袁 媛， 徐德平， 吳盼盼

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

鹿血為鹿科動(dòng)物梅花鹿（Cervus nippon）和馬鹿（Cervus elaphus）的血液，是傳統(tǒng)名貴中藥[1-2]。近年來，運(yùn)用現(xiàn)代醫(yī)學(xué)手段，進(jìn)行臨床研究和動(dòng)物比較試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)鹿血具有抗衰老、抗疲勞、調(diào)節(jié)免疫、補(bǔ)血、美容、補(bǔ)腎益精、抗輻射等作用[3-5]，是一種集預(yù)防、醫(yī)療、保健作用于一體的滋補(bǔ)品[6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，鹿血的化學(xué)成分非常復(fù)雜[10-14]，國(guó)內(nèi)外對(duì)鹿血具體化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)研究還未見報(bào)道，特別是鹿血甾體化合物，僅有范玉林等在鹿茸中發(fā)現(xiàn)過此類物質(zhì)[15]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道都是用標(biāo)準(zhǔn)品，利用HPLC對(duì)鹿血活性成分進(jìn)行定性、定量研究，對(duì)鹿血中未知的激素并不能測(cè)定[16]。目前，僅發(fā)現(xiàn)其含常見幾種甾體化合物，如睪丸酮（testosterone）、雌二醇（estradiol）[17-18]，對(duì)鹿血甾體化合物的分離、結(jié)構(gòu)鑒定還未見報(bào)道。

鑒于以上原因，用乙醇提取，多種色譜柱分離，采用TLC、1HNMR，和13CNMR等方法對(duì)鹿血化學(xué)成分進(jìn)行研究，以探明鹿血化學(xué)成分與功能活性之間的關(guān)系，為鹿產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹿血，安徽五星集團(tuán)提供；GF254硅膠板，山東煙臺(tái)芝罘化工廠產(chǎn)品；MCI柱，日本三菱化學(xué)公司產(chǎn)品；ODS柱、ODS-A柱、ODS-B柱，日本東曹株式會(huì)社產(chǎn)品；無水乙醇、丙酮、硫酸、茴香醛、冰醋酸、甲醇、正丁醇均為分析純，上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE52CS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠制造；ZF-90型暗箱式紫外透射儀，上海顧村電光儀器廠制造；CQ-005型萃取罐，常州市特威電氣自動(dòng)化系統(tǒng)有限公司制造；R－1002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申順生物科技有限公司制造；SYB06-100型恒流泵，BS-100A自動(dòng)部分收集器，上海滬西分析儀器廠有限公司制造；HH-4型數(shù)顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市榮華儀器廠制造；SHB－3型循環(huán)水多用真空泵，鄭州長(zhǎng)城科貿(mào)有限公司經(jīng)銷；Brucker AVance500型核磁共振儀，Brucker公司制造。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鹿血中有效成分的提取 取10 L鹿血原液置于 100 L 的萃取罐中，按料液比 m（g）∶V（mL）=1∶5加入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇，常溫?cái)嚢杼崛?次，每次2 d左右，過濾取濾液。殘?jiān)谙嗤瑮l件下重復(fù)提取2次，合并3次濾液，真空減壓蒸餾回收乙醇，即得鹿血醇提物，濃縮干燥，置于冰箱備用。

1.3.2 鹿血醇提物的粗分 取部分鹿血醇提物加少量去離子水，溶解后上樣MCI柱（5 cm×150 cm），調(diào)節(jié)柱體積流量為10 mL/min，依次用去離子水，體積分?jǐn)?shù) 20%、30%、40%、50%、75%、80%乙醇溶液梯度洗脫，用250 mL的錐形瓶收集洗脫液，TLC法跟蹤檢測(cè)，將薄層板上顯示相同Rf值的洗脫液合并濃縮。將體積分?jǐn)?shù)80%乙醇洗脫液濃縮至適量，再上樣ODS柱（5 cm×100 cm），調(diào)節(jié)體積流量為 8 mL/min，用乙醇溶液梯度洗脫，250 mL的錐形瓶收集洗脫液，經(jīng) TLC 法檢測(cè)，根據(jù) Rf值粗分為 A、B、C、D、E、F 6部分。將這6部分全部放入冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)所做抗疲勞實(shí)驗(yàn)，得出C部分具有明顯的抗疲勞作用，而A、B、D、E、F這5部分的抗疲勞活性不太明顯，所以就單獨(dú)對(duì)C部分進(jìn)行進(jìn)一步分離。

1.3.3 C部分的分離 將前面得到的C部分再次上樣 MCI柱（5 cm×150 cm），調(diào)節(jié)體積流量為10 mL/min，依次用去離子水、乙醇溶液梯度洗脫，TLC法跟蹤檢測(cè)，大致得到3部分，分別標(biāo)記為C1、C2、C3。

1.3.4 C1、C2、C33部分分離純化 將濃縮后的C1、C2、C33部分分別上樣 ODS-B柱、ODS-A 柱（5 cm×100 cm），調(diào)節(jié)體積流量為8 mL/min，依次用去離子水、乙醇溶液梯度洗脫，用自動(dòng)部分收集器收集，15 mL/管，經(jīng)TLC跟蹤監(jiān)測(cè)，將Rf值相同的組分合并減壓濃縮，反復(fù)上樣ODS-B柱、ODS-A柱（5 cm×100 cm），由TLC法鑒定純度，最后分離得到純化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。

1.3.5 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)鑒定 以二甲基亞砜（DMSO）為溶劑，四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標(biāo)物，將上述3個(gè)化合物經(jīng)氫譜 （1HNMR）和碳譜（13CNMR）等光譜數(shù)據(jù)分析，并結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)確定這3種物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與討論

2.1 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的純度

分離得到的化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，經(jīng)點(diǎn)樣在展開劑V（正丁醇）∶V（乙酸）∶V（水）=5∶4∶1 中展開，在暗箱式紫外透射儀和顯色后的薄層板上顯示均為單一斑點(diǎn)，從左到右依次為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 3種化合物（見圖1），說明純度達(dá)到核磁鑒定分析要求。

圖1 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的薄層色譜圖Fig.1 Thin-layer chromatogram of compounds Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ

2.2 顯色反應(yīng)

將化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ分別進(jìn)行醋酐-濃硫酸和氯仿-濃硫酸的定性試驗(yàn)[15]，結(jié)果見表1。

表1 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的顯色反應(yīng)Table 1 Color reaction of compoundsⅠ，Ⅱ，Ⅲ

結(jié)果表明，化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均發(fā)生甾體反應(yīng)，反應(yīng)呈陽性，初步判定3種物質(zhì)為甾體化合物。

2.3NMR分析

2.3.1 化合物Ⅰ 白色無定形粉末，可溶解于含水甲醇、乙醇中。

從化合物Ⅰ的1H-NMR圖譜可見，δ7.87有1個(gè)單峰 H信號(hào)， 這個(gè) H應(yīng)為活潑 H，δ5.31、5.20、5.06各有1個(gè)單峰H信號(hào)，表明這3個(gè)H是雙鍵上H，δ1.73、1.64、1.55、1.23、0.99 各有 1 個(gè)單峰甲基信號(hào)，即含5個(gè)甲基。

13C-NMR（125 MHz）中可見到 34 個(gè)碳信號(hào)（見表2），δ212.5處有1個(gè)碳信號(hào)，說明有酮基存在；δ172.4、170.1 有 2 個(gè)碳信號(hào)，δ136.4～123.9 共有 7 個(gè)碳信號(hào)，應(yīng)為雙鍵上的碳，推測(cè)170.1也是雙鍵上的碳，可見有4個(gè)雙鍵，δ75.3、64.4為2個(gè)連氧碳。高場(chǎng)區(qū)有 12 個(gè) CH2，5 個(gè) CH3，3 個(gè) CH。

從δ212.5處的酮基、δ170.1雙鍵上的碳信號(hào)及顯色反應(yīng)來看，化合物Ⅰ應(yīng)為雄甾烯酮類化合物，根據(jù)此類化合物的特征，δ212.5為C3位酮基，δ170.1為 C5，δ172.4為連接在 C17位上的羧基，δ75.3為C17信號(hào)。δ64.4為一連氧信號(hào)，表明母環(huán)上有羥取代基，綜合分析應(yīng)為C2碳信號(hào)，即C2上有羥基取代，由于β效應(yīng)導(dǎo)致酮基向低場(chǎng)移動(dòng)。從碳譜中可以見到共有4個(gè)雙鍵，除C4、C5雙鍵，母環(huán)上C14、C15之間也有一個(gè)雙鍵。δ13.9的甲基為C18，δ22.4的甲基為C19。至此可以得出化合物為雄性激素類似物質(zhì)。

雄性激素類物質(zhì)C17位上常連有側(cè)鏈，該化合物也一樣，C17連有羧基，從高場(chǎng)區(qū)碳信號(hào)來看δ45.4有一個(gè)CH信號(hào)，表明側(cè)鏈有分枝，除母環(huán)外，側(cè)鏈上有6個(gè)CH2，3個(gè)CH3，2個(gè)雙鍵，從雙鍵碳信號(hào)性質(zhì)來看，有3個(gè)季碳。從這些數(shù)據(jù)并參照相關(guān)文獻(xiàn)初步認(rèn)定化合物Ⅰ為△4，14-雄烯-2醇-28，30環(huán)戊二烯庚酸酯-3酮。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖2（a）所示。

表2 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的13CNMR中的數(shù)據(jù)（δ）Table 2 13CNMR chemical shifts of compound Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ

圖2 化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Structure of compoundⅠ，Ⅱ，Ⅲ

2.3.2 化合物Ⅱ 白色無定形粉末，可溶解于含水甲醇、乙醇中。

從化合物Ⅱ的1H-NMR圖譜可見，δ7.91有1個(gè)單峰 H信號(hào)，這個(gè)H應(yīng)為活潑 H，δ5.31、5.20、5.06各有1個(gè)單峰H信號(hào)，表明這3個(gè)H是雙鍵上H。δ1.93、1.64、1.50、0.89 各有 1 個(gè)單峰甲基信號(hào)，即含4個(gè)甲基。

13C-NMR（125 MHz）中可見到 34個(gè)碳信號(hào)（見表2），δ212.5處有1個(gè)碳信號(hào)，說明有酮基存在，δ172.4、170.1 有 2 個(gè)碳信號(hào)，δ136.4～123.9 共有 7 個(gè)碳信號(hào)，應(yīng)為雙鍵上的碳，δ75.3、64.4、63.0 為 3 個(gè)連氧碳。 高場(chǎng)區(qū)有12個(gè)CH2，4個(gè)CH3，3個(gè)CH。

從以上數(shù)據(jù)來看，化合物Ⅱ與化合物Ⅰ結(jié)構(gòu)相似，不同的是化合物Ⅱ多了一個(gè)δ63.0的連氧碳信號(hào)，少了δ22.4的甲基，表明C19上有羥基取代。從這些數(shù)據(jù)并參照相關(guān)文獻(xiàn)初步認(rèn)定化合物Ⅱ?yàn)椤?，14-雄烯-2，19 醇-28，30 環(huán)戊二烯庚酸酯-3 酮。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖2（b）所示。

2.3.3 化合物Ⅲ 白色無定形粉末，可溶解于含水甲醇、乙醇中。

從化合物Ⅲ的1H-NMR圖譜可見，δ7.92有1個(gè)單峰H信號(hào)，這個(gè)H應(yīng)為活潑H，δ5.25有1個(gè)單峰H信號(hào)，5.17、5.07各有2個(gè)單峰H信號(hào)，表明這5個(gè)H是雙鍵上H。13C-NMR（125 MHz）中可見到31個(gè)碳信號(hào)（見表2），δ212.5處有1個(gè)碳信號(hào)，說明有酮基存在；δ170.1 有 1 個(gè)碳信號(hào)，δ136.4～117.3 共有7個(gè)碳信號(hào)，δ170.1碳信號(hào)應(yīng)為雙鍵上的碳，表明與化合物Ⅰ具有相似的烯酮結(jié)構(gòu)。與化合物Ⅰ相比不一樣的是少一個(gè)δ172.4的羧基，多一個(gè)δ61.2連氧碳CH2信號(hào)，表明C17位上連接的是氧而不是羧基。從135DEPT譜中可以看到，δ136.4～117.3共有5個(gè)CH碳信號(hào)，說明有5個(gè)雙鍵H未被取代，這與H譜信號(hào)彈相一致，高場(chǎng)區(qū)碳信號(hào)δ45.5有一個(gè)CH信號(hào)，表明側(cè)鏈有分枝，除母環(huán)外，側(cè)鏈上有6個(gè)CH2，3個(gè)CH3，從以上數(shù)據(jù)來看化合物Ⅲ與化合物Ⅰ雖有不同但母環(huán)結(jié)構(gòu)是相似的。經(jīng)這些數(shù)據(jù)分析并參照相關(guān)文獻(xiàn)可知，化合物Ⅲ為△4，14-雄烯-2醇-27，29環(huán)戊二烯己醚-3酮。其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如圖2（c）所示。

3 結(jié)語

利用乙醇對(duì)鹿血的有效成分進(jìn)行提取，經(jīng)MCI柱層析粗分，再經(jīng)ODS反相色譜柱反復(fù)分離，得到3種化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，通過1HNMR、13CNMR等方法鑒定出Ⅰ為△4，14-雄烯-2醇-28，30環(huán)戊二烯庚酸酯-3 酮；Ⅱ?yàn)椤?，14-雄烯-2，19 醇-28，30 環(huán)戊二烯庚酸酯-3酮； Ⅲ為△4，14-雄烯-2醇-27，29環(huán)戊二烯己醚-3酮。結(jié)果顯示，3個(gè)化合物均為雄性激素衍生物，這3種雄性激素衍生物在鹿血中存在屬首次報(bào)道。采用TLC、1HNMR和13CNMR等方法對(duì)鹿血化學(xué)成分進(jìn)行研究，以探明鹿血化學(xué)成分與功能活性之間的關(guān)系，為鹿產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

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