占今舜，吳力專 ，李麗立，張彬*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙410128；2.揚州大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州225009；3.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所動物生態(tài)營養(yǎng)與健康養(yǎng)殖聯(lián)合實驗室 農(nóng)業(yè)生態(tài)工程重點實驗室，湖南 長沙410125）

金屬硫蛋白（metallothionein，MT）是在1957年研究金屬鎘的生物學(xué)作用時，從馬腎中分離出的一類具有分子量低、高巰基且具有與金屬離子結(jié)合的獨特性能的蛋白質(zhì)。它含有大量的半胱氨酸殘基（18～20個），少量或不含芳香族氨基酸和組氨酸，能被金屬元素誘導(dǎo)和結(jié)合多個金屬原子［1-4］?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，MT能夠通過提高奶牛體內(nèi)的過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽過氧化物（GSH-Px）基因的表達來提高奶牛的抗熱應(yīng)激［5-7］。細胞培養(yǎng)技術(shù)是在活體內(nèi)取出與試驗相關(guān)組織或細胞，在體外模擬體內(nèi)生理環(huán)境，且建立無菌、適溫和一定的營養(yǎng)條件，使細胞生長和生存并維持其結(jié)構(gòu)與功能的一種方法。該方法具有易于提供性狀相似的試驗對象和耗資少，如對于大型經(jīng)濟動物來講比較經(jīng)濟等特點，被廣泛用于醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域。利用細胞培養(yǎng)技術(shù)來研究MT對奶牛淋巴細胞的影響還尚未見報道。因此，本試驗研究在熱應(yīng)激條件下，外源MT對體外培養(yǎng)的奶牛淋巴細胞的影響，目的是從細胞水平研究MT對奶牛的影響，豐富相關(guān)理論的研究，為推廣MT在奶牛業(yè)上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 MT的來源 采用本實驗室2012年7月誘導(dǎo)合成、分離和純化的奶牛肝臟鋅金屬硫蛋白（Zn-MT）［8］。

1.1.2 奶牛淋巴細胞的來源 從湖南省畜牧所購買出生1 d的荷斯坦公奶牛，然后進行屠宰。在無菌條件下取出脾臟放入經(jīng)過高溫滅菌過的PBS（phosphate buffer saline）溶液中。利用無菌的剪刀剪碎脾臟，去掉精膜和脂肪，將其置入胰消化酶中，在恒溫氣浴鍋中37℃，振蕩30 min，將組織倒入細胞網(wǎng)篩，用無菌的注射器芯對其碾壓、過濾，后將濾液輕輕加入裝有牛淋巴分離液的離心管中，1500 r／min，20 min離心，取離心后的第2層乳白色的淋巴細胞層，然后加入4 m L的RPMI 1640進行1500 r／min，15 min洗滌2次，最終得到淋巴細胞，然后用完全培養(yǎng)液進行培養(yǎng)。

1.2 淋巴細胞凋亡的形態(tài)學(xué)觀察

1.2.1 倒置顯微鏡觀察凋亡形態(tài) 將提取出來的奶牛淋巴細胞，用完全培養(yǎng)液將細胞稀釋成5×105個／m L，隨機分為4組，每組細胞培養(yǎng)液中 MT的終濃度分別為0μg／m L（對照組）、70μg／m L（第Ⅰ組）、140μg／m L（第Ⅱ組）、210μg／m L（第Ⅲ組），同時置于細胞培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)20 h，之后同時置于43℃水浴鍋中進行熱應(yīng)激處理1 h，再回細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，收集每組的細胞在倒置顯微鏡下進行形態(tài)觀察。

1.2.2 AO／EB染色觀察 取處理過的細胞，調(diào)整為5×105個／m L，收集細胞，然后在98μL的細胞懸液中加入2μL的AO／EB熒光染色液，用漩渦混合器將其混勻。用移液槍吸取該液體，將其加在載玻片上，蓋上蓋玻片后在熒光顯微鏡下進行觀察。

1.3 淋巴細胞內(nèi)抗氧化指標的檢測

檢測方法和步驟按照試劑盒上的說明書進行，試劑盒購于南京建成生物工程研究所。

1.4 細胞凋亡相關(guān)基因的檢測

1.4.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank登錄序列，以β-actin m RNA作為內(nèi)參，Primer Premier 5.0設(shè)計引物，引物設(shè)計結(jié)果見表1。引物的合成由上海生物工程股份有限公司完成。

1.4.2 cDNA的合成 根據(jù)所購買的Revert AidTMFirst Strand cDNA Systhesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的說明書進行操作。

1.4.3 RT－PCR反應(yīng)液和反應(yīng)條件 按表2配制PCR反應(yīng)液（操作請在冰上進行）。

表1 引物設(shè)計Table 1 Primer design

1.4.4 數(shù)據(jù)的處理 采用Excel軟件進行初步處理，然后用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均值±標準差表示，用LSD方法進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 淋巴細胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

圖1 淋巴細胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果Fig.1 Effects of morphological observation on lymphocyte1：對照組Control group；2：試驗Ⅰ組Experimental groupⅠ；3：試驗Ⅱ組Experimental groupⅡ；4：試驗Ⅲ組Experimental groupⅢ.下同The same below.

圖2 AO／EB染色觀察結(jié)果Fig.2 Effects of staining on AO／EB

在倒置顯微鏡下觀察（圖1），正常的淋巴細胞懸浮生長并邊緣整齊，細胞呈圓形或橢圓形。而本試驗結(jié)果為奶牛淋巴細胞在43℃熱應(yīng)激下，各組奶牛淋巴細胞出現(xiàn)細胞質(zhì)的明亮度下降，細胞膜不完整，界限模糊并增強顆粒感，以及細胞腫脹、碎片。說明熱應(yīng)激能夠?qū)е履膛Ａ馨图毎蛲龊退劳觥φ战M中細胞腫脹數(shù)量和碎片均多于試驗Ⅰ～Ⅲ組，試驗Ⅰ～Ⅲ組細胞腫脹數(shù)量和細胞碎片逐漸增多，且第Ⅰ組最少。說明在細胞培養(yǎng)液中添加低濃度MT可以有效緩解熱應(yīng)激對奶牛淋巴細胞的損傷。但隨MT濃度的增加，其緩解作用效果下降。

2.2 AO／EB染色觀察結(jié)果

淋巴細胞經(jīng)過AO／EB染色，在熒光顯微鏡下觀察，正常的淋巴細胞會被AO染成綠色，而且熒光染料在細胞內(nèi)分布均勻；如果經(jīng)過染色的細胞出現(xiàn)橙色且?guī)в芯G色，說明淋巴細胞處在凋亡初期；如果細胞出現(xiàn)橙紅色且有凋亡小體的生成，則說明細胞處在凋亡末期。如果細胞壞死，則會被EB染料染成紅色。從圖2中可以發(fā)現(xiàn)，對照組的淋巴細胞大多處在細胞凋亡末期并且大量細胞壞死，而試驗Ⅰ組中出現(xiàn)的綠色且?guī)в谐壬募毎?，說明細胞處在凋亡初期；試驗Ⅱ組中出現(xiàn)較多的橙色細胞，試驗Ⅲ組出現(xiàn)部分橙紅色和紅色細胞，說明細胞從凋亡逐漸轉(zhuǎn)化成壞死。隨著MT添加濃度的增加，破裂淋巴細胞出現(xiàn)增加趨勢，橙色的數(shù)量也在增加，而且出現(xiàn)橙紅色和紅色。說明熱應(yīng)激下，添加低濃度MT能夠改善淋巴細胞的抗熱應(yīng)激作用，較高濃度 MT對奶牛淋巴細胞的凋亡無抑制作用或抑制作用很小。

2.3 淋巴細胞內(nèi)抗氧化指標的檢測結(jié)果

從表3中可以看出，試驗Ⅰ組和Ⅱ組的奶牛淋巴細胞內(nèi)的CAT活性顯著高于對照組和第Ⅲ組（P＜0.01），但試驗Ⅰ、Ⅱ組之間差異不顯著。細胞內(nèi)的SOD和GSH-Px的活性，均為試驗Ⅰ組顯著高于其他3組（P＜0.01），對照組的活性最低，且試驗Ⅰ～Ⅲ組活性呈逐漸下降的趨勢。奶牛淋巴細胞內(nèi)的丙二醛（MDA）含量，對照組顯著高于其他3組（P＜0.01），試驗Ⅰ～Ⅲ組之間差異不顯著（P＞0.05），但有隨著MT含量的提高MDA含量依次增高的趨勢。綜合上述結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)，MT能夠通過提高CAT活性、SOD的活性、GSH-Px的活性和降低MDA含量來改善奶牛淋巴細胞的抗氧化性能，進而提高奶牛淋巴細胞的抗熱應(yīng)激能力，且MT提高奶牛淋巴細胞抗氧化能力與其濃度存在密切的聯(lián)系，添加低濃度的效果優(yōu)于高濃度。

表3 淋巴細胞內(nèi)抗氧化指標的檢測Table 3 Results of the antioxidant indexs of dairy cow lymphocyte

2.4 基因Bax、Bcl-2、p50的RT－PCR檢測

從表4可以看到，試驗Ⅰ～Ⅲ組的Bax基因相對表達量分別是對照組的0.16，0.34和0.24倍，且均顯著低于對照組（P＜0.01），其中試驗Ⅱ組最高，而試驗Ⅰ組最低。說明MT降低了Bax基因相對表達量。對于Bcl-2基因，試驗Ⅰ～Ⅲ組表達量顯著高于對照組（P＜0.01），分別為對照組的2.57，1.78和2.13倍，試驗Ⅰ組顯著高于試驗Ⅱ、Ⅲ組（P＜0.01），試驗Ⅲ組顯著高于試驗Ⅱ組（P＜0.01）。說明MT能提高Bcl-2基因的表達量，且低濃度的MT效果最好，添加MT濃度的增加，其表達量呈下降趨勢。p50基因的表達量為試驗Ⅰ～Ⅲ組分別是對照組的0.74，0.65和0.47倍，且各組均顯著低于對照組（P＜0.01），其中，試驗Ⅰ和Ⅱ組顯著高于試驗Ⅲ組（P＜0.01），試驗Ⅰ和Ⅱ組之間無顯著差異（P＞0.01），說明添加MT組的淋巴細胞的p 50基因表達量下降。

3 討論與結(jié)論

3.1 MT對熱應(yīng)激下淋巴細胞形態(tài)的影響

熱應(yīng)激是機體在高溫環(huán)境下對熱環(huán)境所做出的非特異性生理反應(yīng)的總和。熱應(yīng)激能夠引起乳鼠的心肌細胞、奶牛的外周淋巴細胞和乳腺上皮細胞的凋亡［9-11］。當(dāng)細胞發(fā)生凋亡時，在電鏡下觀察，可以發(fā)現(xiàn)細胞質(zhì)的密度增加，核質(zhì)濃縮、核膜核仁破碎，核膜形成小泡，但是細胞膜的結(jié)構(gòu)保持完整。細胞壞死是細胞受到外界因子的刺激引起細胞無序變化的死亡，表現(xiàn)為細胞腫大、胞膜破裂和細胞內(nèi)容物外溢等。劉慶華等［12］研究熱脅迫下淋巴細胞的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)胞質(zhì)濃縮，細胞體積縮小，染色體凝集成團，而細胞膜未改變。在本試驗中，熱應(yīng)激導(dǎo)致淋巴細胞體積變小，細胞質(zhì)的明亮度下降，界限模糊并增強顆粒感，出現(xiàn)很多細胞的碎片；淋巴細胞還出現(xiàn)細胞膜不完整、細胞腫脹并溶解的現(xiàn)象，與其研究相一致。王艷鳳［13］研究氟對體外培養(yǎng)牛脾臟淋巴細胞凋亡的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常的細胞被AO染成綠色，細胞凋亡初期呈橙色，凋亡末期呈橙紅色，而壞死細胞則被EB染成紅色。從本試驗結(jié)果來看，說明熱應(yīng)激能夠?qū)е麦w外培養(yǎng)奶牛淋巴細胞的凋亡和壞死。MT是一種分子量低、含有高巰基的蛋白質(zhì)，具有抗應(yīng)激的功能。劉穎等［14］研究結(jié)果表明，附子多糖能夠保護心肌細胞免受損傷的主要原因是其促進MT的合成對抗氧化應(yīng)激，進而抑制心肌細胞凋亡。在本試驗結(jié)果中也可以看出，外源MT能夠延緩熱應(yīng)激下奶牛淋巴細胞的凋亡，但低濃度的MT效果優(yōu)于高濃度。研究表明，體外細胞受到應(yīng)激時，自身能夠產(chǎn)生MT來提高體外細胞的存活率［15］。那么，淋巴細胞在熱應(yīng)激情況下，細胞自身應(yīng)該也會產(chǎn)生一定量的MT來保護淋巴細胞。體外再增加低劑量的MT會協(xié)同細胞自身的MT來保護細胞免受熱應(yīng)激的損傷。試驗中所用的是Zn-MT，據(jù)報道，氧化型物質(zhì)多，會使MT的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致Zn2＋容易從MT中脫離［16］。Zn-MT濃度越高，從其脫離的Zn2＋越多，而金屬Zn2＋對細胞有一定的毒性。因此，高濃度的Zn-MT會使淋巴細胞凋亡和壞死增加。

3.2 MT對熱應(yīng)激下淋巴細胞內(nèi)抗氧化功能的影響

機體在新陳代謝過程中會產(chǎn)生自由基，自由基具有強氧化性，對機體的組織和細胞具有損傷作用。正常情況下，機體內(nèi)自由基的產(chǎn)生和清除保持平衡，對機體不會造成傷害，且一定量的自由基對機體有好處。但是，過多的自由基大量積累會因強烈的氧化作用使細胞中的不飽和脂肪酸產(chǎn)生MDA，而MDA能夠?qū)е录毎怏w，最終促使細胞死亡［17］。機體在受到熱應(yīng)激情況下，會導(dǎo)致活性氧自由基的產(chǎn)生增多，活性氧自由基易與細胞內(nèi)的大分子進行結(jié)合并發(fā)生反應(yīng)，促進細胞或組織的脂質(zhì)過氧化作用［18］。MT中含有30%的半胱氨酸，且所有的半胱氨酸殘基均以還原態(tài)出現(xiàn)，容易發(fā)生親和反應(yīng)。與GSH-Px等相比，自由基更容易攻擊MT。因此，MT是一種高效抗氧化劑。MT可提高動物機體的抗氧化物酶活性，從而提高機體的抗氧化能力。李麗立等［19］給仔豬補充外源性Zn-MT，仔豬肝臟SOD、GSH-Px活性得到顯著提高。張彬等［7］和李麗立等［8］研究注射外源Zn-MT對奶牛血清的抗氧化性能的影響，結(jié)果MT提高了奶牛的SOD、GSH-Px、CAT和T-AOC的活性，且較高劑量的MT改善抗氧化能力的效果優(yōu)于低劑量，效果表現(xiàn)出一定的時間效應(yīng)和劑量效應(yīng)。本試驗研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在熱應(yīng)激情況下，外源MT能夠提高奶牛淋巴細胞的SOD、GSH-Px、CAT活性，降低細胞內(nèi)的MDA含量，從而改善奶牛淋巴細胞的抗氧化性能，提高奶牛淋巴細胞的抗熱應(yīng)激能力，且MT提高奶牛淋巴細胞抗氧化能力與其濃度存在密切的聯(lián)系，添加低濃度的效果優(yōu)于高濃度。Zn是構(gòu)成CuZn-SOD的組成成分，而CuZn-SOD具有清除氧自由基的作用。另外，Zn是GSH-Px的激活劑，當(dāng)Zn缺乏時，細胞內(nèi)的GSH-Px數(shù)量會減少，GSH-Px發(fā)揮抗氧化作用減弱。在熱應(yīng)激情況下，細胞內(nèi)產(chǎn)生的自由基會使Zn-MT置換出Zn，從而提高SOD、GSH-Px的活性，增強自由基的清除能力，減少MDA的產(chǎn)生。然而，有報道稱，當(dāng)內(nèi)環(huán)境處于高Zn狀態(tài)時，能夠抑制SOD活性，從而使機體清除氧自由基的功能降低，過氧化脂質(zhì)堆積。另外，細胞內(nèi)Zn含量超過生理水平時，就會誘導(dǎo)細胞產(chǎn)生自由基并呈現(xiàn)毒副作用［20］。因此，隨著添加Zn-MT的濃度增加，Zn2＋的含量增加，使奶牛淋巴細胞內(nèi)處于高Zn狀態(tài)，導(dǎo)致抗氧化酶類的活性有所下降，進而促使Zn-MT抗氧化功能下降。

3.3 MT對熱應(yīng)激下淋巴細胞內(nèi)Bax、Bcl-2基因表達的影響

動物機體在熱應(yīng)激下，機體發(fā)生紊亂，其自由基增加以及脂質(zhì)過氧化，增加活性氧的積累，而活性氧對Bax基因的表達具有促進作用。Bax是促凋亡蛋白，Bcl-2是抑制凋亡蛋白，它們之間通過形成異二聚體來維持細胞凋亡的動態(tài)平衡。另外，Bcl-2還通過阻止細胞膜脂質(zhì)過氧化，抑制線粒體細胞色素C的釋放，抑制下游的Caspase活化，進而阻止細胞凋亡［21］。如果自由基清除不及時，導(dǎo)致Bcl-2表達和Bax表達不平衡，會使細胞產(chǎn)生凋亡。謝遠杰等［22］發(fā)現(xiàn)，熱應(yīng)激后第3天大鼠生精細胞的Bcl-2 m RNA表達明顯下降，而第7天Bax m RNA表達明顯增加，表明熱應(yīng)激早期導(dǎo)致生精細胞凋亡主要是因為Bcl-2表達減少造成的，后期則由于Bax表達的不斷增強，進一步促進生精細胞的凋亡。汪君民和趙階祥［23］利用免疫組化方法檢測熱應(yīng)激組的大鼠外周血淋巴細胞的Bcl-2和Bax基因表達情況，結(jié)果與其一致。賈丹等［24］試驗結(jié)果為熱應(yīng)激下，豬小腸細胞的Bax基因表達升高，Bcl-2基因表達下降，導(dǎo)致小腸絨毛上皮細胞的凋亡增加。蔡亞非等［10］研究熱應(yīng)激對奶牛外周血淋巴細胞Bax-a基因的表達，結(jié)果熱應(yīng)激下Bax-a基因的表達量最高，且與淋巴細胞凋亡率呈平行關(guān)系。另外，宋學(xué)立等［25］通過研究Bcl-2基因轉(zhuǎn)染對熱應(yīng)激心肌細胞保護的作用所得結(jié)果認為，在熱應(yīng)激下，Bcl-2基因通過保護心肌細胞線粒體H＋-ATPase合成活力，阻抑Caspase 3活化來抑制心肌細胞的凋亡。MT含有大量的巰基基團，還原狀態(tài)的巰基具有親核性，自由基容易與其結(jié)合，降低體內(nèi)的氧自由基，進而降低Bax基因的表達。孫忠東等［26］研究發(fā)現(xiàn)，用ZnSO4誘導(dǎo)產(chǎn)生的MT能夠促使大鼠心肌Bcl-2蛋白的表達增加，Bax蛋白表達下降。羅佳捷等［27］研究Zn-MT對熱應(yīng)激下奶牛淋巴細胞的凋亡基因的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bax基因表達量較對照組降低，Bcl-2基因表達增強。另外，Alessandrra等［28］通過試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)MT對Bcl-2蛋白表達有促進作用，認為MT在調(diào)控多形性腺瘤細胞凋亡中發(fā)揮重要作用。從本試驗看，試驗組的Bax基因表達顯著低于對照組（P＜0.01），Bcl-2基因表達量顯著高于對照組（P＜0.01），Bax／Bcl-2下降，抑制了淋巴細胞的凋亡。說明在一定程度上添加適量外源MT抑制了淋巴細胞的凋亡。Caspase蛋白的級聯(lián)活動是細胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，由Bcl-2蛋白家族和凋亡抑制蛋白家族（IAPs）聯(lián)合調(diào)控。Zn2＋能夠與IAPs形成鋅指結(jié)構(gòu)，激發(fā)其活性，進而抑制細胞凋亡。另外，核酸內(nèi)切酶中含有相同的Zn2＋、Ca2＋競爭位點，當(dāng)Zn2＋濃度達到一定程度Zn2＋能夠和Ca2＋競爭與核酸內(nèi)切酶結(jié)合，抑制核酸酶的活性，進而抑制細胞的凋亡。但是，當(dāng)Zn2＋濃度過高時，會導(dǎo)致細胞的DNA降解，促使細胞凋亡進而死亡［29-30］。因此，在本試驗中，添加低濃度的Zn-MT，游離出的Zn2＋也發(fā)揮了抑制細胞凋亡的作用，但是隨著添加劑量的增加，Zn2＋對淋巴細胞產(chǎn)生了一定的毒性，進而導(dǎo)致抑制細胞凋亡的作用呈下降趨勢。在熱應(yīng)激下，機體很容易合成各種熱休克蛋白。研究表明，熱休克蛋白家族的Hsp70和Hsp40在協(xié)同作用下抑制Bax的活化，阻斷其促進細胞凋亡；Hsp60能與Bax形成復(fù)合物以及增強Bcl-2的作用，進而抑制細胞的凋亡；Bcl-2／Hsp 90β復(fù)合物能夠抑制細胞色素C和Caspase3的釋放［31-33］。羅佳捷等［27］發(fā)現(xiàn)MT對熱應(yīng)激下，奶牛血液淋巴細胞的Hsp 70基因的表達具有提高作用。因此，認為在熱應(yīng)激下，MT能通過調(diào)控?zé)嵝菘说鞍缀图毎蛲鱿嚓P(guān)基因的表達來抑制細胞凋亡。但是，MT是否是同時調(diào)控?zé)嵝菘说鞍缀图毎蛲鱿嚓P(guān)基因的表達還是調(diào)控?zé)嵝菘说鞍缀图毎蛲鱿嚓P(guān)基因的表達之間存在先后順序，需要進一步深入的研究。

3.4 MT對熱應(yīng)激下淋巴細胞內(nèi)p50基因表達的影響

在哺乳動物中，NF-κB主要由5個相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子（p65、p 50、p 52、Rel B和c-Rel）之間形成同源或異源二聚體組成的，研究最多的是p50／p65二聚體。據(jù)報道，活化的NF-κB對多種與細胞凋亡相關(guān)的基因具有轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，對細胞凋亡具有抑制和促進的作用［34］。NF-κB抑制細胞凋亡是一種多個信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的過程，通過轉(zhuǎn)導(dǎo)激活I(lǐng)EX-IL、Bcl-2家族等提高機體的抗細胞凋亡的作用［35］。夏鈺弘等［36］研究結(jié)果表明，NF-κB可能通過抑制Caspase-3的活性進而抑制肝癌細胞凋亡。然而，也有報道稱，NF-κB對細胞的凋亡有促進的作用。研究發(fā)現(xiàn)，黑色素瘤細胞在紫外線誘導(dǎo)下會因NF-κB的活化而導(dǎo)致細胞凋亡；在H2O2的誘導(dǎo)下，活化的NF-κB能使T細胞發(fā)生細胞凋亡［37-38］。另外還發(fā)現(xiàn)，活化的NF-κB能夠通過抑制抗凋亡基因的表達進而促進細胞凋亡［39］。之前研究結(jié)果表明，添加Zn-MT能夠提高淋巴細胞Bcl-2基因的表達量，降低Bax基因的表達量，抑制細胞的凋亡。而研究Zn-MT對淋巴細胞p 50基因表達的影響，發(fā)現(xiàn)在熱應(yīng)激下，與對照組相比，添加Zn-MT組的奶牛淋巴細胞內(nèi)的p50基因表達量下降。出現(xiàn)這種現(xiàn)象可能原因如下：在正常情況下，NF-κB由于與其抑制蛋白（IκB）相結(jié)合而無活性。當(dāng)淋巴細胞受到熱應(yīng)激時，促使IκB磷酸化，導(dǎo)致NF-κB激活。研究已發(fā)現(xiàn)，NF-κB對細胞凋亡有雙向作用，激活的NF-κB具有促進細胞凋亡的作用，因此，本試驗的結(jié)果說明，MT可能通過抑制p50基因的表達，抑制IκB磷酸化，降低NF-κB的活性，從而降低NF-κB抑制抗凋亡基因的表達，抑制淋巴細胞的凋亡。

在熱應(yīng)激下，添加外源MT能夠提高奶牛淋巴細胞的存活率，降低淋巴細胞的凋亡率；提高淋巴細胞內(nèi)的CAT活性、SOD活性和GSH-Px活性，降低MDA含量，促進淋巴細胞的抗氧化性能；提高淋巴細胞內(nèi)的Bcl-2基因的表達量，降低Bax基因和p 50基因的表達量，從而抑制淋巴細胞的凋亡。從本試驗的結(jié)果上看，添加終濃度為70μg／m L的MT抑制熱應(yīng)激下體外培養(yǎng)奶牛淋巴細胞凋亡的效果最好。