劉登全，崔朝宇，蔣軍喜*，龍 瓏

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，江西 南昌 330045;2.江西省豐城市農(nóng)業(yè)局，江西 豐城 331100)

柑橘黃龍病(citrus huanglongbing，HLB)，也稱柑橘青果病(greening)，是世界柑橘生產(chǎn)上最具毀滅性的病害［1］。自1919年Reinking首次報道我國華南地區(qū)發(fā)生柑橘黃龍病以來，已有亞洲、非洲、大洋洲、南美洲和北美洲在內(nèi)的40多個國家報道黃龍病的發(fā)生［2-3］。黃龍病的病原為原核生物界α-變形桿菌綱(α-prteobacterim)韌皮部桿菌屬(Liberibacter)細(xì)菌，共有3種韌皮部桿菌屬細(xì)菌與黃龍病有關(guān)，即亞洲種(Candidatus liberibacter asiaticus，CLas)、非洲種(Candidatus liberibacter africanus，CLaf)和美洲種(Canditatus liberibacter americanus，CLam)［4-7］。CLas分布于我國及其他許多產(chǎn)橘國，CLaf和 Clam 則各限于非洲和巴西。柑橘黃龍病菌僅限于韌皮部內(nèi)寄生，難以人工培養(yǎng)［8］，主要依靠柑橘木虱(Diaphorina citri)或非洲木虱(Trioza eryetreae)傳播，并能通過嫁接和菟絲子傳播［9］。對黃龍病的防治，目前主要依靠挖除病樹、控制介體柑橘木虱的發(fā)生和使用無病苗木等措施［10］。

長期以來，人們對黃龍病進(jìn)行了大量研究，特別是在2004年和2005年黃龍病分別被傳入巴西和美國之后，對黃龍病的研究更趨活躍，研究程度也明顯加深［11］，其中，最能反映該病研究水平的是有關(guān)柑橘與黃龍病菌互作的分子機理研究，其研究結(jié)果對于從分子水平上解析黃龍病的發(fā)生本質(zhì)產(chǎn)生了重要作用［12-13］。然而，若從解析黃龍病的抗性機理而言，上述研究結(jié)果尚存在一定的局限性，主要原因是在目前的柑橘與黃龍病菌互作體系中，對寄主柑橘的抗性水平還不是很了解。通過明確柑橘對黃龍病的抗性水平，開展其特定的親和性和非親和性互作的分子機理研究，將有望實現(xiàn)解析黃龍病抗性分子機理、進(jìn)而挖掘抗性基因和對柑橘品種進(jìn)行抗性改良的目標(biāo)。本文擬在前人研究的基礎(chǔ)上，選擇椪柑、琯溪蜜柚、晚熟溫州蜜柑3個品種，在嚴(yán)格控制條件下，就其對柑橘黃龍病的抗性進(jìn)行室內(nèi)鑒定，以期篩選出高感和高抗黃龍病的品種，為開展柑橘黃龍病親和性互作和非親和性互作的分子機理研究奠定良好基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試柑橘品種

供試柑橘品種為椪柑(Citrus reticulata Blanco cv.ponkan)、琯溪蜜柚(Citrus grandis(L.)Osbeck cv.guanximiyou)和晚熟溫州蜜柑(Citrus unshiu Marc.)，均為2年生無病苗木，由江西雙金園藝場柑橘試驗站提供，苗木運回后盆栽，置于25℃、12L∶12D光暗交替的人工氣候室中培養(yǎng)，常規(guī)管理，盆栽2個月后供嫁接試驗。

1.2 柑橘黃龍病毒源樹獲得

本研究通過實地調(diào)查，在江西省大余縣池江鎮(zhèn)曾家果園發(fā)現(xiàn)了數(shù)株疑似柑橘黃龍病的病樹，從中選取2株病樹(臍橙1號，臍橙2號)，取其葉片帶回室內(nèi)進(jìn)行黃龍病菌、柑橘衰退病毒和柑橘植原體的PCR檢測，以期獲得只含有黃龍病菌，而不含衰退病毒和植原體的柑橘黃龍病菌單一毒源。

1.2.1 對毒源樹進(jìn)行柑橘黃龍病菌檢測 用植物基因組DNA提取試劑盒提取2份疑似病樣的總DNA，以此DNA為模板，用黃龍病菌特異性引物A2/J5［14］(A2:5'-TATAAAGGTTGACCTTTCGAGTTT-3';J5:5'-AC AAAAGCAGAAATAGCACGAACAA-3')對樣品進(jìn)行PCR擴增，陰、陽性對照分別為健康柑橘植株和已知柑橘黃龍病葉片。PCR反應(yīng)體系25 μL:包括4 μL DNA模板，12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix，引物各1 μL(10 μmol/L)，6.5 μL去離子水，混勻后進(jìn)行PCR擴增。反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性4 min;94℃變性1 min，60℃退火1 min，72℃延伸1 min，35個循環(huán);72℃補平10 min。PCR結(jié)束后進(jìn)行10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.2 對毒源樹進(jìn)行柑橘植原體檢測 以上述總DNA為模板，采用PCR方法檢測2個樣品中是否含有柑橘植原體，其特異性引物為植原體通用引物 R16mF2/R16mR1［15］(R16mF2:5'-CATGCAAGTCGAACGGA-3';R16mR1:5'-CTTAACCCCAATCATCGAC-3')，陰性對照為健康柑橘植株，陽性對照質(zhì)粒由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)鄧曉玲教授惠贈。PCR反應(yīng)體系25 μL:包括2 μL DNA模板，12.5 μL 2×Taq PCR MasterMix，引物各 0.5 μL(10 μmol/L)，9.5 μL 去離子水，混勻后進(jìn)行 PCR 擴增。反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min;95℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán);72℃補平10 min。PCR結(jié)束后進(jìn)行10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳。

1.2.3 對毒源樹進(jìn)行柑橘衰退病毒檢測 衰退病毒檢測引物為rP672/fP672(rP672:5'-ATG-GACGACGARACAAAG-3';fP672:5'-TCAACGTGTGTTRAATTTCC-3';R=A/G)，參照周彥［16］及 Gen-Bank中基因序列自行設(shè)計。先用植物總RNA快速抽提試劑盒對以上2個樣品進(jìn)行總RNA的提取。使用Promega反轉(zhuǎn)錄試劑盒對提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄體系20 μL:MgCl24 μL，10×反轉(zhuǎn)錄緩沖液 2 μL，dNTP 混合物 2 μL，RNasin@抑制劑 0.5 μL，AMV 反轉(zhuǎn)錄酶 1 μL，fP672(下游引物)1 μL，模板RNA 3 μL，去離子水6.5 μL，充分混合后42℃水浴30 min合成cDNA第一鏈。以此cDNA第一鏈為模板立即進(jìn)行 PCR 反應(yīng)。PCR 反應(yīng)體系25 μL:模板4 μL，引物各0.5 μL，2×Taq MasterMix 12.5 μL，去離子水7.5 μL;充分混合，反應(yīng)條件為:94℃預(yù)變性4 min;94℃變性35 s，58℃退火35 s，72℃延伸70 s，35個循環(huán);72℃補平10 min。柑橘衰退病病葉陽性對照由贛南師范學(xué)院易龍教授提供。PCR結(jié)束后進(jìn)行10 g/L的瓊脂糖凝膠電泳。

1.3 用柑橘黃龍病毒源嫁接各柑橘品種

用取自臍橙1號病樹芽作為接穗，嫁接到各供試柑橘品種上，每個品種嫁接3株(3次重復(fù))，并設(shè)健康苗木作對照。試驗苗木置于人工氣候室內(nèi)生長。待嫁接芽長出后逐日觀察各供試植株的顯癥情況，詳細(xì)記載各植株在嫁接后3、4、6、8個月后的癥狀表現(xiàn)并作相應(yīng)的黃龍病菌PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 柑橘黃龍病毒源樹獲得

2.1.1 毒源樹的柑橘黃龍病菌檢測 采用黃龍病菌特異性引物A2/J5，對2株可疑病株葉片DNA進(jìn)行PCR擴增，結(jié)果從中均擴增出一條大小約為700 bp的特異性條帶，符合預(yù)期大小(圖1)，可見兩株病樹均含有黃龍病菌。

2.1.2 毒源樹的柑橘植原體檢測 使用柑橘植原體特異性引物R16mF2/R16mR1，對上述2株可疑病株葉片DNA進(jìn)行PCR擴增，結(jié)果從中均未擴增到特異性條帶(圖2)，可見兩株病株均不含有柑橘植原體。

圖1 毒源樹柑橘黃龍病菌PCR檢測電泳圖Fig.1 Electrophoresis of PCR product from Candidatus Liberibacter asisticus in HLB-infected citrus tree

圖2 毒源樹柑橘植原體PCR檢測電泳圖Fig.2 Electrophoresis of PCR product from phytoplasma in HLB-infected citrus tree

2.1.3 毒源樹的柑橘衰退病毒檢測 通過對上述兩株可疑病株葉片提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后采用特異引物rP672/fP672進(jìn)行PCR擴增，結(jié)果均未擴增到特異性條帶(圖3)，可見兩株病樹均不含有柑橘衰退病毒。

2.2 用柑橘黃龍病毒源嫁接各柑橘品種

不同柑橘品種嫁接黃龍病菌毒源后，其癥狀表現(xiàn)和體內(nèi)帶菌情況見圖4。椪柑:嫁接3個月后，新長出的葉片開始顯示出斑駁黃化癥狀，經(jīng)過病原菌PCR檢測能夠檢測到黃龍病菌的存在;嫁接4個月后，整株葉片均表現(xiàn)出明顯的黃化癥狀，葉片細(xì)小，有落葉現(xiàn)象;嫁接6個月后，落葉現(xiàn)象明顯且有的葉片顏色變?yōu)楹诤稚仓晟先~片數(shù)量稀少，很少見到有新葉長出;嫁接8個月后，樹葉全部脫落直至死亡。

琯溪蜜柚:嫁接3個月后，顏色沒有任何變化，仍保持正常綠色，經(jīng)病原檢測沒有檢測到黃龍病菌的存在;嫁接4個月后，僅僅是幼葉葉尖顏色略顯褪綠，對新葉進(jìn)行病原檢測能夠檢測到黃龍病菌的存在;嫁接6個月后，葉片略顯斑駁癥狀;嫁接8個月后，葉片仍略顯斑駁癥狀，植株依然能夠抽梢生長。

晚熟溫州蜜柑從嫁接開始至8個月后依然沒有檢測到黃龍病菌的存在，葉片顏色沒有任何明顯的變化，和健康的對照組均為正常的綠色。

圖3 毒源樹柑橘衰退病毒PCR檢測電泳圖Fig.3 Electrophoresis of PCR product from Citrus tristeza virus in HLB-infected citrus tree

圖4 不同柑橘品種接種黃龍病菌后的癥狀表現(xiàn)Fig.4 Symptom appearance of different citrus cultivars after inoculating CLas

3 討論

在柑橘黃龍病抗性鑒定及其他相關(guān)研究中，目前使用最多的接種方法是嫁接法［17］，即將帶有黃龍病菌的毒源樹枝條或芽嫁接到供試的健康柑橘品種上，定期觀察受體植株的癥狀表現(xiàn)。在此鑒定過程中，毒源樹的準(zhǔn)備至關(guān)重要。本文在根據(jù)田間癥狀初步選定柑橘黃龍病毒源樹的基礎(chǔ)上，對該樹進(jìn)行了黃龍病菌的PCR檢測，結(jié)果表明該樹確實攜帶黃龍病菌。鑒于柑橘植原體和柑橘衰退病毒導(dǎo)致的癥狀與黃龍病菌導(dǎo)致的癥狀大同小異［18］，因此，為了排除毒源樹中只含有黃龍病菌，而不含有植原體和衰退病毒，筆者對該毒源樹進(jìn)一步做了植原體和衰退病毒的檢測，結(jié)果均排除了毒源樹中植原體和衰退病毒的存在。可以看出，本文的毒源純一，以此毒源進(jìn)行的黃龍病品種抗性鑒定結(jié)果可信可靠。

本文選擇的椪柑、琯溪蜜柚和晚熟溫州蜜柑3個柑橘品種是根據(jù)他人的研究結(jié)果挑選的。椪柑被普遍認(rèn)為屬于黃龍病的高感品種，在品種抗性嫁接試驗和病原檢測實驗中也反映出其高感黃龍病的特性［19］。本研究則在保證毒源純一和發(fā)病條件一致的前提下，結(jié)合采用嫁接和PCR檢測技術(shù)，開展不同柑橘品種對黃龍病抗性的比較研究，結(jié)果進(jìn)一步表明了椪柑屬于高感黃龍病品種。因此，椪柑無疑可以作為高感品種開展柑橘與黃龍病菌的親和性互作研究?，g溪蜜柚和晚熟溫州蜜柑在本實驗中對柑橘黃龍病菌表現(xiàn)較強的抗性，特別是晚熟溫州蜜柑的抗性表現(xiàn)更強，然而，這兩個品種在有些報道中卻表現(xiàn)為耐?。?9-20］。為此，本項目組還將對這兩個品種做進(jìn)一步的抗性鑒定試驗，以使篩選到的高抗品種更具說服力。

［1］鄒敏，周長勇.柑桔黃龍病病原和檢測方法研究進(jìn)展［J］.植物保護(hù)，2005，31(3):10-14.

［2］陳傳武，白先進(jìn)，趙小龍，等.柑橘黃龍病nested-PCR檢測技術(shù)在柑橘苗木生產(chǎn)中的應(yīng)用［J］.植物保護(hù)，2009，35(3):91-93.

［3］Bove J M.Hunglongbing:a destructive，newly-emerging，century-old disease of citrus［J］.Journal of Plant Pathology，2006，88(1):7-37.

［4］廖惠紅，李楊瑞，彭宏祥，等.利用基因組步行方法克隆柑橘黃龍病病原亞洲種序列［J］.園藝學(xué)報，2009，36(4):493-500.

［5］Jagoueix S，Bove J M，Garnier M.The phloem-limited bacterium of greening disease of citrus is a member of the alpha subdivision of the proteobacteria［J］.International Journal of Systematic Bacteriology，1994，44(3):379-386.

［6］Garnier M，Jagoueix-Eveillard S，Cronje P R，et al.Genomic characterization of a liberibacter present in an ornamental rutaceous tree，Calodendrum capense，in the Western Cape Province of South Africa.Proposal of‘Candidatus Liberibacter africanus subsp.Capensis’［J］.International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology，2000，50(6):2119-2125.

［7］Teixeira D C，Danet J L，Eveillard S，et al.Citrus huanglongbing in S?o Paulo State，Brazil:PCR detection of the‘Candidatus’liberibacter species associated with the disease［J］.Molecular and Cellular Probes，2005，19(3):173-179.

［8］孟祥春，鐘云，劉巖，等.柑桔黃龍病PCR快速檢測技術(shù)的建立與應(yīng)用［J］.西北植物學(xué)報，2007，27(7):1461-1463.

［9］莫元妹.柑橘黃龍病的傳播途徑及鑒定方法［J］.現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，16(5):64-65.

［10］鹿連明，胡秀榮，張利平，等，常規(guī)和巢氏PCR對柑橘黃龍病菌的檢測靈敏度比較［J］.熱帶作物學(xué)報.2010，31(8):1280-1287.

［11］Duan Y P，Zhou L J，Hall D G，et al.Complete genome sequence of citrus Huanglongbing Bacterium，‘Candidatus Liberibacter asiaticus ’Obtained Through Metagenomics［J］.Molecular Plant-Microbe Interactions，2009，22(8):1011-1020.

［12］Kim J S，Sagaram U S，Burns J K，et al.Response of sweet orange(Citrus sinensis)to‘Candidatus Liberibacter asiaticus’Infection:Microscopy and Microarray Analyses［J］.Phytopathology，2009，99(1):50-57.

［13］Albrecht U，Bowman K D.Gene expression in Citru sinensis(L.)osbeck following infection with the bacterial pathogen Candidatus Liberibacter asiaticus causing Huanglongbing in Florida［J］.Plant Science，2008，175(3):291-306.

［14］丁芳，王國平，易千軍，等.不同引物對檢測柑橘黃龍病菌靈敏度比較［J］.植物保護(hù)學(xué)報，2007，34(4):364-368.

［15］乾義柯，張祥林，馬春春，等.葡萄金黃化植原體16S rDNA檢測與RFLP分析［J］.新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，47(5):915-920.

［16］周彥，周常勇，王雪峰，等.柑桔衰退病毒分離株分子特征初步研究［J］.植物病理學(xué)報，2005，35(6):147-150.

［17］羅志達(dá)，葉自行，許建楷，等.柑桔黃龍病的田間診斷方法［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，3:91-93.

［18］邵權(quán)，蔡紅，陳海如，等.柑橘小葉病植原體的分子檢測及鑒定［J］.云南大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2008(S1):69-72.

［19］蔣自珍，袁亦文，孟幼青，等.不同柑橘品種對柑橘黃龍病抗性試驗［J］.中國植保導(dǎo)刊，2006，26(9):23-24.

［20］孟幼青，董海濤，嚴(yán)鐵，等.浙江不同品種柑橘黃龍病發(fā)生初報［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，5:568-569.