摘要：采用超聲波法提取及大孔樹脂吸附法分離純化大果沙棘黃酮，以蕓香苷、兒茶素為對照，測定大果沙棘果渣黃酮對羥基自由基（·OH）、對超氧陰離子（ O-2· ）、DPPH·自由基、ABTS+自由基的清除能力。結(jié)果表明，分離純化前后的大果沙棘黃酮對超氧陰離子（ O-2· ）、羥基自由基（·OH）、DPPH·自由基、ABTS+自由基的清除能力都較高，相同濃度下，清除效果略低于蕓香苷、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)對照品。純化后總黃酮的體外抗氧化能力都強(qiáng)于粗提黃酮。

關(guān)鍵詞：大果沙棘；果渣；黃酮；抗氧化活性；純化

中圖分類號： R284.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0285-02

收稿日期：2013-12-27

基金項目：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)與研究項目（編號：12521593） 。

作者簡介：焦巖（1981—），男，黑龍江肇東人，博士，講師，研究方向為植物活性物質(zhì)與功能食品。E-mail：jiaoyan_3000@126.com。沙棘（Hippophae rhamnoides L.）為胡頹子科（Elaeagnaceae）酸刺屬植物，在俄羅斯、蒙古、中國等國分布較多[1-2]。沙棘含有豐富的黃酮類物質(zhì)，果實中黃酮含量為0.309%～0.945%。研究表明，沙棘果實中的黃酮類能增強(qiáng)人體的耐受性、減少毛細(xì)血管的滲透性，對血液中的膽固醇、甘油三酯有明顯的降低作用，對血垢、陳血細(xì)胞、血液中的垃圾有顯著的凈化作用[3-5]。目前，沙棘飲料加工過程中，常將沙棘果皮渣作為廢料丟棄，不僅造成環(huán)境污染，也是一種資源浪費。本研究分析大果沙棘果渣中的總黃酮含量及其抗氧化活性，旨在為大果沙棘的綜合加工利用提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料

大果沙棘果渣由黑龍江省黑河市孫吳縣林業(yè)局提供。蕓香苷、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品、DPPH（1，1-dipheny1-2-picrylhydra-zyl）、ABTS[2，2′-amino-di（2-ethyl-benzothiazoline sulphonic acid-6）ammonium salt]購自美國Sigma公司；無水乙醇、亞硝酸鈉、硝酸鋁、硫酸亞鐵、雙氧水、水楊酸、鄰苯三酚等試劑均為國產(chǎn)分析純。756PC型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司），PHS-25型數(shù)顯pH計（上海精密科學(xué)儀器有限公司），ALC-110.4電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），XW-80A漩渦混合器（天津市歐諾儀器儀表有限公司），TDL-5型臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1.2方法

1.2.1大果沙棘果渣總黃酮提取純化用超臨界CO2萃取設(shè)備將大果沙棘果渣脫脂。用75%乙醇作為溶劑，將脫脂后的大果沙棘果渣粉以10 mL ∶1 g液固比超聲波提取3次，將得到的黃酮液經(jīng)過離心、過濾、濃縮、除去乙醇等步驟，得到大果沙棘果渣黃酮溶液[6]。將黃酮溶液用X-5大孔樹脂層析柱進(jìn)行純化，純化后真空凍干得到橙黃色固體粉末，采用 NaNO2-Al（NO3）3 比色法測定結(jié)果表明，分離前后大果沙棘果渣黃酮純度分別為11.9%、34.1%[7-8]。用甲醇溶解，配制成濃度分別為10～200 mg/L的黃酮溶液進(jìn)行體外抗氧化試驗。

1.2.2大果沙棘總黃酮對羥自由基（·OH）的清除作用[9]在若干個10 mL比色管中依次加入10 mmoL/L水楊酸溶液0.5 mL，取0.5 mL不同濃度的純化前后的大果沙棘總黃酮溶液以及蕓香苷、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，加入0.5 mL 10 mmoL/L FeSO4 溶液、3.5 mL蒸餾水混合后加入5 mL 88 mmol/L H2O2溶液，啟動 Fenton反應(yīng)，混勻后于510 nm波長下測定吸光度D1。取0.5 mL蒸餾水代替10 mmoL/L FeSO4 溶液，510 nm波長下測定吸光度D2。取0.5 mL蒸餾水代替樣品溶液，510 nm波長下測定吸光度D3。羥自由基（·OH）清除率計算公式如下：

羥自由基清除率=[1-（D1-D2）/D3]×100%。

1.2.3對超氧陰離子（ O-2· ）的清除試驗[10]取pH值為 8.2的50 mmol/L Tris-HCl緩沖溶液4.5 mL，加入4.2 mL蒸餾水，混勻后在25 ℃水浴中保溫20 min，取出后立即加入25 ℃下預(yù)熱的0.3 mL鄰苯三酚溶液（用10 mmol/L HCl配制），迅速搖勻后，于325 nm波長下每隔30 s測定1次吸光度，鄰苯三酚自氧化5 min后，計算線性范圍內(nèi)每分鐘吸光度的增加值ΔD0，用10 mmol/L HCl代替鄰苯三酚作為空白。在加入鄰苯三酚之前，加入不同體積的200 μg/mL純化前后的大果沙棘總黃酮溶液以及蕓香苷、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品溶液作為待測液，按照上述步驟測定每分鐘吸光度的增加值ΔD。 O-2· 清除率計算公式如下：

O-2· 清除率=（ΔD0-ΔD）/ΔD×100%。

1.2.4大果沙棘總黃酮對DPPH·自由基清除效果[11]準(zhǔn)確稱取20 mg DPPH，用無水乙醇溶解并定容至250 mL，配制DPPH溶液。分別吸取10～100 mg/mL純化前后的大果沙棘總黃酮溶液以及蕓香苷、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)品溶液 2.0 mL 置于具塞試管中（分2組），向其中一組加入DPPH溶液至2 mL，搖勻30 min后，用無水乙醇作參比在517 nm波長下測吸光度Di。測定2 mL DPPH溶液與2 mL無水乙醇混合后的吸光度Dc。向另一組中加入無水乙醇至2 mL，混合后測其吸光度Dj。DPPH·自由基清除率K計算公式如下：

K=[1-（Di-Dj）/Dc]×100%。

1.2.5大果沙棘總黃酮清除ABTS+自由基的活力測定[12]將5 mL 7 mmol/L ABTS溶液與88 μL 140 mmol/L過硫酸鉀溶液混合，室溫避光條件下靜置過夜，形成ABTS+自由基儲備液。該儲備液在室溫避光條件下穩(wěn)定。使用前用無水乙醇稀釋成工作液，要求其在30 ℃、734 nm波長下的吸光度為0.7±0.02。取100 μL不同濃度的大果沙棘黃酮及對照品溶液，加入2 mL ABTS+溶液，振蕩30 s，20 ℃下測定混合液在734 nm處6 min內(nèi)的吸光度變化。ABTS+自由基抑制率計算公式如下：endprint

抑制率=D0-（Dt-B）/D0×100%。

式中：D0為未加樣品的ABTS+的吸光度；Dt表示樣品與ABTS反應(yīng)的吸光度；B表示空白樣品的吸光度；t=6 min。

2結(jié)果與分析

2.1大果沙棘總黃酮對羥自由基（·OH）的清除效果

由圖1可以看出，當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為20～100 μg/mL 時，·OH清除率較高。當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為100 μg/mL時，純化前后總黃酮對·OH的清除率分別為448%、54.9%，略低于兒茶素、蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品。對·OH的清除能力由大到小依次為兒茶素>蕓香苷>純化黃酮>粗提黃酮。

2.2大果沙棘總黃酮對超氧陰離子（ O-2· ）的清除效果

由圖2可以看出，當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為40～200 μg/mL時，對 O-2·清除率較高。當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為200 μg/mL時，純化前后黃酮對 O-2· 的清除率分別為539%、62.7%，低于兒茶素、蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品。對O-2·的清除能力由大到小依次為兒茶素>蕓香苷>純化黃酮>粗提黃酮。

2.3大果沙棘總黃酮對DPPH·自由基清除效果

由圖3可以看出，當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為20～100 μg/mL 時，對DPPH·自由基清除率較高。當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為100 μg/mL時，純化前后黃酮對DPPH·自由基的清除率分別為49.7%、65.1%。

2.4大果沙棘總黃酮對ABTS+自由基的清除效果

由圖4可知，當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為20～40 μg/mL時，對ABTS+自由基清除能力由大到小依次為兒茶素>蕓香苷>純化黃酮>粗提黃酮；但是當(dāng)濃度大于60 μg/mL時，純化黃酮對ABTS+自由基的清除能力略大于蕓香苷，但始終小于兒茶素。

3結(jié)論

本研究探討了大果沙棘果渣總黃酮的體外抗氧化能力，結(jié)果表明，分離純化前后的大果沙棘黃酮對超氧陰離子（O-2· ）、羥基自由基（·OH）、DPPH·自由基、ABTS+自由基的清除能力都較高，相同濃度下，清除效果略低于蕓香苷、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)對照品。純化后總黃酮的體外抗氧化能力都強(qiáng)于粗提黃酮，說明大果沙棘黃酮的純度及其抗氧化活性存在著顯著的量效關(guān)系，通過和黃酮類標(biāo)準(zhǔn)品對比也進(jìn)一步證實了大果沙棘總黃酮的體外抗氧化作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉雪凌，權(quán)永榮，陳旭華. 沙棘產(chǎn)品的開發(fā)及應(yīng)用前景[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（16）：8960-8961，8987.

[2]閆濤，羅麗梅，謝竹田，等. 沙棘的化學(xué)成分及生物功能的研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，2010，31（1）：52-54.

[3]李垚，張慧穎，王鵬祖. 沙棘營養(yǎng)成分及作用的研究進(jìn)展[J].中國初級衛(wèi)生保健，2007，21（3）：73-76.

[4]Ercisli S，Orhan E，Ozdemir O，et al. The genotypic effects on the chemical composition and antioxidant activity of sea buckthorn （Hippophae rhamnoides L.） berries grown in Turkey[J]. Scientia Horticulturae，2007，115（1）：27-33.

[5]張濱，粟登權(quán)，曾丹，等. 響應(yīng)面法提取沙棘抗氧化成分工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)，2013，34（5）：75-79.

[6]杜廣芬，蔡志華，代斌，等. 超聲波-微波協(xié)同提取沙棘總黃酮的研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（8）：330-332，343.

[7]杜瑞娟，張聰璐，梁寧，等. 大孔樹脂純化核桃楸皮總黃酮工藝[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2013，30（4）：298-302.

[8]何可群，李相興.民族藥金絲梅總黃酮含量的測定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（5）：307-309.

[9]陳玉霞，劉建華，林峰，等. DPPH和FRAP法測定41種中草藥抗氧化活性[J].實驗室研究與探索，2011，30（6）：11-14.

[10]趙丹丹，鄭鴻雁. 多年生藤本豆與大豆中黃酮類化合物體外抗氧化活性比較研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（8）：154-157.

[11]邱金東，湯昆. DPPH和ABTS法測定核桃仁的體外抗氧化活性[J].中成藥，2008，30（8）：1215-1216.

[12]孟慶煥，王化，王洪政，等. 牡丹種皮黃酮提取及對ABTS自由基清除作用[J].植物研究，2013，33（4）：504-507.楊懷君，閻洪山，盧勇濤，等. 烏斯特智能在線檢測控制系統(tǒng)試驗分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：287-288.endprint

抑制率=D0-（Dt-B）/D0×100%。

式中：D0為未加樣品的ABTS+的吸光度；Dt表示樣品與ABTS反應(yīng)的吸光度；B表示空白樣品的吸光度；t=6 min。

2結(jié)果與分析

2.1大果沙棘總黃酮對羥自由基（·OH）的清除效果

由圖1可以看出，當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為20～100 μg/mL 時，·OH清除率較高。當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為100 μg/mL時，純化前后總黃酮對·OH的清除率分別為448%、54.9%，略低于兒茶素、蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品。對·OH的清除能力由大到小依次為兒茶素>蕓香苷>純化黃酮>粗提黃酮。

2.2大果沙棘總黃酮對超氧陰離子（ O-2· ）的清除效果

由圖2可以看出，當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為40～200 μg/mL時，對 O-2·清除率較高。當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為200 μg/mL時，純化前后黃酮對 O-2· 的清除率分別為539%、62.7%，低于兒茶素、蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品。對O-2·的清除能力由大到小依次為兒茶素>蕓香苷>純化黃酮>粗提黃酮。

2.3大果沙棘總黃酮對DPPH·自由基清除效果

由圖3可以看出，當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為20～100 μg/mL 時，對DPPH·自由基清除率較高。當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為100 μg/mL時，純化前后黃酮對DPPH·自由基的清除率分別為49.7%、65.1%。

2.4大果沙棘總黃酮對ABTS+自由基的清除效果

由圖4可知，當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為20～40 μg/mL時，對ABTS+自由基清除能力由大到小依次為兒茶素>蕓香苷>純化黃酮>粗提黃酮；但是當(dāng)濃度大于60 μg/mL時，純化黃酮對ABTS+自由基的清除能力略大于蕓香苷，但始終小于兒茶素。

3結(jié)論

本研究探討了大果沙棘果渣總黃酮的體外抗氧化能力，結(jié)果表明，分離純化前后的大果沙棘黃酮對超氧陰離子（O-2· ）、羥基自由基（·OH）、DPPH·自由基、ABTS+自由基的清除能力都較高，相同濃度下，清除效果略低于蕓香苷、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)對照品。純化后總黃酮的體外抗氧化能力都強(qiáng)于粗提黃酮，說明大果沙棘黃酮的純度及其抗氧化活性存在著顯著的量效關(guān)系，通過和黃酮類標(biāo)準(zhǔn)品對比也進(jìn)一步證實了大果沙棘總黃酮的體外抗氧化作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉雪凌，權(quán)永榮，陳旭華. 沙棘產(chǎn)品的開發(fā)及應(yīng)用前景[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（16）：8960-8961，8987.

[2]閆濤，羅麗梅，謝竹田，等. 沙棘的化學(xué)成分及生物功能的研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，2010，31（1）：52-54.

[3]李垚，張慧穎，王鵬祖. 沙棘營養(yǎng)成分及作用的研究進(jìn)展[J].中國初級衛(wèi)生保健，2007，21（3）：73-76.

[4]Ercisli S，Orhan E，Ozdemir O，et al. The genotypic effects on the chemical composition and antioxidant activity of sea buckthorn （Hippophae rhamnoides L.） berries grown in Turkey[J]. Scientia Horticulturae，2007，115（1）：27-33.

[5]張濱，粟登權(quán)，曾丹，等. 響應(yīng)面法提取沙棘抗氧化成分工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)，2013，34（5）：75-79.

[6]杜廣芬，蔡志華，代斌，等. 超聲波-微波協(xié)同提取沙棘總黃酮的研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（8）：330-332，343.

[7]杜瑞娟，張聰璐，梁寧，等. 大孔樹脂純化核桃楸皮總黃酮工藝[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2013，30（4）：298-302.

[8]何可群，李相興.民族藥金絲梅總黃酮含量的測定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（5）：307-309.

[9]陳玉霞，劉建華，林峰，等. DPPH和FRAP法測定41種中草藥抗氧化活性[J].實驗室研究與探索，2011，30（6）：11-14.

[10]趙丹丹，鄭鴻雁. 多年生藤本豆與大豆中黃酮類化合物體外抗氧化活性比較研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（8）：154-157.

[11]邱金東，湯昆. DPPH和ABTS法測定核桃仁的體外抗氧化活性[J].中成藥，2008，30（8）：1215-1216.

[12]孟慶煥，王化，王洪政，等. 牡丹種皮黃酮提取及對ABTS自由基清除作用[J].植物研究，2013，33（4）：504-507.楊懷君，閻洪山，盧勇濤，等. 烏斯特智能在線檢測控制系統(tǒng)試驗分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：287-288.endprint

抑制率=D0-（Dt-B）/D0×100%。

式中：D0為未加樣品的ABTS+的吸光度；Dt表示樣品與ABTS反應(yīng)的吸光度；B表示空白樣品的吸光度；t=6 min。

2結(jié)果與分析

2.1大果沙棘總黃酮對羥自由基（·OH）的清除效果

由圖1可以看出，當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為20～100 μg/mL 時，·OH清除率較高。當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為100 μg/mL時，純化前后總黃酮對·OH的清除率分別為448%、54.9%，略低于兒茶素、蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品。對·OH的清除能力由大到小依次為兒茶素>蕓香苷>純化黃酮>粗提黃酮。

2.2大果沙棘總黃酮對超氧陰離子（ O-2· ）的清除效果

由圖2可以看出，當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為40～200 μg/mL時，對 O-2·清除率較高。當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為200 μg/mL時，純化前后黃酮對 O-2· 的清除率分別為539%、62.7%，低于兒茶素、蕓香苷標(biāo)準(zhǔn)品。對O-2·的清除能力由大到小依次為兒茶素>蕓香苷>純化黃酮>粗提黃酮。

2.3大果沙棘總黃酮對DPPH·自由基清除效果

由圖3可以看出，當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為20～100 μg/mL 時，對DPPH·自由基清除率較高。當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為100 μg/mL時，純化前后黃酮對DPPH·自由基的清除率分別為49.7%、65.1%。

2.4大果沙棘總黃酮對ABTS+自由基的清除效果

由圖4可知，當(dāng)大果沙棘總黃酮濃度為20～40 μg/mL時，對ABTS+自由基清除能力由大到小依次為兒茶素>蕓香苷>純化黃酮>粗提黃酮；但是當(dāng)濃度大于60 μg/mL時，純化黃酮對ABTS+自由基的清除能力略大于蕓香苷，但始終小于兒茶素。

3結(jié)論

本研究探討了大果沙棘果渣總黃酮的體外抗氧化能力，結(jié)果表明，分離純化前后的大果沙棘黃酮對超氧陰離子（O-2· ）、羥基自由基（·OH）、DPPH·自由基、ABTS+自由基的清除能力都較高，相同濃度下，清除效果略低于蕓香苷、兒茶素標(biāo)準(zhǔn)對照品。純化后總黃酮的體外抗氧化能力都強(qiáng)于粗提黃酮，說明大果沙棘黃酮的純度及其抗氧化活性存在著顯著的量效關(guān)系，通過和黃酮類標(biāo)準(zhǔn)品對比也進(jìn)一步證實了大果沙棘總黃酮的體外抗氧化作用。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉雪凌，權(quán)永榮，陳旭華. 沙棘產(chǎn)品的開發(fā)及應(yīng)用前景[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（16）：8960-8961，8987.

[2]閆濤，羅麗梅，謝竹田，等. 沙棘的化學(xué)成分及生物功能的研究進(jìn)展[J].吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報，2010，31（1）：52-54.

[3]李垚，張慧穎，王鵬祖. 沙棘營養(yǎng)成分及作用的研究進(jìn)展[J].中國初級衛(wèi)生保健，2007，21（3）：73-76.

[4]Ercisli S，Orhan E，Ozdemir O，et al. The genotypic effects on the chemical composition and antioxidant activity of sea buckthorn （Hippophae rhamnoides L.） berries grown in Turkey[J]. Scientia Horticulturae，2007，115（1）：27-33.

[5]張濱，粟登權(quán)，曾丹，等. 響應(yīng)面法提取沙棘抗氧化成分工藝優(yōu)化[J].食品工業(yè)，2013，34（5）：75-79.

[6]杜廣芬，蔡志華，代斌，等. 超聲波-微波協(xié)同提取沙棘總黃酮的研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（8）：330-332，343.

[7]杜瑞娟，張聰璐，梁寧，等. 大孔樹脂純化核桃楸皮總黃酮工藝[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2013，30（4）：298-302.

[8]何可群，李相興.民族藥金絲梅總黃酮含量的測定[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，41（5）：307-309.

[9]陳玉霞，劉建華，林峰，等. DPPH和FRAP法測定41種中草藥抗氧化活性[J].實驗室研究與探索，2011，30（6）：11-14.

[10]趙丹丹，鄭鴻雁. 多年生藤本豆與大豆中黃酮類化合物體外抗氧化活性比較研究[J].食品工業(yè)科技，2013，34（8）：154-157.

[11]邱金東，湯昆. DPPH和ABTS法測定核桃仁的體外抗氧化活性[J].中成藥，2008，30（8）：1215-1216.

[12]孟慶煥，王化，王洪政，等. 牡丹種皮黃酮提取及對ABTS自由基清除作用[J].植物研究，2013，33（4）：504-507.楊懷君，閻洪山，盧勇濤，等. 烏斯特智能在線檢測控制系統(tǒng)試驗分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：287-288.endprint