張文慧　李雪嬌　錢愛東

摘要：豬流感是由豬流感病毒引起的一種急性、高度接觸傳染性豬傳染病，對養(yǎng)豬業(yè)危害極大。豬流感病毒也可感染人類，對人類的生命健康造成威脅。對豬流感病毒的分子檢測技術(shù)及我國豬流感的流行現(xiàn)狀進行了綜述。

關(guān)鍵詞：豬流感；流行現(xiàn)狀；分子檢測

中圖分類號： S858.28；S852.65+1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0059-02

收稿日期：2013-12-09

基金項目：國家科技支撐計劃（編號：2012BAD04B01-5）。

作者簡介：張文慧（1977—），女，吉林樺甸人，博士，副教授，從事微生物學研究。E-mail：215267612@qq.com。

通信作者：錢愛東，從事微生物學研究。Tel：（0431）84533426；E-mail：qianaidongO115@163.com。豬流感（swine influenza，SI）是由豬流感病毒（swine influenza virus，SIV）引起的一種急性、高度接觸傳染性豬傳染病。1918年，美國首次報道了SI。1930年，Shope分離并鑒定了第一株豬流感病毒SIV A/Swine/Iowa/15/30（H1N1），該病毒被認為是美國20世紀初發(fā)生的SI病原[1]。該病傳播迅速，往往2～3 d內(nèi)波及全群?？祻拓i、隱性感染豬是豬流感病毒的主要儲存宿主，也是豬流感的主要傳染源[2]。該病一年四季都可發(fā)生，在規(guī)?；B(yǎng)豬場難以根除，對養(yǎng)豬業(yè)危害極大。另外，SIV的HA受體結(jié)合位點具有與人流感病毒、禽流感病毒2種流感病毒受體相同的結(jié)合特異性，這決定了SIV不僅可以感染豬，同時也可感染人類[3]。歷史上SIV感染人的報道并不罕見。1976年美國新澤西州一名士兵死于古典H1N1 SIV感染，這是人類歷史上首例SIV致死人的報道，之后在其他地區(qū)也出現(xiàn)SIV感染人并致死的報告[4-5]。迄今為止，豬流感已遍及世界各地，已經(jīng)分離出H1N1、H1N2、 H2N3、H3N1、H1N7、H3N3、H4N6、H5N1等多種血清型，其中在豬群中廣泛流行的豬流感病毒主要有古典豬H1N1毒株、類禽H1N1毒株、類人H3N2毒株[6]。本研究對豬流感病毒的分子檢測技術(shù)以及豬流感在我國的流行現(xiàn)狀進行綜述，旨在為開展豬流感研究提供參考。

1豬流感病毒分子檢測技術(shù)研究進展

1.1反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)

反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）是目前發(fā)展最成熟的分子診斷技術(shù)，可以從基因水平檢測SIV的RNA，大大縮短了SI病原的檢出時間，為豬流感的快速診斷提供了更敏感、更快速的方法。該方法具有省時、省力、靈敏度高、特異性強、診斷速度快等優(yōu)點，已在豬流感病毒檢測中得到廣泛應(yīng)用[7]。Lee等利用RT-PCR方法分別在臨床樣本中鑒定出H1、H3、N1、N2亞型豬流感病毒[8]。楊煥良等建立了豬流感病毒H1N1、H1N2、H3N2亞型多重RT-PCR診斷方法，可以在2個反應(yīng)體系中對豬流感HA、NA基因進行亞型鑒定，極大地節(jié)約了人力與時間[9]。特異性試驗檢測多重RT-PCR不能擴增其他豬病毒核酸，核酸最低檢測量達2 ng。

1.2實時熒光定量PCR

實時熒光定量PCR（real-tmie flurescent quantitive polymerase chain reaction）是將熒光基團加入PCR反應(yīng)體系中，利用熒光信號積累對整個PCR進程進行實時監(jiān)測，敏感性遠遠高于普通的RT-PCR。實時PCR/RT-PCR技術(shù)是將PCR、核酸雜交、信號放大相結(jié)合的實時、在線檢測的定量PCR技術(shù)，比常規(guī)PCR更靈敏、特異性更強。目前已被廣泛應(yīng)用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究、藥物療效分析、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。此方法已被用于A型、B型流感病毒檢測，檢測流感病毒的M 基因、HA基因來區(qū)別A型、B型流感病毒，或是用于區(qū)別A型流感病毒的亞型[10-11]。段廷云等建立了實時熒光定量PCR檢測H1N1亞型豬流感病毒，以NP基因的陽性重組質(zhì)粒為熒光定量PCR標準品模板建立標準曲線。對探針濃度、引物濃度、鎂離子濃度、退火溫度進行優(yōu)化，建立最佳熒光定量PCR反應(yīng)體系、擴增程序[12]。熒光定量PCR的建立為早期診斷豬流感病毒、定量分析豬流感病毒感染程度奠定了基礎(chǔ)。張?zhí)璧冗x取豬流感病毒的NP基因序列設(shè)計引物、探針，建立了檢測SIV的TaqMan實時熒光定量PCR方法[13]。張鵬超等建立的豬流感病毒SYBR Green Ⅰ定量RT-PCR 檢測方法對SIV核酸檢測靈敏度達30 TCID[14]。陳艷等建立了H3N2亞型豬流感病毒實時熒光定量PCR快速檢測方法[15]。徐敏等建立了以RNA為反應(yīng)模板的一步法熒光定量RT-PCR診斷方法，該方法操作簡單，可以用RNA作為模板直接檢測，節(jié)省時間，特異性好，靈敏度高[16]。張春明等根據(jù)豬流感病毒（SIV） M 基因的保守序列，設(shè)計并合成1對特異性引物及TaqMan MGB 探針，建立了SIV M 基因?qū)崟r熒光定量PCR 檢測方法，結(jié)果表明，該方法樣品檢測與病毒滴定及病毒分離結(jié)果的符合率均達到100%，特異性強，重復性好[17]。Real-Time PCR技術(shù)能精確檢測樣品中SIV的含量，對SI臨床檢測診斷具有較強的實用價值[18]。

1.3基因芯片

基因芯片技術(shù)指將大量探針分子固定于支持物后，與標記的樣品分子進行雜交，通過檢測雜交信號強度而獲取樣品分子的數(shù)量、序列信息。通過設(shè)計不同的探針陣列，使用特定的分析方法，可將該技術(shù)用于基因表達檢測、突變檢測、多態(tài)性分析、基因文庫作圖、雜交測序、微生物檢測等領(lǐng)域[19]。陳紅軍等根據(jù)流感病毒血凝素、神經(jīng)氨酸酶、亞型基因序列間的差異性，分別設(shè)計H1、H3、H9、N1、N2的特異分型引物，根據(jù)M基因設(shè)計A型流感病毒的通用引物制成基因芯片，并對217 份不同地區(qū)的樣品進行檢測，結(jié)果表明，該芯片可以同時檢測待檢樣品中5種亞型A型流感病毒，并顯示了較高的靈敏度、特異性，靈敏度比PCR 高1個稀釋度，比病毒分離高2個稀釋度[20]。楊林等根據(jù)豬流感病毒的M基因序列設(shè)計了1對特異性引物，通過將單鏈PCR產(chǎn)物與芯片雜交實現(xiàn)對SIV的檢測[21]。高淑霞等制備了檢測H1N1、H3N2、H5N1、H9N2 4種亞型豬流感病毒的基因芯片技術(shù)，與PCR方法相比，該基因芯片技術(shù)顯示了較高的靈敏度[22]。王慧煜等建立了能同時鑒別甲型H1N1及豬流感病毒常見亞型的新型基因芯片檢測方法[23]。

2我國豬流感流行現(xiàn)狀

近年來，我國很多學者分離到不同亞型的SIV[24]。李海燕等對黑龍江省、吉林省、遼寧省等地豬群進行了豬流感血清學、病原學調(diào)查研究，從1 306份豬鼻棉拭子樣品及死亡豬肺、氣管樣品中分離到39株H3N2 亞型豬流感病毒、12株H1亞型豬流感病毒及其他亞型豬流感病毒[25]。辛曉光等進行了黑龍江省豬流感病原學及血清學調(diào)查，1997—2002年共采集到414份豬血清樣品，經(jīng)豬流感血清學檢查出豬流感陽性血清57份，平均陽性率為14%；采集到豬的病毒材料275例，經(jīng)技術(shù)處理后接雞胚，分離出豬流感病毒26株，表明有些豬場污染情況比較嚴重，直接影響豬場的生存及發(fā)展[26]。王隆柏等于2005年8—12月對福建省豬群豬流感病毒感染情況進行調(diào)查，豬流感H1亞型抗體檢測的平均陽性率為530%，豬流感H3亞型抗體檢測的平均陽性率為23.7%，由此可知，福建省豬群不僅存在不同程度的H1、H3亞型SIV感染，而且感染較為普遍[27]?？滴谋氲仍诟拭C省11個市州的豬群中檢出豬流感H3N2抗體陽性118份，平均陽性率為2789%，其中健康豬血清檢出陽性42份，陽性率為2234%；患病豬血清檢出陽性76份，陽性率為32.34%[28]。朱善德等對浙江省寧波市10個縣（市、區(qū)）5個豬場的457份血清進行豬流感H3N2抗體檢測，結(jié)果表明，豬場陽性率為2593%，全市豬群平均陽性率為16.41%；檢測健康豬血清373份，陽性率達11%；檢測發(fā)病豬血清84份，陽性率達4048%[29]。姚敬明等2010年6月至2011年11月在山西省采集了1 018份血樣，用ELISA試劑盒檢測豬流感血清抗體，陽性率為0.98%[30]。禹思宇等2010年6月采用間接ELISA及實時熒光RT-PCR技術(shù)，對湖南省規(guī)?；i場采集的 1 065 份豬血清、16 796份豬棉拭子、360份肺臟樣品進行檢測，結(jié)果顯示，SIV H1N1抗體陽性率達37.84%，H1N1豬流感病毒抗原陽性率為0.12%[31]。由此可知，SIV在我國不同地區(qū)均呈現(xiàn)地方性流行趨勢，豬群普遍受H1亞型、H3亞型SIV感染。

參考文獻：

[1]Shope R E. Swine influenza：Ⅲ. Filtration experiments and etiology[J]. The Journal of Experimental Medicine，1931，54（3）：373-385.

[2]Thacker E，Janke B. Swine influenza virus：zoonotic potential and vaccination stratefies for the control of avian and swine influenza[J]. Journal of Infectious Diseases，2008，197（1）：19-24.

[3]Shinde V，Bridges C B，Uyeki T M，et al. Triple-reassortant swine influenza A （H1） in humans in the United States，2005—2009[J]. The New England Journal of Medicine，2009，360（25）：2616-2625.

[4]Gaydos J C，Hodder R A，Top F H，et al. Swine influenza A at Fort Dix，New Jersey （January-February 1976）. Ⅰ. Case finding and clinical study of cases[J]. The Journal of Infectious Diseases，1977，136（Suppl）

：356-362.

[5]Gregory V，Lim W，Cameron K，et al. Infection of a child in Hong Kong by an influenza A H3N2 virus closely related to viruses circulating in European pigs[J]. The Journal of General Virology，2001，82（6）：1397-1406.

[6]Brown I H. The epidemiology and evolution of influenza viruses in pigs[J]. Veterinary Microbiology，2000，74（1/2）：29-46.

[7]Phipps L P，Essen S C，Brown I H. Genetic subtyping of influenza A viruses using RT-PCR with a single set of primers based on conserved sequences within the HA2 coding region[J]. Journal of Virological Methods，2004，122（1）：119-122.

[8]Lee C S，Kang B K，Lee D H，et al. One-step multiplex RT-PCR for detection and subtyping of swine influenza H1，H3，N1，N2 viruses in clinical samples using a dual priming oligonucleotide （DPO） system[J]. Journal of Virological Methods，2008，151（1）：30-34.

[9]楊煥良，喬傳玲，陳艷，等. 豬流感病毒H1N1、H1N2和H3N2亞型多重RT-PCR診斷方法的建立[J]. 中國預防獸醫(yī)學報，2007，29（9）：714-718.

[10]Choi Y K，Goyal S M，Kang S W，et al. Detection and subtyping of swine influenza H1N1，H1N2 and H3N2 viruses in clinical samples using two multiplex RT-PCR assays[J]. Journal of Virological Methods，2002，102（1/2）：53-59.

[11]Wang R X，Taubenberger J K. Methods for molecular surveillance of influenza[J]. Expert Review of Anti-Infective Therapy，2010，8（5）：517-527.

[12]段廷云，陳紅英，崔保安，等. 實時熒光定量PCR檢測H1N1亞型豬流感病毒[J]. 畜牧獸醫(yī)學報，2008，39（6）：752-756.

[13]張?zhí)瑁枳趲?，岳志芹，? 豬流感病毒實時熒光定量RT-PCR檢測方法的建立[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2012，39（6）：181-184.

[14]張鵬超，師小瀟，哈卓，等. 豬流感病毒SYBR GreenⅠ定量RT-PCR檢測方法的建立及應(yīng)用[J]. 中國預防獸醫(yī)學報，2010，32（10）：768-772.

[15]陳艷，張春明，喬傳玲，等. H3N2亞型豬流感病毒實時熒光定量PCR快速檢測方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)科學，2009，39（10）：894-899.

[16]徐敏，李志強，黃元，等. 豬流感病毒一步法熒光定量RT-PCR診斷方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)科學，2011，41（10）：1021-1025.

[17]張春明，喬傳玲，陳艷，等. 豬流感病毒M基因?qū)崟r熒光定量PCR診斷方法的建立[J]. 中國預防獸醫(yī)學報，2008，30（10）：805-810.

[18]Kowalczyk A，Markowska-Daniel I，Rasmussen T B. Development of a primer-probe energy transfer based real-time PCR for the detection of swine influenza virus[J]. Journal of Virological Methods，2013，187（2）：228-233.

[19]Li J，Chen S，Evans D H. Typing and subtyping influenza virus using DNA microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR[J]. Journal of Clinical Microbiology，2001，39（2）：696-704.

[20]陳紅軍，侯義宏，白華，等. 豬流感病毒分型基因芯片的建立和初步應(yīng)用[J]. 畜牧獸醫(yī)學報，2007，38（7）：708-712.

[21]楊林，馬世春，蘇增華，等. 豬流感病毒基因芯片檢測技術(shù)的研究[J]. 中國獸醫(yī)雜志，2008，44（7）：3-5.

[22]高淑霞，王文志，張偉. 豬流感病毒低密度分型芯片的試驗研究[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報，2011，24（6）：2385-2388.

[23]王慧煜，梅琳，侯義宏，等. H1N1和H3N2亞型流感病毒基因芯片檢測方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)科學，2011，41（12）：1234-1241.

[24]陳君彥，李海燕，申之義，等. H1N1亞型豬流感病毒中國分離株血凝素基因分子演化的研究[J]. 中國預防獸醫(yī)學報，2005，27（1）：13-17.

[25]李海燕，于康震，辛曉光，等. 部分省市豬群豬流感的血清學調(diào)查及豬流感病毒的分離與鑒定[J]. 動物醫(yī)學進展，2003，24（3）：67-72.

[26]辛曉光，霍慶貴，秦運安，等. 黑龍江省豬流感疫病的血清學及病原學調(diào)查[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2002（12）：22-23.

[27]王隆柏，魏宏，陳少鶯，等. 福建省豬流感流行病學調(diào)查與分析[J]. 養(yǎng)豬，2006（5）：47-48.

[28]康文彪，宋建國，趙春玲，等. 甘肅省豬流感（H3N2）抗體的血清學調(diào)查研究[J]. 畜牧獸醫(yī)雜志，2008（1）：14-15，17.

[29]朱善德，鮑偉華，盧黎明，等. 寧波地區(qū)豬流感（H3N2）抗體的血清學調(diào)查研究[J]. 獸醫(yī)導刊，2009（5）：39-40.

[30]姚敬明，樊振華，楊裕，等. 山西豬流感分子流行病學調(diào)研[J]. 養(yǎng)豬，2012（2）：115-116.

[31]禹思宇，易征璇，孟芳，等. 湖南省規(guī)?；i場H1N1豬流感流行病學調(diào)查[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學，2011（5）：126-128.

王丹，呂小紅，付立東，等. 不同收獲期對水稻莖稈抗倒伏性狀的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學，2014，42（9）：61-63.