溶媒用量少、提取率高、可低溫高效浸提等多方面優(yōu)勢特點。

1.材料與方法

1.1 材料與儀器

刺五加葉，采自黑龍江省七臺河市金沙農(nóng)場。槲皮素標準品，中國藥品生物制品檢定所；實驗所用試劑均為分析純試劑，北京化工試劑廠；實驗用水由蒸餾水經(jīng)純化器純化所得。

自主研發(fā)的“逆流-超聲-熱壓”聯(lián)用提取設備；BS-124，電子天平，Sartorius AG，德國；紫外可見分光光度計，上海分析儀器公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海；TDL-5-A低速大容量離心機，上海安寧科學儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料預處理

將新鮮的黑龍江省刺五加葉洗凈、曬干、粉碎，放在干燥器中備用。

1.2.2 標準品的制備

精確稱取槲皮素標準品2.00mg，加60%的乙醇定容至50 mL容量瓶中，得到0.2 mg/mL 的標準品溶液。5 % NaNO2吸光度（A）為縱坐標，對照品濃度（C）為橫坐標繪制標準曲線。

1.2.5 正交試驗設計

為進一步優(yōu)化“逆流-超聲-熱壓”聯(lián)用提取技術提取刺五加葉中黃酮類化合物的實驗條件，以溶劑濃度，提取時間、提取次數(shù)和料液比作為提取因素，按照L9（3）4進行提取，如表1所示。溶液：稱取5g分析純NaNO2，用蒸餾水溶解后定容至100 mL；10 % Al（NO3）3溶液：稱取10g 分析純Al（NO3）3用蒸餾水定容至100 mL；4 % NaOH溶液：稱取4 g分析純NaOH，用蒸餾水溶解后定容至100 mL。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.3 “逆流-超聲-熱壓”聯(lián)用提取法

由于該實驗使用的是企業(yè)中試型設備，所以，刺五加葉原料的使用量和溶劑的使用量較多。首先取出2.5kg用50%的工業(yè)乙醇在提取設備內(nèi)提取，提取時間為 1.5 h，料液比為20倍，將提取液合并后用石油醚處理，直至浸提液無色，使葉綠素和其它親脂性物質(zhì)完全除去。最后將提取液減壓蒸餾至干。取刺五加粉末3份，每份約2.5000±0.0002 g，用60%的乙醇分別溶解并定容在250 mL容量瓶中，冷藏備用。

1.2.4 總黃酮含量的測定

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉法,取0.2 mL提取液于5mL的容量瓶中，加入0.2 mL 5% NaNO2溶液，搖勻，靜置6 min；分別加入0.2 mL 10% Al（NO3）3溶液，搖勻，靜置 6 min；再分別加入1.0 mL 4%NaOH 溶液，用 60%乙醇定容，搖勻，靜置 15 min，在500nm處測吸光度。以

2 結(jié)果與討論

2.1 溶劑濃度對“逆流-超聲-熱壓”聯(lián)用提取技術提取率的影響

料液比為1：20，提取時間為2h，用不同濃度的乙醇溶液為提取溶劑進行提取2次，乙醇溶液濃度分別為30%、40%、50%、70%、80%、100%。采用分光光度法測定各提取液中總黃酮的含量。

從實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，總黃酮的含量隨著乙醇濃度的增加而增加，當乙醇含量為50%時，提取的總黃酮含量為53.23mg/g，總黃酮含量最高；而后雖乙醇濃度的增加，總黃酮含量減少，可見采用50%的乙醇溶液提取刺五加葉中黃酮類化合物的效果最佳。

2.2 提取時間對提取率的影響

用50%乙醇，料液比為1：20，在不同的提取時間：1h、1.5h、2h、2.5h、3h，進行提取2次,采用分光光度法測定各提取液中總黃酮的含量。

從實驗結(jié)果得出：隨著時間的增加，總黃酮含量相應增加，但是提取時間2h后，增加幅度明顯減小，所以選擇提取時間為2h。

2.3 提取次數(shù)對提取率的影響

提取溶劑乙醇含量為50%，料液比為1：20，用不同的提取次數(shù)：1次、2次、3次、4次，提取2h，采用分光光度法測定各提取液中總黃酮的含量。

表2 正交實驗結(jié)果表

表3 正交實驗方差分析表

表4 最佳工藝條件的驗證結(jié)果

從實驗結(jié)果得出，隨著提取次數(shù)的增加，總黃酮含量增加，增加幅度逐漸減慢?？紤]到經(jīng)濟實用等方面因素，選擇提取2次最為合適。

2.4 料液比對提取率的影響

提取溶劑乙醇含量為50%，提取時間 2h，在不同的料液比：1：10、1：15、1：20、1：25、1：30，提取 2 次，采用分光光度法測定各提取液中總黃酮的含量。

從實驗結(jié)果得出，隨著溶劑用量的增加，總黃酮含量也增加。當溶劑用量達到20倍后，刺五加液中總黃酮含量基本保持不變，所以從節(jié)約成本等多方面因素選擇溶劑用量為20倍。

2.5 正交實驗的考察

2.5.1 結(jié)果及方差分析

以溶劑濃度、提取時間、提取次數(shù)和料液比作為四因素進行L9（3）4正交試驗，得到實驗結(jié)果如表2所示：

正交實驗的方差分析結(jié)構如表3：

結(jié)合極差分析和方差分析可知，溶劑濃度、提取時間、料液比三因素對總黃酮提取量的影響主次順序為：提取次數(shù)（C）>溶劑濃度（A）>料液比（D）＞提取時間（B）,最佳的提取條件為：A2B1C2D3，即溶劑濃度為50%，提取時間為2h，提取次數(shù)為2次，料液比為1：20。

2.5.2 最佳工藝的驗證

在優(yōu)化組合A2B1C2D3的條件下，進行三次平行驗證試驗，以驗證最優(yōu)工藝的可行性和合理性。結(jié)果如表4所示，在最優(yōu)提取工藝下，提取的總黃酮的平均含量為53.85mg/g，相對標準偏差為0.85%，該方法可行性較高。

結(jié)語

通過采用“逆流-超聲-熱壓”聯(lián)用提取技術提取刺五加葉中的黃酮類化合物，間歇地對原料進行熱壓和釋放作用，提取效率顯著提高。因而確定最佳實驗條件為：溶劑為50%乙醇、提取時間為2h、提取次數(shù)2次、料液比為1：20。此新設備具有耗能低、提取效率高、操作簡單、成本低廉等特點，為更好的開發(fā)利用刺五加葉中的黃酮類化合物提供了實驗參考和依據(jù)。

[1]中華人民共和國藥典（一部）[s].廣州：廣東科技出版社,2000.

[2]許正斌，童萬軍，楊廣.Chinese Traditional Herb Medicine（ 中 草藥）,1984,15：224 ～226.

[3]劉春燕.水平管道式連續(xù)逆流浸出器[P].中國：ZL201120386007.3,2012-5-30.

[4]程乃春.一種多級組合連續(xù)逆流超聲提取設備[P].中國：ZL 2010 1 0578468.0,2012-10-24.